脆性組氨酸三聚體基因在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

1、脆性組氨酸三聚體基因在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義        【摘要】     目的 探討脆性組氨酸三聚體基因在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義。方法 應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)30例舌鱗狀細(xì)胞癌和12例正常舌粘膜鱗狀上皮組織中FHIT的表達(dá)情況。結(jié)果 舌鱗狀細(xì)胞癌組織中FHIT的陽(yáng)性率（40.0%）顯著低于正常舌粘膜組織（75.0%）（P<0.05）。FHIT的表達(dá)與年齡、性別無(wú)關(guān)(P>0.05)，而與分化程度相關(guān)，分化程度越低，F(xiàn)HIT的失表達(dá)越明顯(P&

2、lt;0.05)。結(jié)論 FHIT可能在舌癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。     【關(guān)鍵詞】  脆性組氨酸三聚體；免疫組織化學(xué)；基因；舌癌        The Expression and Significance of FHIT in Squamous Cell Carcinoma of Tongue    ZHANG Yinghuai1， WANG Jie2， DONG Fusheng2， GU Jianqi3   

3、; 1. Department of Oral Surgery, The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China；2. School of Stomatology, Hebei Medical Universities; 3. Hebei Provincial People's HospitalAbstract：Objective   To study the expression and significance of FHIT in tongue squamo

4、us cell carcinoma. Methods  The expression of FHIT was studied with immunohistochemical method in 30 cases of tongue squamous cell carcinoma and 12 cases of normal tongue mucosa squamous epithelium. Results  The positive expression rate of FHIT was significantly lower in tongue squamous ce

5、ll carcinoma （40.0%） than that in normal tongue mucosa squamous epithelium（75.0%, P<0.05）. The expression of FHIT in squamous cell carcinoma of tongue was negatively correlated with the differentiation (P<0.05), while no such correlation could be found between the expression of FHIT and the ag

6、e and sex of patients (P>0.05). Conclusion  FHIT may play an important role in the carcinogenesis and progression of tongue squamous cell carcinoma.    Key words：Fragile histidine triad；Immunohistochemistry；Gene； Tongue cancer       舌鱗狀細(xì)胞癌是口腔頜面部最常

7、見(jiàn)的惡性腫瘤，其惡性程度高，預(yù)后差，發(fā)病機(jī)制仍不清楚。脆性組氨酸三聚體(Fragile histidine triad，F(xiàn)HIT)基因是1996年分離出來(lái)的新的候選抑癌基因。許多研究都表明FHIT基因的缺失與眾多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但FHIT和舌鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)系等相關(guān)研究國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)報(bào)道，國(guó)外亦不多見(jiàn)。本研究采用免疫組化方法研究舌鱗狀細(xì)胞癌中FHIT的表達(dá)及意義，探討FHIT在舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生中的作用。    1  資料與方法    1.1  資料    收集河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1

8、9912004年手術(shù)切除的舌鱗狀細(xì)胞癌石蠟包埋組織標(biāo)本30例。由2位高年病理醫(yī)師復(fù)查全部病例所有病理切片，按WHO標(biāo)準(zhǔn)核實(shí)診斷， 全部病例均為鱗狀細(xì)胞癌，高分化癌17 例，中分化癌7例，低分化癌6例。30例舌鱗狀細(xì)胞癌患者中男19例，女11例，年齡2879歲，平均年齡55.10歲；所有患者術(shù)前未經(jīng)放療及化療。    另外，取12例正常舌粘膜組織作為對(duì)照，其中男9例，女3例，年齡1967歲，平均年齡44.17歲。正常組織均取自囊腫等良性腫瘤旁的正常舌粘膜，經(jīng)病理證實(shí)為正常鱗狀上皮組織。     1.2  試劑

9、0;   兔抗人FHIT多克隆抗體濃縮液，使用濃度175, 二抗及SP免疫組化試劑盒，DAB顯色劑，多聚賴氨酸防脫片劑均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。    1.3  對(duì)照實(shí)驗(yàn)    用已知FHIT陽(yáng)性的正常乳腺標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。    1.4  實(shí)驗(yàn)方法    采用免疫組織化學(xué)SP法（過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素法）。所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟重新包埋后，將每個(gè)蠟塊切為45m的切片，共切3張，1張F(tuán)H

10、IT染色，1張HE染色，1張作為陰性對(duì)照。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；3%  H2O2甲醇振洗25min，微波抗原修復(fù)，9298×15min，正常山羊血清封閉，37孵育30min，滴加一抗，4過(guò)夜；滴加生物素化二抗。以上步驟均嚴(yán)格按照試劑盒要求操作。    1.5  結(jié)果判定    FHIT陽(yáng)性結(jié)果判定： 以細(xì)胞核或漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性， 結(jié)果評(píng)定參照Van Heerden1標(biāo)準(zhǔn)， 采用半定量積分法， 即對(duì)每張切片的染色強(qiáng)度和染色范圍分別進(jìn)行分級(jí)計(jì)分， 然后根據(jù)二者之積確定其陽(yáng)性強(qiáng)度。 染色強(qiáng)度為無(wú)染色或

11、弱染色計(jì)為1分， 中等強(qiáng)度計(jì)為2分， 強(qiáng)染色計(jì)為3分； 染色范圍以陽(yáng)性細(xì)胞率計(jì)分： 10%為1分， 10%50%為2分， 50%為3分。 二者得分計(jì)為19， 3分為不表達(dá)或弱表達(dá)（）， 3分為中等或高表達(dá)（+）。    1.6  統(tǒng)計(jì)分析    用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，免疫組化結(jié)果用2檢驗(yàn)，出現(xiàn)小值頻數(shù)時(shí)，采用Fisher精確概率法。P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2  結(jié)果    2.1  FHIT蛋白在正常舌粘膜組織和舌鱗狀細(xì)

12、胞癌組織中的表達(dá)    在正常舌粘膜組織中，F(xiàn)HIT蛋白的表達(dá)主要位于基底細(xì)胞層和棘層，也有少部分粒層出現(xiàn)FHIT蛋白的表達(dá)，呈棕黃色顆粒染色，且大多為強(qiáng)陽(yáng)性染色，陽(yáng)性細(xì)胞以上皮基底層較為密集，細(xì)胞核和細(xì)胞漿均有著色。在舌癌組織中FHIT蛋白的表達(dá)主要位于癌細(xì)胞的胞漿，呈黃色顆粒染色。    FHIT蛋白在舌鱗狀細(xì)胞癌組織中的中等及高表達(dá)率為40.0%，明顯低于對(duì)照組正常舌粘膜鱗狀上皮組織（75.0%，P<0.05），見(jiàn)表1。    2.2  FHIT蛋白的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

13、60;   FHIT蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡無(wú)明顯的相關(guān)性（P>0.05），而與腫瘤的分化程度相關(guān)，分化程度越低，F(xiàn)HIT蛋白的表達(dá)缺失越明顯（P<0.05），見(jiàn)表2。表1  FHIT蛋白在正常舌粘膜組織表2  舌鱗狀細(xì)胞癌FHIT蛋白的表達(dá)    3  討論    FHIT是1996年Ohta等用外顯子捕獲方法獲得的新的候選抑癌基因，定位于染色體3p14.2，因其含有脆性位點(diǎn)FRA3B，具有不穩(wěn)定性，故命名為脆性組氨酸三聚體。它是組氨酸三聚體基因家族的成員之一，含有1

14、0個(gè)外顯子，其中外顯子59組成開(kāi)放閱讀框架（ORF），編碼147個(gè)氨基酸16.8KD的蛋白。FHIT蛋白是一種典型的二腺苷三磷酸(Ap3A)水解酶，可水解ApnA(n=36)成為ADP和AMP，Mn2+和Mg2+可刺激其活性，而Zn2+可抑制其活性。許多研究表明，在生理狀態(tài)下，F(xiàn)HIT基因存在于大多數(shù)正常組織，而在多種腫瘤組織中如頭頸癌、食管癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等都有不同程度的減少甚至缺失，并發(fā)現(xiàn)與FHIT基因轉(zhuǎn)錄及缺失有關(guān)，包括等位基因的缺失、基因重排以及細(xì)胞基因的異常。有學(xué)者認(rèn)為在人上皮性癌細(xì)胞中普遍存在FHIT基因雜合子和/或純合子的缺失2。FHIT基因失活尤其發(fā)生在那些暴露于

15、致癌環(huán)境而形成的上皮性來(lái)源的腫瘤中。本研究發(fā)現(xiàn)FHIT蛋白在正常舌粘膜的陽(yáng)性表達(dá)率為75.0%，而且多為強(qiáng)陽(yáng)性。在舌鱗狀細(xì)胞癌中有60.0%存在FHIT蛋白的減少或缺失，這與以往口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究結(jié)果基本一致37。    有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HIT基因的低表達(dá)隨著腫瘤分化程度的降低和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有增強(qiáng)趨勢(shì)。也有研究表明，F(xiàn)HIT的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)及腫瘤的增殖活性成負(fù)相關(guān)，并且FHIT表達(dá)丟失的患者趨向于不良預(yù)后，即與短期生存率有關(guān)8。Lee等3對(duì)41例舌鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本的研究顯示28例出現(xiàn)FHIT表達(dá)缺失（68%），而且FHIT表達(dá)缺失與疾病自然存活時(shí)間的長(zhǎng)短呈顯著相關(guān)性

16、，與腫瘤大小和疾病所處階段有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)FHIT的失表達(dá)與舌鱗狀細(xì)胞癌的病理學(xué)分級(jí)具有相關(guān)性(P0.05),而與患者的年齡、性別無(wú)關(guān)。    本研究還發(fā)現(xiàn)，在正常舌粘膜組織中，F(xiàn)HIT蛋白表達(dá)于基底細(xì)胞和棘層細(xì)胞，而角化層及粒層基本無(wú)表達(dá)，這與 Van Heerden1 的初次研究結(jié)論不太一致。但后來(lái)該作者同樣用免疫組化的方法以三種不同來(lái)源的FHIT抗體對(duì)正?？谇徽衬そM織的表達(dá)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用Zymed GSTFHIT時(shí)在基底細(xì)胞和基底旁細(xì)胞強(qiáng)染色7，這與我們的研究結(jié)果一致，而KCC GSTFHIT則相反。說(shuō)明用不同來(lái)源的抗體，F(xiàn)HIT蛋白的表達(dá)部位可能會(huì)有

17、所不同，但在正?？谇徽衬ぃòㄉ嗾衬ぃ┑膹?qiáng)陽(yáng)性表達(dá)卻都是一致的。    本研究中還有少數(shù)幾例正常舌粘膜出現(xiàn)FHIT蛋白的減少甚至缺失，可能與該基因的不穩(wěn)定性及多態(tài)性有關(guān)，它們是否具備正常功能，目前還不清楚，有待于進(jìn)一步探討。    關(guān)于FHIT的抑癌機(jī)制，可能以FHIT蛋白與其相互作用蛋白的結(jié)合為主，而以水解酶的作用次之911。FHIT在腫瘤發(fā)生中的作用尚不十分清楚，可能因其失活引起Ap3A或類似復(fù)合物在體內(nèi)的積累，刺激DNA聚合酶合成DNA，使細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞周期G1期控制點(diǎn)，進(jìn)入S期，也可能因其失活后細(xì)胞對(duì)外界應(yīng)激能力下降而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)

18、化。    綜上所述，F(xiàn)HIT基因的改變可能在舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，F(xiàn)HIT的失表達(dá)可能是診斷舌鱗狀細(xì)胞癌和判斷其預(yù)后的一個(gè)有用指標(biāo)。但FHIT在舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生中的機(jī)制及與其他諸多基因改變的復(fù)雜關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。    【參考文獻(xiàn)】  1 Van Heerden WF, Swart TJ, Van Heerden MB, et al. Immunohistochemical evaluation of FHIT protein expression in oral squamous cell

19、carcinomaJ. Oral Pathol Med, 1999, 28(10):433437     Roce CM, Sozzi G, Huebner K. Role of FHIT in human cancerJ. J Clin Oncology, 1999, 117(5): 16181624     Lee JI, Soria JC, Hassan K, et al. Loss of FHIT expression is a predictor of poor outcome in tongue can

20、cerJ. Cancer Res, 2001, 61(3):837841     Tanimoto K, Hayashi S, Tsuchiya E, et al. Abnormalities of the FHIT gene in human oral carcinogenesisJ. British J Can, 2000, 82(4):838843     Uzawa N, Akanuma D, Negishi A, et al. Homozygous deletions on the short arm o

21、f chromosome 3 in human oral squamous cell carcinomasJ. Oral Oncol, 2001, 37(4):351356     Chang KW, Kao SY, Tzeng RJ, et al. Multiple molecular alterations of FHIT in betelassociated oral carcinomaJ. J Pathol, 2002, 196(3):300306     Van Heerden WF, Swart TJ, Van Heerden MB, et al. FHIT protein expression in oral epithelium: immunohistochemical evaluation of three antiseraJ. Anticancer Res, 2001, 21(4A):24192423     Yang Q