抗體融合蛋白

1、抗體融合蛋白 目錄 抗體融合蛋白的定義 抗腫瘤抗體藥物的發(fā)展趨勢(shì) VEGF-EGFR 多靶向 Fc 融合蛋白 EVP1 的構(gòu)建及其結(jié)合特性 抗體融合蛋白將抗體分子片段與其他蛋白融合，可得到多樣性生物功能的融合蛋白如： 1.含F(xiàn)v段的抗體融合蛋白：將Fv與某些毒素、酶、細(xì)胞因子基因拼連，通過(guò)這些抗體的引導(dǎo)，可將其生物活性物質(zhì)導(dǎo)向靶細(xì)胞特定部位，所謂“生物導(dǎo)彈”。 2.嵌合受體：將ScFv與某些細(xì)胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白，可表達(dá)于細(xì)胞表面，稱為嵌合受體，由于其介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)不受MHC限制，在過(guò)繼性免疫治療中有潛在應(yīng)用價(jià)值。 3.含F(xiàn)c的抗體融合蛋白：CD4分子細(xì)胞膜外部分與Fc融合后由真核

2、細(xì)胞表達(dá)。此融合蛋白能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HIV，阻斷HIV對(duì)敏感細(xì)胞的感染；還可介導(dǎo)ADCC及CDC，可通過(guò)胎盤(pán)。 抗體藥物 抗體藥物是以細(xì)胞工程技術(shù)和基因工程技術(shù)為主體的抗體工程技術(shù)制備的藥物。其具有特異性高、性質(zhì)均一及針對(duì)特定靶點(diǎn)定向制備等優(yōu)點(diǎn)?？贵w藥物主要用于惡性腫瘤、免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)、感染性疾病和心血管疾病等的治療，特別是其對(duì)腫瘤治療的應(yīng)用前景備受關(guān)注。 抗腫瘤抗體藥物的分類(lèi) 按抗腫瘤抗體藥物結(jié)構(gòu)可將其分為 4 類(lèi) 1.抗體，也稱裸抗體。根據(jù)其人源化的程度，又可分為鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、完全人源抗體。 2.抗體片段，包括 Fab、單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、微型抗體等。 3.

3、抗體偶聯(lián)物，由抗體或抗體片段與“彈頭”藥物連接而成?？捎米鳌皬楊^”的物質(zhì)有放射性核素、化學(xué)治療 ( 化療 ) 藥物和毒素。這些“彈頭”物質(zhì)與抗體連接，分別構(gòu)成放射免疫偶聯(lián)物、化學(xué)免疫偶聯(lián)物和免疫毒素。 4.抗體融合蛋白，由抗體片段和活性蛋白兩部分構(gòu)成。 抗腫瘤抗體藥物的特點(diǎn) 抗體藥物有以下幾個(gè)特點(diǎn) 1.具有高親和性和特異性，使得抗體藥物高效特異性地發(fā)揮靶向治療作用。 2.半衰期短，平均為 1021 d，從而減少了使用次數(shù)，易被患者接受。 3.多樣性，主要表現(xiàn)為靶抗原的多樣性，抗體結(jié)構(gòu) ( 抗原互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸序列變化 ) 的多樣性和作用機(jī)制的多樣性以及“彈頭”化合物的多樣性。 4. 制備抗腫瘤

4、抗體藥物的定靶性；即根據(jù)需要利用基因工程技術(shù)制備具有不同治療作用的抗體藥物。可以針對(duì)特定的靶分子，定向制備相應(yīng)的抗體；也可以根據(jù)需要選擇相應(yīng)的“彈頭”藥物或效應(yīng)分子，制備相應(yīng)的免疫偶聯(lián)物或融合蛋白。 抗腫瘤抗體藥物的發(fā)展趨勢(shì) 抗腫瘤抗體藥物由單一靶點(diǎn)到多靶點(diǎn)方向發(fā)展 抗腫瘤抗體藥物的高效小型化 抗體組學(xué)和抗體組藥物的興起 近年來(lái)單克隆抗體 單抗 藥物發(fā)展迅猛， 僅2010 年全球就有 30 余個(gè)單抗藥物經(jīng)批準(zhǔn)上市銷(xiāo)售， 已產(chǎn)生500 億美元以上的年銷(xiāo)售額。然而， 對(duì)于復(fù)雜的惡性腫瘤， 其病因復(fù)雜， 細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路冗余或交叉， 單一靶點(diǎn)的治療適用性窄且易產(chǎn)生耐藥性， 因而多靶向藥物已成為抗體領(lǐng)域

5、的重要發(fā)展方向。 現(xiàn)在應(yīng)用較多的已上市的單克隆抗體藥物，有針對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的利妥昔單抗、曲妥珠單抗、吉非替尼、厄洛替尼、伊馬替尼、?？颂婺岷臀魍孜魡慰?，以及針對(duì)腫瘤新血管生成的貝伐珠單抗等一大批分子靶向藥物 這些抗腫瘤抗體藥物都是針對(duì)單一的靶點(diǎn)，但是腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的過(guò)程，從單一靶點(diǎn)對(duì)腫瘤治療是遠(yuǎn)不夠的。 從 2005 年以來(lái)臨床研究證實(shí)，索拉非尼等多靶點(diǎn)藥物 可使晚期腎癌 患者的無(wú)進(jìn)展生存期延長(zhǎng)一倍。 阻斷其他通路的藥物，如注射用的mTOR 抑制藥替西羅莫司和口服的 mTOR 抑制藥依維莫司，相繼在 2007年和 2010 年也獲 FDA 批準(zhǔn)上市。非小細(xì)胞肺癌的靶

6、向治療除了吉非替尼 和厄洛替尼等單靶點(diǎn)藥物以外，凡德他尼和索拉非尼也在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，初步結(jié)果令人鼓舞。 2009 與 2011 年，生物制藥巨頭 Genentech 公司基于“two-in-one”策略，相繼開(kāi)發(fā)了同時(shí)靶向 VEGF 與 HER2，以及同時(shí)靶向 EGFR 與 HER3 的雙特異性抗體，療效明顯優(yōu)于針對(duì)單個(gè)靶標(biāo)的單抗治療，在國(guó)際上引起強(qiáng)烈反響 雙特異性抗體 抗體兩個(gè)結(jié)合點(diǎn)表現(xiàn)為不同的特異性，即分別結(jié)合不同表位。 如，一個(gè)結(jié)合靶細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞），另一結(jié)合藥物或免疫效應(yīng)細(xì)胞（如蓖麻毒素、抗癌藥物、細(xì)胞毒性細(xì)胞）雙特異性抗體雙特異性抗體 左明輝等于 2012 年研制出種同時(shí)結(jié)合 VE

7、GF，EGFR，HER2 的 Fc 融合蛋白EVP1，是一種富有潛力的多靶向抗體類(lèi)治療腫瘤藥物。VEGF-EGFR 多靶向 Fc 融合蛋白 EVP1 的構(gòu)建 方法： 1.利用 PCR 方法擴(kuò)增 Herin 基因和 Flt-1 基因 Ig 樣第二結(jié)構(gòu)域 FLt-1D2 編碼序列， 全序列合成帶有點(diǎn)突變的 Human IgG1 的 Fc 段編碼序列， 利用重組 PCR 方法將 Herin、 Flt-1D2和 Fc 基因依次連接， 構(gòu)成 Herin-Flt-1D2-Fc 基因 命名為 EVP1 基因 。 2.再將 EVP1 編碼基因插入質(zhì)粒 pDC659， 構(gòu)建攜帶 EVP1基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒 p

8、DC659-EVP1。 3.將質(zhì)粒 pDC659-EVP1 與腺病毒骨架載體 pPE3-F35 共轉(zhuǎn)染至 293 細(xì)胞， 包裝獲得表達(dá)EVP1 融合蛋白的非增殖型腺病毒 Ad5/35-EVP1， 經(jīng) PCR 鑒定， 擴(kuò)增、 純化病毒， 采用 50% 組織培養(yǎng)感染劑量 TCID50 法測(cè)定病毒滴度。 4.用 MOI =11 的腺病毒 Ad5/35-EVP1 感染293 細(xì)胞， 4 d 后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。采用硫酸銨鹽析法和 Protein G 親和層析對(duì)融合蛋白 EVP1 進(jìn)行純化。 5.Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中融合蛋白 EVP1 的表達(dá)， ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞

9、培養(yǎng)上清液中融合蛋白 EVP1 的含量。 6.采用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)和 Octet Red 96 生物分子相互作用分析儀對(duì)融合蛋白 EVP1 的靶向結(jié)合特性進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。 結(jié)果： 成功包裝出腺病毒 Ad5/35-EVP1， 滴度為 5. 4 109PFU/ml。腺病毒 Ad5/35-EVP1-293細(xì)胞系統(tǒng)能有效表達(dá)融合蛋白 EVP1； MOI =11 時(shí)， 融合蛋白 EVP1 的表達(dá)量為 1 613. 94 24. 65 ng/ml。蛋白 EVP1 與高表達(dá) EGFR 的 A431 細(xì)胞和高表達(dá) HER2 的人卵巢癌 SK-OV-3 細(xì)胞有良好的結(jié)合能力， 與抗原 EGFR、HER2、

10、VEGF 結(jié)合的親和力常數(shù) KD分別為 4. 55、 18. 70 和 0. 63 nmol/L。 結(jié)論： 成功制備多靶向融合蛋白 EVP1， 它能高效結(jié)合 VEGF、 EGFR 受體家族成員， 具有良好的抗腫瘤臨床應(yīng)用價(jià)值。 實(shí)驗(yàn)表明，構(gòu) 建 獲 得 的 融 合 蛋 白 EVP1 與 VEGF，EGFR，HER2 的親和力常數(shù) Kd 分別達(dá)到 0.63，4.55 及 18.7 nmol/L，EVP1 與 VEGF 的親和力高于阿瓦斯 汀 (Kd 1.8 nmol/L)， 與 EGFR，HER2 的 親和力分別略低于艾比特思 (Kd 0.39 nmol/L)、 曲妥珠單抗 (Kd 5 nmol

11、 /L)。 EVPI 與雙特異性抗體相比，結(jié)合不同靶標(biāo)的單元相對(duì)獨(dú)立，在結(jié)合一類(lèi)抗原 ( 如 VEGF) 后仍保持結(jié)合另一類(lèi)抗原( 如 EGFR) 的活性，可能具有更強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)；結(jié)合的抗原范圍更廣 ( 包括 VEGF 以及除 HER3之外的所有 EGFR 家族成員 )，適合幾乎所有類(lèi)型腫瘤的治療；選用的 Fc 段經(jīng)過(guò)功能區(qū)的突變改造，能介導(dǎo)更強(qiáng)的、抗體依賴性的、細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)，具有更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期；構(gòu)成融合蛋白的各肽段均來(lái)源于人體天然蛋白， 免疫原性低，不易產(chǎn)生中和抗體。因而，該融合蛋白具有潛在 的抗腫瘤臨床應(yīng)用價(jià)值。 目錄 抗體融合蛋白的定義 抗腫瘤抗體藥物的發(fā)展趨勢(shì) VEGF-E

12、GFR 多靶向 Fc 融合蛋白 EVP1 的構(gòu)建及其結(jié)合特性 現(xiàn)在應(yīng)用較多的已上市的單克隆抗體藥物，有針對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的利妥昔單抗、曲妥珠單抗、吉非替尼、厄洛替尼、伊馬替尼、?？颂婺岷臀魍孜魡慰?，以及針對(duì)腫瘤新血管生成的貝伐珠單抗等一大批分子靶向藥物 這些抗腫瘤抗體藥物都是針對(duì)單一的靶點(diǎn)，但是腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的過(guò)程，從單一靶點(diǎn)對(duì)腫瘤治療是遠(yuǎn)不夠的。 雙特異性抗體 抗體兩個(gè)結(jié)合點(diǎn)表現(xiàn)為不同的特異性，即分別結(jié)合不同表位。 如，一個(gè)結(jié)合靶細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞），另一結(jié)合藥物或免疫效應(yīng)細(xì)胞（如蓖麻毒素、抗癌藥物、細(xì)胞毒性細(xì)胞）VEGF-EGFR 多靶向 Fc 融合蛋白 EVP1

13、的構(gòu)建 方法： 1.利用 PCR 方法擴(kuò)增 Herin 基因和 Flt-1 基因 Ig 樣第二結(jié)構(gòu)域 FLt-1D2 編碼序列， 全序列合成帶有點(diǎn)突變的 Human IgG1 的 Fc 段編碼序列， 利用重組 PCR 方法將 Herin、 Flt-1D2和 Fc 基因依次連接， 構(gòu)成 Herin-Flt-1D2-Fc 基因 命名為 EVP1 基因 。 2.再將 EVP1 編碼基因插入質(zhì)粒 pDC659， 構(gòu)建攜帶 EVP1基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒 pDC659-EVP1。 3.將質(zhì)粒 pDC659-EVP1 與腺病毒骨架載體 pPE3-F35 共轉(zhuǎn)染至 293 細(xì)胞， 包裝獲得表達(dá)EVP1 融合蛋白的非增殖型腺病毒 Ad5/35-EVP1， 經(jīng) PCR 鑒定， 擴(kuò)增、 純化病毒， 采用 50% 組織培養(yǎng)感染劑量 TCID50 法測(cè)定病毒滴度。 EVPI 與雙特異性抗體相比，結(jié)合不同靶標(biāo)的單元相對(duì)獨(dú)立，在結(jié)合一類(lèi)抗原 ( 如 VEGF) 后仍保