不同限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒DNA的切割

1、Digestion of plasmid DNA with different restriction endonucleaseDigestion of pUC19-P35S:ARF8 with Enzyme Pst1不同限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒DNA的切割Enzyme Pst1 對(duì)pUC19-P35S:ARF8的切割摘要（Abstract：）：限制性?xún)?nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱(chēng)為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA,從而得到大小不一的DNA片段。本實(shí)驗(yàn)采用限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒pUC19-35S-ARF8進(jìn)行切割。首先對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行DNA酶切反應(yīng)，然后進(jìn)行瓊脂

2、糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察熒光條帶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶Pst1切割后，在電泳膠板上顯示有3條熒光條帶關(guān)鍵詞（Key Words）：限制性核酸內(nèi)切酶 Pst1 pUC19-P35S:ARF8 質(zhì)粒 電泳引言（Introduction）：DNA限制性?xún)?nèi)切酶酶切圖譜又稱(chēng)DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。在DNA序列分析、基因組的功能圖譜繪制、DNA的無(wú)性繁殖、基因文庫(kù)的構(gòu)建等工作中，建立限制性?xún)?nèi)切酶圖譜都是不可缺少的環(huán)節(jié)，近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)技術(shù)更是建立在它的基礎(chǔ)上。構(gòu)建DNA限制性?xún)?nèi)切酶圖譜有許多方法。通

3、常結(jié)合使用多種限制性?xún)?nèi)切酶，通過(guò)綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時(shí)切所得到的限制性片段大小來(lái)確定各種酶的酶切位點(diǎn)及其相對(duì)位置。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)用不同的酶來(lái)切割重組質(zhì)粒pUC19-35S-ARF8，從而確定不同的酶在此質(zhì)粒上的切割位點(diǎn)。1材料和方法（Material and Methods）：1.1 材料DNA: 購(gòu)買(mǎi)或自行提取純化; 重組pBS質(zhì)料或pUC19質(zhì)粒; EcoRI酶及其酶切緩沖液: 購(gòu)買(mǎi)成品; Hind酶及其酶切緩沖液: 購(gòu)買(mǎi)成品;瓊脂糖(Agarose): 進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)的電泳用瓊脂糖均可。1.2 設(shè)備水平式電泳裝置,電泳儀,臺(tái)式高速離心機(jī), 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電

4、爐,紫外透射儀, 照相支架, 照相機(jī)及其附件。1.3試劑 5×TBE電泳緩沖液 6×電泳載樣緩沖液：0.25 溴粉藍(lán)，40(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于 4。溴化乙錠(EB)溶液母液:將EB配制成10mg/ml,用鋁箔或黑紙包裹容器,儲(chǔ)于室溫即可。1.2 方法 DNA酶切反應(yīng)將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf管(最好0.5ml)編號(hào),用微量移液槍分別加入DNA 1g和相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶反應(yīng)10×緩沖液2l,再加入重蒸水使總體積為19l,將管內(nèi)溶液混勻后加入1l酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機(jī)甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵

5、,要防止錯(cuò)加，漏加。使用限制性?xún)?nèi)切酶時(shí)應(yīng)盡量減少其離開(kāi)冰箱的時(shí)間，以免活性降低?；靹蚍磻?yīng)體系后,將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷?如插在泡沫塑料板上),37水浴保溫2-3小時(shí),使酶切反應(yīng)完全。 每管加入2l 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混勻,以停止反應(yīng),置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?瓊脂糖凝膠的制備取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀釋緩沖液,待用。 膠液的制備：稱(chēng)取0.4g瓊脂糖,置于200ml錐形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀釋緩沖液,放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8瓊脂糖凝膠

6、液。加熱過(guò)程中要不時(shí)搖動(dòng),使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。向冷卻至50-60的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5g /ml(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5g/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè),待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi),使膠液形成均勻的膠層。倒膠時(shí)的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出

7、現(xiàn)氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒(méi)過(guò)膠板上表面。因邊緣效應(yīng)樣品槽附近會(huì)有一些隆起,阻礙緩沖液進(jìn)入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿(mǎn)緩沖液。加樣：取10l酶解液與2l 6×載樣液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過(guò)樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要更換tip頭,以防止互相污染,注意上樣時(shí)要小心操作,避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V,電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝

8、膠前沿約2cm時(shí),停止電泳。染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5g/ml的EB溶液中,室溫下染色20-25分鐘。觀察和拍照：在波長(zhǎng)為254nm的短波紫外燈(LEC-160L)下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上紫外線防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩,以免損傷眼睛。經(jīng)照相機(jī)鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機(jī)固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6,曝光時(shí)間10-120秒(根據(jù)熒光條帶的深淺選擇)。2結(jié)果和分析：電泳結(jié)果如下圖所示分析：本次實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)所提供的重組質(zhì)粒pUC19-P35S-ARF8，是環(huán)狀DNA，大小為6290bp；采

9、用的酶是Pst1。此限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒pUC19-P35S-ARF8的切割位點(diǎn)有3個(gè)，分別是2251、5536、4146，所以理論上此質(zhì)粒DNA被切割成3個(gè)片段，大小分別為1105bp，790bp，4395bp。實(shí)際結(jié)果和理論結(jié)果不完全符合。如上圖16號(hào)所示，其中一條帶在750bp與500bp之間，另外兩條帶都在2000bp附近，彼此相離很近。導(dǎo)致實(shí)際結(jié)果與理論結(jié)果不一致的原因可能是操作中試劑添加的順序不當(dāng)，反應(yīng)的溫度、時(shí)間有誤，核酸內(nèi)切酶的污染，試劑的體積誤差，瓊脂糖濃度等。在眾多因素中，我認(rèn)為最有可能的是酶的污染，因?yàn)閷?shí)際上切出來(lái)的DNA片段比理論上的小，DNA片段被切成了更小的片段。3小結(jié)（Summary）：此次實(shí)驗(yàn)存在很多不足：試劑都很微量，操作過(guò)程中小小的誤差就可能影響整個(gè)結(jié)果；加樣技術(shù)不夠嫻熟，有樣品溢到外面；實(shí)驗(yàn)前的預(yù)習(xí)工作做的不好，思路不夠清晰，對(duì)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行有一定的影響，所以，預(yù)習(xí)是實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的關(guān)鍵。雖然本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不太理想，但還是有一定的收獲。經(jīng)過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步了解了限制性?xún)?nèi)切酶，增加了對(duì)酶的專(zhuān)一性的理解。進(jìn)一步鞏固了電泳的操作步驟。4參考文獻(xiàn)：【1】 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，郭培國(guó)【2】 關(guān)海紅,石連玉,劉明華，黑龍江野鯉線粒