高壓氧前處理脊髓損傷大鼠前角運動神經(jīng)元的凋亡

1、中國組織工程研究 第16卷 第2期 20120108出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research January 8, 2012 Vol.16, No.2高壓氧前處理脊髓損傷大鼠前角運動神經(jīng)元的凋亡*李洪鵬1，巴 方2，白 丹1，高 杰1Apoptosis of anterior horn motor neurons after hyperbaric oxygen preconditioning in spinal cord injury ratsLi Hong-peng1, Ba Fang2, Bai Dan1, Gao Jie1Abstr

2、actBACKGROUND: Spinal cord injury is difficult to repair. The protection of relict neurons is the key for promoting neural regeneration.OBJECTIVE: To test whether spinal cord anterior horn motor neurons are protected by hyperbaric oxygen preconditioning through inhibition of early apoptosis.METHODS:

3、 A total of 26 Wistar male rats were randomly divided into two groups: control group and hyperbaric oxygen group. Rats in hyperbaric oxygen group were administrated with hyperbaric oxygen for 5 days. Complete spinal cord (T9-T10) transection model was constructed on the 5th day after hyperbaric oxyg

4、en. In the meantime, complete spinal cord (T9-T10) transection model was constructed for control rats.RESULTS AND CONCLUSION: Nissl staining demonstrated that hyperchromic cells were common in the two groups at 8 hour and 1 day after spinal cord transection at T9T10. The number of hyperchromic cells

5、 in the hyperbaric oxygen group was less than that in the control group. TUNEL staining demonstrated that the massive apoptotic neurons were found at 8 hour and 1 day after the spinal cord transection at T9T10 in rat anterior horn of spinal cord in both groups; the number of apoptotic neurons decrea

6、sed on the 3rd day. The number of apoptotic spinal cord anterior horn motor neurons in thehyperbaric oxygen group was smaller than that in the control group at 8 hour and 1 day after hyperbaric oxygen (P < 0.05, P < 0.01). These findings indicate that hyperbaric oxygen preconditioning has a pr

7、otective effect on anterior horn motor neurons after spinal cord injury.摘要 背景：脊髓損傷后難以修復(fù)，損傷后保護(hù)殘存的神經(jīng)元是促進(jìn)神經(jīng)再生的關(guān)鍵。目的：驗證高壓氧預(yù)處理可以通過抑制早期的細(xì)胞凋亡來保護(hù)脊髓前角運動神經(jīng)元。方法：隨機將26只雄性Wistar大鼠等分成模型組和實驗組。實驗組在給予高壓氧5 d后與模型組同時制作脊髓T910全橫斷模型。結(jié)果與結(jié)論：尼氏染色顯示脊髓T9T10全橫斷后8 h及1 d，脊髓前角的濃染的細(xì)胞多見，與模型組相比，實驗組脊髓前角濃染的細(xì)胞較少。TUNEL染色也顯示脊髓T9T10全橫斷后脊髓損

8、傷后8 h1 d，2組大鼠脊髓前角內(nèi)均可見大量的凋亡神經(jīng)元，3 d時凋亡神經(jīng)元數(shù)量減少。相比于模型組，高壓氧預(yù)處理8 h，1 d后大鼠脊髓前角凋亡神經(jīng)元較少(P < 0.05，P < 0.01)。說明高壓氧預(yù)處理能對脊髓損傷后前角運動神經(jīng)元起保護(hù)作用。 關(guān)鍵詞：高壓氧；預(yù)處理；脊髓損傷；前角運動神經(jīng)元；凋亡；大鼠李洪鵬，巴方，白丹，高杰. 高壓氧前處理脊髓損傷大鼠前角運動神經(jīng)元的凋亡J.中國組織工程研究，2012，16(2): 295-298.灌注的調(diào)節(jié)相關(guān)7。在缺血再灌注過程中活性氧0 引言自由基的大量產(chǎn)生可導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜的腺嘌呤核苷酸移位酶的氧化巰基釋放而導(dǎo)致其通透性脊髓損傷后

9、對缺血耐受性較差，缺血缺氧增加8，可導(dǎo)致受損脊髓的二次損傷1-2，并且損傷常常在早期的研究中顯示高壓氧前處理可上調(diào)發(fā)生在受損后幾小時到3 d3-4。Chu等5報道缺超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)血缺氧可誘發(fā)多種因子引起DNA損傷和修復(fù)。 及過氧化氫酶的活性9。高壓氧可提高血液中血紅蛋白的氧飽和然而既往的研究多停留在脊髓缺血后高壓度，有報告稱適度的高壓氧可以預(yù)防二次損 氧的保護(hù)作用10，而高壓氧對直接的脊髓損傷傷6。后神經(jīng)元的保護(hù)作用鮮有報道。高壓氧前處理可以提高中樞神經(jīng)對缺血缺本實驗擬用高壓氧前處理的手段探討對脊氧的耐受性，而其發(fā)生機制與線粒體對缺血再髓損傷

10、后的前角運動神經(jīng)元的保護(hù)。ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 1Department of Human Anatomy, College of Basic Medical Sciences, China MedicalUniversity, Shenyang 110001, Liaoning Province, China; 2Department of Rehabilitation,Shengjing Hospital of China MedicalUniversity, Shenyang 110006, Liaoning Province,

11、 ChinaLi Hong-peng, Doctor, Associate professor, Department of Human Anatomy, College of Basic Medical Sciences, China MedicalUniversity, Shenyang 110001, Liaoning Province, China lihongpeng1966Ba Fang, Studying fordoctorate, Lecturer,Department ofRehabilitation, Shengjing Hospital ofChina Medical U

12、niversity, Shenyang110006, Liaoning Province, ChinaLi Hong-peng and BaFang contributed equally to this paper. Correspondence to:Li Hong-peng,Department of Human Anatomy,College of BasicMedical Sciences, China MedicalUniversity, Shenyang 110001, Liaoning Province, Chinalihongpeng1966 Supported by: th

13、e National Natural Science Foundation of China, No. 30872669*Received: 2011-10-19 Accepted: 2011-11-10295李洪鵬，等. 高壓氧前處理脊髓損傷大鼠前角運動神經(jīng)元的凋亡1礎(chǔ)中國醫(yī)科大學(xué)基研室，醫(yī)學(xué)院解剖教市國醫(yī)科 110001遼寧省沈陽醫(yī)院康復(fù)科，大學(xué)；2盛京中省沈陽市110006 遼寧第一作作者：李洪鵬，者及通訊男，遼寧省海城市人，1966年生，博士，要從副教授，主與修復(fù)研究。事脊髓損傷lihongpeng1966 共同第一作者：方，女，巴生，1975年人，遼寧省沈陽市師，在讀博士，講損傷與修

14、復(fù)研究。主要從事脊髓baf126 中圖分類號:R318 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B文章編號:1673-8225 (2012)02-00295-04收稿日期：2011-10-19修回日期：2011-11-10 (20111019010/YJ· LX)2961 材料和方法設(shè)計：隨機對照動物實驗。時間及地點：于2010-04/2011-01在中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院完成。材料：實驗動物：雄性10周齡SPF級成年Wistar大鼠26只，體質(zhì)量230280 g，平均250 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SYSK2008-0005。實驗的過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。主要試劑及儀器：試劑

15、及儀器來源高壓氧艙 NGT50B型，煙臺，中國 TUNEL 試劑盒 凱基生物，中國冰凍切片機 CN61M/LS-2055，LEICA，德國圖像分析儀Meta Morph/OP10/BX41，OLYMPUS，日本 光學(xué)顯微鏡Nikon，日本方法：分組：26只大鼠隨機分成實驗組和模型組，各13只。高壓氧前處理：將實驗組動物置入高壓氧艙內(nèi)，以含體積分?jǐn)?shù)98%O2、2%CO2的混合氣體連續(xù)洗艙10 min，使艙內(nèi)氧體積分?jǐn)?shù)達(dá)90%以上，再以34.5 kPa/min的加壓速率，在20 min內(nèi)勻速加壓至0.15 MPa，穩(wěn)壓60 min，中間用加壓用混合氣體通風(fēng)5 min×2次，艙內(nèi)氧體積分?jǐn)?shù)

16、為98%100%，相對濕度為60%80%，溫度37 。治療完畢用20 min勻速減壓出艙。1次/d，連續(xù)治療5 d，最后1次治療后24 h內(nèi)與模型組動物同時造模11。脊髓損傷模型制備：2組大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射，麻醉后俯臥位固定，在T810水平做后正中切口，逐層切開組織，暴露T910棘突，咬除棘突和椎板暴露脊髓，在T910用虹膜刀片行脊髓全橫切，大鼠尾巴痙攣擺動及軀體回縮撲動后雙下肢癱瘓為準(zhǔn)12。生理鹽水沖洗后敷上少許青霉素粉，逐層縫合。術(shù)后大鼠自由進(jìn)水進(jìn)食，分籠清潔飼養(yǎng)。動物標(biāo)本制備：脊髓損傷8 h，1，3 d后，每組各取4只大鼠，用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹

17、腔注射麻醉后行灌流固定，生理鹽水快速灌流后(50 mL/只)，再快速灌流40 g/L多聚甲醛 300 mL。切取以橫斷處為中心上方1.0 cm長的脊髓組織，浸于40 g/L多聚甲醛后固定24 h，轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液24 h，OCT包埋后以脊髓橫斷端為起始做10 µm厚的連續(xù)冠狀冰凍切片，切片以備染色使用。Nissl染色：切片經(jīng)0.02 mol/L PBS沖洗3次后，在0.1%甲酚紫染色液染色15 min，再經(jīng)乙醇梯度快速脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固觀察。TUNEL染色：將冰凍切片浸入固定液，室溫固定20 min。以下步驟按TUNEL試劑盒步驟進(jìn)行： 0.02 mol/L PBS沖洗

18、30 min，浸入封閉液(體積分?jǐn)?shù)3%H2O2溶于甲醇)中，室溫下10 min，漂洗2次，浸入通透液(通透液：0.1% TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉)中，冰上促滲35 min。經(jīng)0.02 mol/L PBS沖洗2次后，每個樣本滴加 50 µL TdT酶反應(yīng)液(45 µL緩沖液+ 1 µL生物素標(biāo)記-11-dUTP + 4 µL TdT酶)，加蓋玻片37 避光濕潤反應(yīng)60 min，PBS漂洗3次，滴加50 µL鏈霉親和素-HRP工作液(0.5 µL鏈霉親和素- HRP + 99.5 µL PBS)，加蓋玻片37

19、濕潤避光反應(yīng)30 min，PBS漂洗3次。滴加50100 µL DAB工作液(5 µL 20×DAB+1 µL體積分?jǐn)?shù)30%H2O2+94 µL PBS)，室溫顯色反應(yīng)10 min，PBS漂洗3次，100倍光鏡下觀察。每個標(biāo)本取4張切片觀察脊髓前角內(nèi)陽性細(xì)胞，取平均值。主要觀察指標(biāo)：大鼠脊髓前角內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)量。統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS11.5軟件(_美國SPSS公司)完成統(tǒng)計處理，實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用配對t 檢驗，P < 0.05為差異有顯著性意義。2 結(jié)果2.1 實驗動物數(shù)量分析 兩組大鼠造模后各有1只死亡，其余

20、24只大鼠均進(jìn)入結(jié)果分析。 2.2 大鼠脊髓前角運動神經(jīng)元的病理變化 尼氏染色顯示，2組大鼠脊髓前角中多數(shù)染色神經(jīng)元可見清晰核仁，部分神經(jīng)元濃染未見核仁。造模后8 h，實驗組的濃染細(xì)胞較模型組偏少，至1 d后二者相差更明顯，3 d后二者的濃縮的神經(jīng)元更少見，見圖1。李洪鵬，等. 高壓氧前處理脊髓損傷大鼠前角運動神經(jīng)元的凋亡a: Hyperbaric oxygen group (8 h) b: Control group (8 h)c: Hyperbaric oxygen group (1 d) d: Control group (1 d) e: Hyperbaric oxygen group

21、(3 d) f: Control group (3 d) Figure 1 Pathological changes of spinal cord anterior hornmotor neuron at 8 h, 1 d and 3 d after spinal cordinjury (Nissl staining, ×400)圖1 脊髓損傷后神經(jīng)元的病理改變8 h，1 d(尼氏染色，和3 d后各組大鼠脊髓前角運動×400)2.3 大鼠脊髓前角運動神經(jīng)元的凋亡 見圖2。a:Hyperbaric oxygen group (8 h)b: Control group (8 h

22、)c: Hyperbaric oxygen group (1 d)b: Control group (1 d)e: Hyperbaric oxygen group (3 d)b: Control group (3 d)Figure 2 Apoptosis of spinal cord anterior horn motorneurons after spinal cord injury (TUNEL staining) 圖 2 脊髓損傷后后各組大鼠脊髓前角運動神經(jīng)元的凋亡氏染色, ×400) (尼ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAHwww

23、.CRTER.orgTUNEL染色顯示，脊髓損傷后8 h1 d，2組大鼠脊髓前角內(nèi)均可見大量的凋亡神經(jīng)元，3 d時凋亡神經(jīng)元數(shù)量減少。相比于模型組，高壓氧預(yù)處理8 h，1 d后大鼠脊髓前角凋亡神經(jīng)元較少(P < 0.05，P < 0.01)，見表1。3 討論脊髓損傷后的治療已成為世界醫(yī)學(xué)界的難題。脊髓損傷后除了直接損傷外還包括損傷后的二次損傷。醫(yī)學(xué)上雖然對脊髓損傷尚無根本的治療方法，但理論上可以盡量減少或避免二次損傷的發(fā)生。脊髓損傷后的二次損傷包括損傷部位的炎性反應(yīng)以及由于出血導(dǎo)致的鐵離子和血紅蛋白的釋放引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞毒性引起細(xì)胞水腫崩解13-18。氧化應(yīng)激反應(yīng)主要是損傷

24、部位的活性氧自由基的釋放增加，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜上的脂質(zhì)雙分子層14。對于脊髓損傷后的二次損傷的預(yù)防治療包括臨床及多數(shù)研究報道大劑量潑尼松可以通過抑制脂質(zhì)氧化和自由基的發(fā)生而起到神經(jīng)保護(hù)作用19-20。Serarslan 等19，21報道潑尼松治療抑制脊髓損傷后的二次損傷可能與減少損傷部位的丙二醛水平并提高SOD 和谷胱甘肽過氧物酶的表達(dá)有關(guān)。除了激素治療外高壓氧治療脊髓損傷同樣可以抑制氧化應(yīng)激反應(yīng) 22-23。 在動物模型實驗中，高壓氧治療能夠改善由于水腫而導(dǎo)致的缺氧的狀態(tài)并能調(diào)節(jié)微循環(huán)24-25，亦能促進(jìn)毛細(xì)血管的再生26-27。高壓氧的生理作用主要基于治療后短期內(nèi)血液中的高飽和氧導(dǎo)致血管和組

25、織之間的高擴散梯度26-28，組織間的高飽和氧能夠減弱誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶基因的表達(dá)29。同時高壓氧治療也可能上調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)。比如Sakurai等30發(fā)現(xiàn)脊髓缺血后8 h運動神經(jīng)元即表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，海馬在腦缺血后3 h即顯示膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子活性31，而膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子被認(rèn)為是抑制細(xì)胞凋亡及促進(jìn)神經(jīng)再生的重要因子之一。對于高壓氧治療脊髓損傷的臨床及實驗研究報道較多，而高壓氧預(yù)處理是否對脊髓損傷同樣具有保護(hù)作用鮮有報道。關(guān)于高壓氧預(yù)處理的研究常常被應(yīng)用于脊髓缺血的動物模型11。在兔的脊髓缺血模型中，脊髓缺297李洪鵬，等. 高壓氧前處理脊髓損傷大

26、鼠前角運動神經(jīng)元的凋亡32血后脊髓內(nèi)的凋亡細(xì)胞產(chǎn)生于術(shù)后1 d，而缺血 。 在本30 min后凋亡細(xì)胞在術(shù)后4 h內(nèi)即可觀察到33實驗中觀察到高壓氧預(yù)處理的大鼠在脊髓損傷后前角運動神經(jīng)元的凋亡主要發(fā)生在24 h內(nèi)，此結(jié)果與Yu 17 Siegal T, Siegal T, Shohami E, et al. Experimental neoplasticspinal cord compression: effect of ketamine and MK-801 on edema and prostaglandins. Neurosurgery. 1990;26(6):963-966. 18 Y

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28、切斷供應(yīng)脊髓的血管，因此，損傷區(qū)域也會產(chǎn)生與脊髓缺血同樣的結(jié)果是可以理解的。高壓氧預(yù)處理在脊髓損傷模型制備前已經(jīng)給予中樞神經(jīng)組織足夠的氧儲備，因此在脊髓損傷發(fā)生后可以減輕脊髓損傷產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而氧化應(yīng)激反應(yīng)和免疫反應(yīng)是產(chǎn)生脊髓損傷后二次損傷的主要因素，因此，認(rèn)為高壓氧預(yù)處理對神經(jīng)元的保護(hù)作用與降低氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，并且保護(hù)作用主要體現(xiàn)在脊髓損傷后的3 d以內(nèi)。本實驗證明了高壓氧預(yù)處理可以在脊髓損傷后的短期內(nèi)提高脊髓前角細(xì)胞的生存率，說明了高壓氧預(yù)處理可以起到神經(jīng)保護(hù)作用。但高壓氧預(yù)處理對神經(jīng)元的保護(hù)機制還不甚明了。在進(jìn)一步的研究中，將通過對損傷部位組織的丙二醛、SOD和谷胱甘肽過氧物酶的

29、表達(dá)來進(jìn)行深一步的探討。4 參考文獻(xiàn) 1 Tator CH, Fehlings MG. Review of the secondary injury theory of acute spinal cord trauma with emphasis on vascular mechanisms. J Neurosurg. 1991;75(1):15-26.2 Young W. Secondary injury mechanisms in acute spinal cord injury. J Emerg Med. 1993;11 Suppl 1:13-22.3 Sasaki S, Schneid

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