用原子力顯微鏡表征DNA純化效果的實(shí)驗(yàn)研究

1、用原子力顯微鏡表征DNA純化效果的實(shí)驗(yàn)研究         08-12-20 14:01:00     編輯：studa20     作者：熊潔，陳寶安，巴龍，高峰，高沖，丁家華，孫耘玉，程堅(jiān)，王駿，趙剛，杜鵑，陸祖宏 摘要目的：運(yùn)用原子力顯微鏡(AFM)表征3種DNA純化試劑盒對(duì)DNA的純化效果。方法：PCR擴(kuò)增K562/A02細(xì)胞mdr1基因DNA,分別以3種不同的DNA純化試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化后，按終濃度為10 ngl-

2、1固定在用1 ngl-1 L型多聚賴氨酸預(yù)先處理過(guò)的新剝離的云母片上，用AFM獲取DNA掃描圖像，分析評(píng)價(jià)3種DNA試劑盒對(duì)DNA的純化效果。結(jié)果:用AFM成功表征3種純化試劑盒純化后DNA片段，獲得了清晰的DNA圖像。對(duì)3種DNA純化試劑盒的純化效果作出評(píng)價(jià)，建議其中的兩種DNA純化試劑盒的DNA純化產(chǎn)物可用于AFM的DNA 分析。結(jié)論：用AFM表征DNA時(shí)對(duì)DNA的純度要求較高。通過(guò)對(duì)3種DNA純化試劑盒純化效果的比較，為AFM觀測(cè)DNA樣本的純化方法提供了較好的方案。關(guān)鍵詞原子力顯微鏡;表征;脫氧核糖核酸;純化Abstract：Objective  To identificat

3、e purification effect of three kinds of DNA purification kits by atomic force microscopy(AFM).Methods  Cultivateion and PCR technique was used to amplify K562/A02 cells with DNA of mdr1gene. The amplified products were purified by three kinds of DNA purification kits， a final concentration of 1

4、0 ngl -1 DNA samples were placed on a freshly cleaved mica treated by 1ngl -1 Lpolylysine.AFM was used for the imaging of the three pieces of DNA samples.Results  Through AFM image analyzing, the purification effect of three kinds of DNA purification kits was evaluated, two kits can be used to

5、purify DNA samples for AFM imaging. Conclusion   The higher the purify of DNA sample used, the better the AFM image got. Two better purification schemes have been achieved for DNA imaging using AFM through comparing three kinds of DNA purification kits.Key words：atomic force microscope ; i

6、dentification；deoxyribonucleic acid; purification  原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）是具有原子級(jí)分辨率的新一代顯微鏡，因其能夠?qū)NA、蛋白質(zhì)、磷脂生物膜、多糖等生物大分子以及有機(jī)化合物的形態(tài)及功能進(jìn)行觀察研究而引起了人們的廣泛關(guān)注1。近十幾年，運(yùn)用AFM在固相載體表面研究DNA分子技術(shù)取得的巨大進(jìn)步, 大大地增進(jìn)了人們?cè)诜肿訉用嫔蠈?duì)DNA分子的了解25。AFM在樣本制備上相對(duì)較容易，但用于DNA研究時(shí)，要想得到質(zhì)量較高的DNA圖像對(duì)DNA樣品的純度要求較高。我們選擇了3種不同的DNA純化試劑盒對(duì)

7、K562/A02細(xì)胞株mdr1基因769bp DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后在相同條件下用AFM觀測(cè)，通過(guò)比較，建議其中的兩種可用于AFM的DNA樣品的純化。1  材料和方法1.1  細(xì)胞培養(yǎng)K562/A02細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所楊純正、齊靜老師惠贈(zèng)。細(xì)胞接種于含10%小牛血清的RPMI 1640(Gibco/BRL公司產(chǎn)品)培養(yǎng)液，置于37、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，23d傳代1次，實(shí)驗(yàn)前無(wú)藥培養(yǎng)兩周。1.2  DNA提取取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、終濃度2×105ml-1的K562/A02細(xì)胞3ml，以酚/氯仿法抽DNA后，加100l TE緩沖液于-2

8、0保存。用紫外分光光度計(jì)定量，要求A260/A2801.8。1.3  PCR擴(kuò)增從基因庫(kù)中查得所需mdr1的基因序列號(hào)，引物根據(jù)基因庫(kù)提供的基因全序列用計(jì)算機(jī)軟件Primer3設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列：上游5ATACTTTACTCCTTCCTTCAA3，下游5TCTGAATAAAGTAGATTTCTTCATG3,擴(kuò)增K562/A02 細(xì)胞mdr1基因-75811的DNA,片段長(zhǎng)度為769bp。PCR反應(yīng)體系：純化的DNA模板2.51，50pmolL-1上下游引物各11，25mmolL-1 MgCl2 1.51， dNTP41，5×PrimeSt

9、aRTM緩沖液(含Mg2)101，10mmolL-1 PrimeStaR HS DNA聚合酶0.5U,余用滅菌去離子水補(bǔ)至501。熱循環(huán)參數(shù)為： 98變性10s，55退火10s，72延伸1min;擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。1.4  10gL-1瓊脂糖凝膠電泳取10l PCR產(chǎn)物，加2l溴酚藍(lán)上樣緩沖液，加入3個(gè)點(diǎn)樣孔行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在TAE電泳緩沖液中，電壓5Vcm-1,45min后取出凝膠置于紫外透射儀上顯影拍照。1.5  DNA純化在紫外特?cái)z儀下切取3條含有清晰目的條帶的凝膠塊，分別用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP2092，TIANWEI公司產(chǎn)品）、DNA小量膠回收試

10、劑盒（W5211,2408A,Waston公司產(chǎn)品）及瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒（DV805A,TaKaRa公司產(chǎn)品）按相關(guān)說(shuō)明書進(jìn)行純化，純化樣品于-20保存。1.6  樣本的制備按Tanigawa等6的方法用1ngl-1 L型多聚賴氨酸(Sigma公司產(chǎn)品)預(yù)先處理新剝離的云母片(1.0cm×1.0cm)。多聚賴氨酸處理過(guò)的云母片用雙面膠帶粘附于甩膜機(jī)上，分別滴加以3種DNA純化試劑盒純化后，終濃度為10ngl-1的K562/A02 細(xì)胞mdr1 DNA樣品20l于云母片中央，并在室溫下作用2min, 用7000rmin-1離心, 用吸量管吸1000l去離子水滴加在旋轉(zhuǎn)

11、的云母片中央，沖洗3遍，時(shí)間持續(xù)1min，制備成3份DNA觀測(cè)樣品。1.7  AFM觀察和分析樣品使用Nanoscope AFM (Veeco/Digital Instruments, Santa Barbara, CA)觀測(cè), 在tapping模式下操作，像素密度為512×512，操作條件是室溫、空氣中，相對(duì)濕度不超過(guò)37%。用125m 硅針尖tapping模式下共振頻率為300400kHz、針尖掃描頻率為 12Hz進(jìn)行掃描。獲取掃描圖像后，用Veeco/Digital Instruments公司的程序軟件將圖像進(jìn)行去噪聲處理，獲得清晰的DNA圖像。通過(guò)圖像分析，評(píng)價(jià)3種

12、試劑盒對(duì)DNA的純化效果。 2  結(jié)果2.1  獲取DNA樣品用PCR的方法擴(kuò)增K562/A02細(xì)胞mdr1基因769bp的DNA片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1），切取3條清晰條帶后分別用3種不同的DNA純化試劑盒嚴(yán)格按相關(guān)說(shuō)明書進(jìn)行純化，純化樣品于-20保存。13.K562/A02；4.DNA Marker 圖1  瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)K562/A02 mdr1基因DNA的PCR產(chǎn)物（略）Fig 1  Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of K562/A02 cell

13、s mdr1 gene2.2  通過(guò)AFM圖像觀測(cè)DNA評(píng)價(jià)3種不同DNA純化試劑盒的純化效果通過(guò)AFM獲取了3份不同純化試劑盒純化后DNA的清晰、分散圖像（圖2、3、4），所得的圖像顯示以上述方法制備的DNA樣本均能達(dá)到較好的線性化，說(shuō)明我們的樣本制備是成功的。在DNA樣本來(lái)源、樣本制備方法、操作模式及觀測(cè)條件均相同的情況下，并排除了云母表面吸附力大小、 DNA濃度及灰塵等對(duì)樣品分散的影響，我們通過(guò)圖像觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TIANWEI公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化后的DNA樣本（如圖2）中含有較多的大小不均的顆粒雜質(zhì)，制片背景不清晰，有少量顆粒粘附于DNA 上，可能會(huì)影響對(duì)DNA的輪廓觀察及模