固相載體材料的選擇

1、固相載體材料的選擇 用于固定化抗體的固相載體材料的挑選是影響免疫萃取柱性能的重要條件之一，普通而言，用于固定化抗體的載體材料應(yīng)當(dāng)具有以下特點(diǎn)：具有化學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性；表面簡(jiǎn)單銜接-nh2、-coon、-oh等活性基團(tuán)，即簡(jiǎn)單被活化；力學(xué)性能強(qiáng)；顆粒勻稱；有較大的孔徑(普通在5400nm);親水性強(qiáng)，不簡(jiǎn)單產(chǎn)生非特異性吸附；具有較強(qiáng)的耐壓能力，可與hplc等儀器在線聯(lián)用。表8-2列舉了一些常用的商品化固相載體材料。 表8-2 商品化固相載體材料 這些常用固相載體所用的化學(xué)材料主要是：、聚合物(如：聚甲基丙烯酸酯衍生物，乙烯或親水性有機(jī)聚合物等）、硅土、玻璃珠等。在離線免疫萃取柱中以瓊脂糖應(yīng)用較多

2、，它具有化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)、非特異性吸附少等優(yōu)點(diǎn)，而且已有商品化的活化瓊脂糖出售，比如頻繁的cnbr活化sepharose等。 瓊脂糖的缺點(diǎn)是機(jī)械穩(wěn)定性差，在高壓下簡(jiǎn)單被壓縮變形，因此，以這種固相載體裝填的免疫親和萃取柱不能與hplc等儀器在線聯(lián)用。而且這種免疫親和萃取柱的加樣方式普通是依賴重力或在較低的流速下加入樣品，萃取時(shí)光較長(zhǎng)。瓊脂糖載體的另一個(gè)缺點(diǎn)是生物穩(wěn)定性差，在儲(chǔ)存中簡(jiǎn)單發(fā)生生物降解。 在線免疫萃取中常選用耐壓性能較強(qiáng)的硅土、多孔玻璃等作為固相載體材料，其中以硅土最為常用。硅土的孔徑普通在5400nm，具有很強(qiáng)的親水性，可以和許多種功能基團(tuán)鍵合而被活化。常用來活化固相載體材料的化合物如表

3、8-3所示。但是，在用法硅土作為固相載體材料時(shí)必需注重用法的ph值范圍，由于硅土在堿性條件下不穩(wěn)定。 表8-3 常用來活化固相載體材料的化合物 knopp等利用溶膠一凝膠將抗體包埋，制備了可萃取富集pahs的免疫親和萃取柱，溶膠一凝膠具有很強(qiáng)的化學(xué)及機(jī)械穩(wěn)定性，可以和hplc等高壓儀器聯(lián)用；因?yàn)槠渚哂休^大的比表面積和網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，可以允許小分子化合物自由通過，而蛋白大分子則被保留在網(wǎng)格中不易流失。溶膠一凝膠制作過程容易，制備條件溫柔，有利于在抗體的固定化過程中保持抗體的活性。溶膠-凝膠在內(nèi)部為抗體提供了親水性環(huán)境，外部則可以防止細(xì)菌等微生物的侵入，有助于提高固定化抗體的存儲(chǔ)壽命。因此，溶膠-凝膠

4、技術(shù)是一個(gè)有前途的免疫親和萃取柱固相載體材料。 整體柱色譜(monolith chromatography)是近年來進(jìn)展起來的一種迅速色譜分別技術(shù)。與傳統(tǒng)的填充柱色譜相比，整體柱色譜柱壓小、分別速度快，這得益于其很高的傳質(zhì)效率。8-4所示，整體柱色譜填料上發(fā)生的傳質(zhì)過程是以對(duì)流為主，而傳統(tǒng)柱色譜填充材料上的傳質(zhì)過程以蔓延為主，因此，整體柱色譜具有更高的傳質(zhì)效率。整體柱色譜填料包括有機(jī)整體柱填料、硅膠整體柱填料、瓊脂糖整體柱填料、晶膠(cryogels)等晶膠又稱超大孔延續(xù)床，由瑞典隆德高校mattiasson等發(fā)明，晶膠是單體或聚合物前體在適度冷凍的溶液中形成的溶膠。這種制備條件下，溶膠形成互

5、相聯(lián)系的大孔(或超大孔)，允許納米甚至微米粒徑溶質(zhì)的幾乎不受妨礙的蔓延。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使晶膠具有良好的通透性、化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械穩(wěn)定性。晶膠既可以制備整體柱，也可以用于制備分別膜材料。 在整體柱色譜填料上固定化抗體后就制成了免疫親和整體柱色譜，因?yàn)槟繕?biāo)化合物到抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的傳質(zhì)過程大大加快，因此可以顯著提高免疫親和萃取效率。例如，hage等利用自制的免疫整體柱色譜裝置，在3ml·min-1的流速下，僅用100ms的時(shí)光就幾乎對(duì)目標(biāo)化合物實(shí)現(xiàn)徹低萃取。一種常用來制備親和整體柱色譜填料的物質(zhì)是縮水甘油異丁烯酸酯(gma)和乙二醇二異丁烯酸酯(edma)的聚合物。這種聚合物材料上的環(huán)氧基

6、團(tuán)可以很簡(jiǎn)單地被轉(zhuǎn)化為二醇，因此具有很強(qiáng)的親水性，不簡(jiǎn)單對(duì)蛋白或其他化合物發(fā)生非特異性吸附。環(huán)氧或二醇基團(tuán)也簡(jiǎn)單通過多種方式與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，從而可用于抗體蛋白在聚合物上的固定。上述利用環(huán)氧基團(tuán)偶聯(lián)抗體的辦法優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行，但缺點(diǎn)是環(huán)氧基團(tuán)簡(jiǎn)單水解，因此，對(duì)抗體的偶聯(lián)效率不高。改進(jìn)的辦法包括將環(huán)氧鍵氧化為醛基，然后采納希夫堿法與抗體偶聯(lián)，或者用(cdi)或二琥珀酰亞胺碳酸酯(dsc)將環(huán)氧鍵活化。 因?yàn)檎w柱色譜柱壓小，可以實(shí)現(xiàn)較高的流速，因此可以在較短時(shí)光內(nèi)處理更多體積的樣品，同時(shí)，因?yàn)閭髻|(zhì)效率高，用法少量洗脫劑在短時(shí)光內(nèi)就可以將親和吸附劑土捕捉的目標(biāo)化合物洗脫，所以免疫整體柱色譜將可能在環(huán)境樣品中痕量化合物的免疫親和萃取與富集中發(fā)揮重要