誘導型一氧化氮合酶在強啡肽致脊髓損傷中的作用

1、誘導型一氧化氮合酶在強啡肽致脊髓損傷中的作用*摘要目的：探討誘導型一氧化氮合酶(iNOS)在強啡肽致脊髓損傷中的作用。方法：3H-左旋精氨酸轉(zhuǎn)化法測定腹側(cè)和背側(cè)脊髓iNOS活性，原位雜交法觀測脊髓iNOS mRNA表達及其細胞分布。結(jié)果：大鼠蛛網(wǎng)膜下腔注射(InI)強啡肽A1-17(Dyn) 20 nmol引起持久性截癱和遲發(fā)性神經(jīng)元死亡；在Dyn致癱后23 h iNOS mRNA表達開始增多增強，4 h達高峰，24 h和48 h仍見廣泛表達，其分布以膠質(zhì)細胞和大運動神經(jīng)元為主；腹側(cè)脊髓iNOS活性在Dyn致癱后4 h顯著升高，并持續(xù)至24 h和48 h；提前10 min InI選擇性iNOS

2、抑制劑氨基胍1 mol可顯著對抗Dyn 20 nmol引起的持久癱及傷后4 h腹側(cè)脊髓iNOS活性升高。結(jié)論：iNOS持續(xù)性高表達與Dyn致脊髓損傷機制有關(guān)。主題詞強啡肽；一氧化氮；脊髓損傷 Increases of inducible nitric oxide synthase activity and mRNA expression in rat spinal cord after dynorphin neurotoxicityHU Wen-Hui, YANG Hui-Fen, LI Fang, QIANG Wen-An, SUN Xiu-Jun, LIU Na,WAN Xuan-Cai,

3、 LIU Jing-Sheng, REN Min-Feng, WANG Guo-Qiang, XIAO Jian, LIAO Wei-HongInstitute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing(100005)AbstractAIM:To explore the role of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in dynorphin-induced spinal cord

4、injury. METHODS:The iNOS activities in ventral and dorsal spinal cord were measured with 3 H-L-Arginine conversion. The iNOS mRAN expression and its cell distribution were detected with in situ hybridization.RESULTS:Intrathecal injection of dynorphin A1-17 (Dyn) 20 nmol induced permant paraplegia an

5、d delayed neuronal death.The iNOS mRNA expression began to increase at 23 h, peaked at 4 h and remained extensive at 2448 h after Dyn spinal neurotoxicity, predominantly in glia cells and large motoneurons. The iNOS activities in ventral cord significantly increased at 4 h and persisted up to 2448 h

6、. Intrathecal pretreatment with aminoguanidine 1 mol, a selective iNOS inhibitor, 10 min before Dyn 20 nmol significantly ameliorated Dyn-induced neurological outcome and antagonized the increase of iNOS activities at 4 h after Dyn neurotoxicity. CONCLUSION:Persistent high expression of iNOS might b

7、e involved in the pathophysiology of dynorphin-induced spinal cord injury.MeSHDynorphin; Nitric oxide; Spinal cord injuries蛛網(wǎng)膜下腔注射(intrathecal injection, InI)強啡肽A1-17(dynorphinA1-17,Dyn),在強烈鎮(zhèn)痛的同時可導致正常動物的脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)，并可加重SCI動物的損傷程度1。關(guān)于Dyn致SCI的機制尚不清楚。我們實驗室以往工作表明N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-

8、aspartate,NMDA)受體拮抗劑和Ca2+通道阻斷劑均能對抗Dyn致癱，提示NMDA和Ca2+與Dyn致SCl機制有關(guān)2。一氧化氮(nitric oxide, NO)在神經(jīng)、免疫和心血管等多個系統(tǒng)中具有廣泛而復雜的生理與病理作用3，近來引起普遍關(guān)注。誘導型NO合酶(inducible NO synthase, iNOS)受基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，一旦形成則緩慢持久產(chǎn)生大量NO，在免疫、腫瘤和腦缺血等病理過程具有細胞毒性作用3，4。我們曾采用NADPH-黃遞酶(NADPH-diaphorase, Nd)組化技術(shù)首次觀察到Dyn致癱可誘導脊髓腹角細胞表達NOS5。本文采用3H-左旋精氨酸(L-arg

9、inine, L-Arg)轉(zhuǎn)化及iNOS原位雜交技術(shù)觀測Dyn致癱后iNOS活性和mRNA表達，并探討iNOS選擇性抑制劑氨基胍(aminoguanidine, AG)對Dyn致SCI作用的影響。材料與方法(一)動物、手術(shù)和藥物引入:Wistar 大鼠，雌雄各半，體重(27015)g，由中日友好臨床醫(yī)學研究所動物室提供。按Yaksh法進行蛛網(wǎng)膜下腔插管2，6。給? 國家自然科學基金資助(No. 39370786)藥體積10 L并用生理鹽水10 L沖洗。AG用1 mol/L HCl快速溶解后用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.4。其余藥物均用生理鹽水配制。(二)后肢運動功能測定：根據(jù)Fad

10、en 8點分級法和Behrmann 5點分級法加以改進6。(三)iNOS活性測定：采用本研究室建立的3H-L-Arg轉(zhuǎn)化法試劑盒測定iNOS活性。(四)原位雜交：常規(guī)灌注4%多聚甲醛并維持固定12 h。取出T11S3結(jié)果(一)Dyn對大鼠脊髓功能的影響：在Dyn 10 nmol InI后，11只大鼠中有5只出現(xiàn)一過性癱(在1 h內(nèi)恢復至67級)，有2只出現(xiàn)持久性癱瘓，24 h內(nèi)毫無恢復；20 nmol InI后19只大鼠均出現(xiàn)嚴重癱瘓，其中1只在1 h內(nèi)恢復至7級，2只在4 h內(nèi)恢復至67級，16只在24 h均無明顯恢復(1)。 Fig1 Intratheal pretreatment wit

11、h selective iNOS inhibitor aminoguanidine(AG) 1 mol significantly antagonized dynorphin A1-17(Dyn) 20 nmol(D20)-induced permanent paraplegia but did not aggravate Dyn 10 nmol(D10)-induced transient paralysis*P0.05,*P0.01, vs D20. Dots represent numbers of animal 1選擇性iNOS抑制劑氨基胍顯著對抗強啡肽致癱(二)Dyn致癱后不同時間背

12、側(cè)與腹側(cè)脊髓iNOS活性變化：在InI對照正常大鼠，上清iNOS在背側(cè)與腹側(cè)間無顯著差異(2)。在Dyn 20 nmol致持久癱后30 min2 h，iNOS活性在腹側(cè)脊髓均無顯著性變化，但在Dyn致癱后4、24和48 h均顯著升高，而背側(cè)的上清iNOS活性在Dyn致癱后48 h亦顯著升高(2)。我們在預實驗中初步觀察了Dyn持久癱后總脊髓的iNOS活性變化，也獲得類似結(jié)果。正常總脊髓的iNOS活性為(16.832.70) pmol.mg1.min1(n=5);iNOS活性在2 h無顯著變化(19.301.47) pmol.mg-1.min-1,n=7),在24 h顯著升高至(27.694.2

13、4) pmol.mg-1.min-1，n=5,P0.05。(三)選擇性iNOS抑制劑AG顯著對抗Dyn致癱：提前10 min InI AG 1mol能明顯對抗Dyn 20 nmol引起的持久癱和神經(jīng)損傷； 并不加重Dyn 10 nmol引起的過性癱(1)。AG 1mol不僅明顯對抗Dyn 20 nmol 引起的傷后4 h 腹側(cè)iNOS活性升高，而且抑制腹側(cè)與背側(cè)iNOS活性，與InI對照組相比分別低了60.3%和68.7%(2)。 Fig2 Activities of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the supernatant of ve

14、ntral (V) and dorsal (D) spinal cords after dynorphin A1-17(Dyn) 20 nmol-induced spinal cord injury and effect of pretreatment with aminoguanidine(AG) 1 mol*P0.01，#P0.05,#P0.01, vs saline control(Con) and Dyn 4 h respectively. Numbrs of animal are shown in parenthese 2強啡肽致癱后腹側(cè)與背側(cè)iNOS活性變化及氨基胍的影響(四)iN

15、OSmRNA表達的細胞定位和損傷反應：在InI對照動物，僅見腹角運動神經(jīng)元和背核等大神經(jīng)元及室管膜細胞中度表達iNOS mRNA (3A)。在Dyn 20 nmol 致癱后5、10、20、和30min及1 h均見運動神經(jīng)元和室管膜細胞明顯陽性，但與同步的相應對照組(切片放在同一染管中)比較無明顯差異，膠質(zhì)細胞也未見明顯陽性。在23 h表達開始增多增強，4 h達高峰，分布廣泛，以運動神經(jīng)元、背核、層及室管膜細胞為著，雜交信號表現(xiàn)典型，膠質(zhì)細胞(尤其在白質(zhì))開始表達iNOS mRNA(3BC)。在24 h和48 h仍見廣泛性強表達，以膠質(zhì)細胞和或小神經(jīng)元(白質(zhì)和灰質(zhì))為主，彌散性分布(3D)；在有

16、明顯中央性壞死的節(jié)段，壞死區(qū)可見iNOS mRNA陽性細胞，壞死邊緣區(qū)也見散在的運動神經(jīng)元和小細胞陽性；在結(jié)構(gòu)完整的節(jié)段，仍見廣泛性運動神經(jīng)元和背核、層及室管膜細胞陽性，并有較多小細胞(可能是膠質(zhì)細胞)。Fig 3Paralyzing dose of dynorphin A1-17 apparently induced extensive expression of iNOS mRNA in rat spinal cord.A: saline control. B:2 h , C:4 h，D：24 h.BL , DL and BR,DR are magnified from the left

17、and right ventral horn of B and D respectively. Small arrows indicate glia cells. scale bars=100 m 3致癱劑量強啡肽明顯誘導大鼠脊髓廣泛性表達iNOS mRNA討論(一) iNOS在Dyn致脊髓損傷中的作用：本文觀察到腹側(cè)脊髓iNOS mRNA在Dyn致傷后2 h開始表達，iNOS活性在4 h開始顯著升高，并持續(xù)2448 h以上，其時相變化與遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的時間頗為一致；聯(lián)合應用iNOS抑制劑AG可明顯抑制iNOS活性，并顯著對抗Dyn致癱；表明iNOS在Dyn致SCI中起重要作用，也提示iNO

18、S表達受基因調(diào)控，需要數(shù)小時才能完成。最近Hamada等7報道大鼠脊髓壓迫損傷后24 h脊髓iNOS mRNA表達最明顯，認為iNOS在SCI亞急性期(subacute phase)有重要作用。Iadecola等8發(fā)現(xiàn)腦缺血后12 h iNOS mRNA開始表達，2 d達高峰，iNOS活性在2 d才升高，iNOS抑制劑AG可明顯減輕腦缺血損傷。Dyn致傷引起iNOS表達的時間早于腦缺血，其原因尚不清楚，可能與Dyn致傷特點有關(guān)。Dyn致SCI后神經(jīng)元變性死亡和膠質(zhì)增生反應均較腦缺血為早。(二)iNOS的細胞來源：在CNS中，有多種細胞具有表達iNOS的潛力。己發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞和血管平滑肌細胞只表

19、達iNOS，星形膠質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞可表達iNOS和原生型NOS，而神經(jīng)元不表達iNOS4。CNS損傷后表達iNOS的細胞種類，文獻報道頗不一致。Wallace發(fā)現(xiàn)皮層損傷誘發(fā)星形膠質(zhì)細胞表達Nd。Endoh等9報道短暫性全腦缺血誘發(fā)星形膠質(zhì)細胞表達Nd和iNOS免疫活性。Iadecola等8報道持續(xù)性腦缺血后梗死邊緣區(qū)多形核細胞表達iNOS-免疫活性,2 d開始出現(xiàn)，4 d最高，而巨噬細胞、膠質(zhì)細胞、平滑肌細胞均為iNOS-免疫反應陰性。Schmidt等證明喹啉酸興奮毒性損傷后5 d的iNOS活性升高，主要來源于活化的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)/巨噬細胞。Boje和Hewett等10在體外神經(jīng)元

20、培養(yǎng)中分別證明小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞iNOS產(chǎn)生的NO與神經(jīng)元損傷密切相關(guān)。本文首次發(fā)現(xiàn)Dyn致SCl后大量膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元表達iNOS mRNA，而且正常脊髓神經(jīng)元也表達iNOS mRNA。表達iNOS mRNA的膠質(zhì)細胞是星形還是小膠質(zhì)細胞，以及神經(jīng)元表達iNOS mRNA的原因和意義尚待進一步研究。作者單位：楊慧芬強文安孫秀君劉娜萬選才劉景生任民峰中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院(北京 100005)胡文輝李芳王國強肖劍廖維宏第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所參考文獻1Shukla VK, Lemaire S. Non-opioid effect of dynor

21、phins:Possible role of the NMDA receptor. TiPS, 1994, 15(12):420.2陳彪，田學峰，任民峰.強啡肽A(1-17)致大鼠脊髓損傷.中國藥理學與毒理學雜志，1995，9(1)：30.3Gross SS, Wolin MS. Nitric oxide:Pathophysiological mechanism. Annu Rev Physiol, 1995,57:737.4Ladecola C. Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain injury. TiNS, 1997,20(3):132.5Hu WH, Lee FCH, Wan XST, et al. Dynorhpin neurotoxicity induced nitric oxide synthase expression in ventr