幾種蛋白質(zhì)測(cè)定方法的比較

1、002115J.S hanx i A gric.Univ.學(xué)報(bào)收稿日期:2006201215修回日期:2006203212作者簡(jiǎn)介:李寧(19822,男(漢,山西孝義人,碩士研究生,主要從事植物生理學(xué)方面的研究。通訊作者:王玉國(guó)教授,碩士生導(dǎo)師。Tel :0354*;E 2mail :tgwygn 1261com文章編號(hào):167128151(2006022*幾種蛋白質(zhì)測(cè)定方法的比較李寧(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山西太谷030801摘要:蛋白質(zhì)與生命的起源、存在和進(jìn)化都密切相關(guān)。蛋白質(zhì)測(cè)定涉及到生產(chǎn)和科研的眾多領(lǐng)域。本試驗(yàn)用凱氏定氮法、等電點(diǎn)沉淀法、紫外吸收法、雙縮脲法、考馬斯亮藍(lán)染色法分別對(duì)牛奶、

2、雞蛋、酸奶、豆?jié){、杏仁露進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。依此分析比較各種測(cè)氮方法,總結(jié)出各方法的特點(diǎn)及適用條件。凱氏定氮法是適用范圍最廣測(cè)定結(jié)果最準(zhǔn)確的方法,比色法則是操作最為簡(jiǎn)捷快速的方法,適用于結(jié)果要求不很精確的實(shí)驗(yàn)。關(guān)鍵詞:凱氏定氮;等電點(diǎn)沉淀;紫外吸收;雙縮脲;考馬斯亮藍(lán)染色;蛋白質(zhì);測(cè)定中圖分類號(hào):Q503文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:AThe Comparison on V arious Methods for Determing Different Proteins LI Ning(College of A g riculture ,S hanx i A g ricultural Universit y ,

3、Tai gu S hanx i 030801,China Abstract :The life origin ,the existence and the evolution all makes closer connection with the proteins 1The protein deter 2mination has relation to the production and the scientific research 1This experiment tests the concentrion of proteins of the milk ,the egg ,the y

4、ogurt ,the soybean milk ,and the almond dew by the methods of Kjeldahl ,i 1e 1UV spectrophotomet 2ric method ,Isoelectric focusing ,Biuret Reaction ,Coom assie brilliant blue 1According to the analysis of this experiment ,we can compare each method and summarize the traits and the suitable condition

5、s of various methods 1The method of Kjel 2dahl is the most accurate method 1The method of photometer is the most simple method ,and is suitable for the experiment required less precision 1K ey w ords :Kjeldahl ;Isoelectric focusing ;UV spectrophoto metric ;Biuret ;Coomassie brilliant blue ;Protein ;

6、Determining蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分。食物中的蛋白質(zhì)是人體中氮的唯一來(lái)源。具有糖類和脂肪不可替代的作用1。蛋白質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、酶、激素、病毒、免疫、物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)、遺傳等密切相關(guān),其分離與定性、定量分析是生物化學(xué)和其它生物學(xué)科、食品檢驗(yàn)、臨床檢驗(yàn)、診斷疾病、生物藥物分離提純和質(zhì)量檢驗(yàn)中最重要的工作。目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有多種,如凱氏定蛋法2、等電點(diǎn)沉淀法、紫外吸收法、雙縮脲法、考馬斯亮藍(lán)染色法3等幾種方法,但就方法的準(zhǔn)確性和精密度以及應(yīng)用程度而言,國(guó)際經(jīng)典測(cè)定方法凱氏定氮法為首選,該法也是相關(guān)專業(yè)人員必須掌握的經(jīng)典測(cè)試方法之一?，F(xiàn)在盡管有很多先進(jìn)的自動(dòng)或半自動(dòng)凱氏定

7、氮儀,但這些儀器不僅價(jià)格昂貴,且需專門試劑,目前尚難普及4。本實(shí)驗(yàn)分別用以上五種方法對(duì)牛奶、雞蛋、酸奶、豆?jié){、杏仁露進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定,通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程和結(jié)果的分析來(lái)總結(jié)這幾種方法的適用范圍及實(shí)用性。通過(guò)分析表明,針對(duì)不同的待測(cè)樣品以及對(duì)測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的要求不同,我們可以采用不同的方法來(lái)測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量。1材料與方法111材料儀器消毒牛奶,雞蛋,酸奶,豆?jié){,杏仁露,012mol L 21p H417醋酸-醋酸鈉緩沖液,乙醇-乙醚等體積混合液,濃H 2SO 4,40%氫氧化鈉,30%過(guò)氧化氫,2%硼酸溶液,01050mol L 21標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液,硫酸鉀-硫酸銅接觸劑,混合指示劑,標(biāo)準(zhǔn)蛋白

8、溶液,雙縮脲試劑,考馬斯亮藍(lán)G -250試劑,離心機(jī),布氏漏斗,抽濾泵,凱氏定氮儀,紫外分光光度計(jì),可見(jiàn)光分光光度計(jì)。112方法11211利用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量將待測(cè)樣品加入凱氏燒瓶中,加入硫酸鉀-硫酸銅接觸劑、濃硫酸和30%過(guò)氧化氫,放入消化爐消化至溶液澄清。然后取消化好的樣品在凱氏定氮儀上蒸餾定氮,滴定,記錄。測(cè)定樣品含氮量。每個(gè)樣品做三次重復(fù),取平均值。11212利用等電點(diǎn)沉淀法測(cè)定蛋白質(zhì)含量取待測(cè)樣品3000r min 21離心去脂肪后加醋酸-醋酸鈉緩沖液,產(chǎn)生大量絮狀物后再次離心,得蛋白粗品。蒸餾水洗沉淀三次,離心棄上清。轉(zhuǎn)移沉淀至布氏漏斗抽濾,抽干后的制品用乙醇-乙醚等體積混

9、合液洗滌二次,再用無(wú)水乙醚洗二次,抽干。將沉淀放在表面皿上風(fēng)干,得蛋白制品。稱量、記錄。每個(gè)樣品做三次重復(fù),取平均值。11213利用紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量取待測(cè)樣品制成蛋白濃度大約在011110mg mL 21的蛋白質(zhì)溶液,用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行比色,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品含氮量。1121311標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取7支試管,編號(hào)后按表1依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液和氫氧化鈉溶液。表1紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶劑配加表T able1Prepare solutions of UV spectrophoto metric for the standard curve管號(hào)The number of tub

10、e以0管為空白,在280nm下測(cè)定各管中液體的吸光度值,以各管標(biāo)準(zhǔn)蛋白毫克數(shù)為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)得A280值為縱坐標(biāo),做標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。1121312樣品測(cè)定取適量待測(cè)液用011molL21NaO H稀釋10倍后裝入石英比色皿中,測(cè)A280,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得蛋白質(zhì)含量(mgmL21。每個(gè)樣品重復(fù)三次,取平均值。11214利用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量取待測(cè)樣品制成蛋白濃度大約在110mgmL21的蛋白質(zhì)溶液,加雙縮脲試劑染色30min,用可見(jiàn)光分光光度計(jì)進(jìn)行比色,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品蛋白質(zhì)含量。1121411標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支試管,編號(hào)后按表2依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液、蒸餾水和雙縮脲試劑。表2雙縮脲法測(cè)定蛋白

11、質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶劑配加表T able2Prepare solutions of Binret for the standard curve管號(hào)The number of tube以0管為空白,在540nm下測(cè)定各管中液體的吸光度值,以各管標(biāo)準(zhǔn)蛋白毫克數(shù)為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)得A540值為縱坐標(biāo),做標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。1121412樣品測(cè)定取適量樣品,測(cè)定方法與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線5號(hào)管過(guò)程相同,僅用被測(cè)樣品代替標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,根據(jù)被測(cè)樣品的A540值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查其對(duì)應(yīng)的蛋白毫克數(shù),即為所測(cè)蛋白溶液的含量(mgmL21。每個(gè)樣品重復(fù)三次,取平均值。11215利用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量取待測(cè)樣品加入考馬斯亮藍(lán)

12、G-250試劑放置5min后,用可見(jiàn)光分光光度計(jì)比色,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品蛋白質(zhì)含量。1121511標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支試管,編號(hào)后按表3依次加入各試劑。表3考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶劑配加表T able3Prepare solutions of coomassie brilliant blue for the standard curve管號(hào)The number of tube以0管為空白,在595nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定并記錄A595。以各管對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)、A595為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1121512樣品測(cè)定取適量樣品,加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑并搖勻,放置

13、5min后,在595nm波長(zhǎng)下比色記錄A595。根據(jù)所測(cè)A595從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白質(zhì)含量。每個(gè)樣品重復(fù)三次,取平均值。3312006李寧等:幾種蛋白質(zhì)測(cè)定方法的比較2結(jié)果與分析211測(cè)定結(jié)果樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。212測(cè)定結(jié)果分析21211凱氏定氮法凱氏定氮法可測(cè)出全部5種樣品的蛋白含量,測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確,只是實(shí)驗(yàn)所需儀器多為特制的玻璃儀器,易于破損,特別是蒸餾與吸收裝置復(fù)雜,不便于操作,實(shí)驗(yàn)過(guò)程所需時(shí)間較長(zhǎng),操作復(fù)雜。需在通風(fēng)櫥中進(jìn)行消化,實(shí)驗(yàn)過(guò)程會(huì)產(chǎn)生毒氣,并且樣品與濃H2SO4共熱,有一定危險(xiǎn)。表4樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果T able4The concentrion of prote

14、in in the sample牛奶Milk豆?jié){Soybean milk酸奶Y ogurt雞蛋Egg杏仁露Almond dew21212等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法可測(cè)出牛奶、豆?jié){、酸奶的蛋白含量,實(shí)驗(yàn)操作方法比較簡(jiǎn)單。但單獨(dú)利用此方法來(lái)分離生化產(chǎn)品效果并不太理想,因?yàn)榧词乖诘入婞c(diǎn),有些兩性物質(zhì)仍有一定的溶解度,并不是所有的蛋白質(zhì)都在等電點(diǎn)時(shí)都能沉淀下來(lái),特別是同一類兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近時(shí)。21213紫外吸收法紫外吸收法無(wú)法測(cè)出牛奶、酸奶、杏仁露的蛋白含量,測(cè)出的豆?jié){和雞蛋的蛋白含量也與實(shí)際值相差較大,不具實(shí)際使用價(jià)值。此方法實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單,只要一臺(tái)紫外分光光度計(jì),不需要其它試劑就可進(jìn)行實(shí)驗(yàn),適

15、用于測(cè)試無(wú)色樣品,對(duì)于有色樣品,需進(jìn)行預(yù)處理,排除顏色干擾后才適用于此方法。21214雙縮脲法雙縮脲法適用于被測(cè)的5種樣品,實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便迅速,但其缺點(diǎn)是靈敏度較低,蛋白質(zhì)量須在120mgmL21時(shí)測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)。因此實(shí)驗(yàn)前要估測(cè)被測(cè)樣品的蛋白含量,把樣品稀釋至蛋白濃度為120mgmL21。21215考馬斯亮藍(lán)染色法考馬斯亮藍(lán)染色法可以測(cè)出被測(cè)的全部5種樣品,此方法快速、靈敏,但只有微量蛋白的測(cè)定時(shí)結(jié)果才準(zhǔn)確,因此在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將樣品稀釋至蛋白濃度為0111mgmL21。而且實(shí)驗(yàn)必須在1h內(nèi)完成,不然測(cè)試結(jié)果不準(zhǔn)確。3結(jié)論凱氏定氮法、雙縮脲法和考馬斯亮藍(lán)染色法三種方法都可以測(cè)出被測(cè)的全部5種樣品,其中凱氏定氮法是目前分析有機(jī)化合物含氮量常用的方法,是一種蛋白質(zhì)測(cè)定的經(jīng)典方法,適用樣品廣泛,測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確。而雙縮脲法和考馬斯亮藍(lán)染色法則測(cè)試過(guò)程簡(jiǎn)單、迅速,在可以準(zhǔn)確配取標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液而準(zhǔn)確性要求不高的測(cè)試中可以根據(jù)含氮量的不同選擇這兩種方法。等電點(diǎn)沉淀法多用于牛奶中酪蛋白的提取、測(cè)定。在實(shí)際生產(chǎn)中可與有機(jī)溶劑沉淀法、鹽析法并用,以提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。紫外吸收法對(duì)有色被測(cè)樣品是不適用的,在測(cè)無(wú)色樣品時(shí),由于其操作簡(jiǎn)便、迅速,不