質粒DNA小量快速提取(堿裂解法) S2517實驗室 第三組

1、質粒DNA的小量快速提?。▔A裂解法）S2517實驗室 第三小組2015年11月17日目錄Content一、實驗目的二、實驗原理三、實驗器材與試劑四、實驗操作五、思考題一、實驗目的掌握堿裂解法抽提質粒的原理、步驟及各主要試劑的作用。注釋：質粒（plasmid）:大小在1kb200kb之間，結構簡單，大多是具有雙鏈閉合環(huán)狀結構的DNA分子，通常以超螺旋狀態(tài)存在于許多細菌和酵母菌中。質粒具有不相容性，兩種不同的質粒不能共存在同一個宿主細胞中。質粒可在細胞間傳遞，其在胞內的存在一般對宿主細胞的代謝活動無影響。SDS:十二烷基硫酸鈉,用于核酸抽提操作中破壞細胞壁及裂解核酸。經SDS處理后，細菌染色體DN

2、A會纏繞附著在細胞碎片上，同時由于細菌染色體DNA比質粒大得多，易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。氨芐西林:（2S， 5R，6R)-3，3-二甲基-6-（R)-2-氨基-2-苯乙酰氨基-7-氧代-4-硫雜-1-氮雜雙環(huán)3.2.o庚烷-2-甲酸三水化合物，為半合成的廣譜青霉素。本實驗中，大腸埃希菌對其敏感，通過與青霉素結合蛋白（PBPs）結合，干擾細菌細胞壁的合成起到抗菌作用。Tris-HCl：三（羥甲基）氨基甲烷；氨丁三醇；緩血酸銨；三羥甲基氨基甲烷。在這里，Tris緩沖液主要是做核酸和蛋白質的溶劑。EDTA：四乙酸二氨基乙烷（二氨基乙烷四乙酸），又叫托立龍、依地酸。ED

3、TA 是一種重要的絡合劑。EDTA用途很廣，可用作彩色感光材料沖洗加工的漂白定影液，染色助劑，纖維處理助劑，化妝品添加劑，血液抗凝劑，穩(wěn)定劑，合成橡膠聚合引發(fā)劑，EDTA是螯合劑的代表性物質。能和堿金屬、稀土元素和過渡金屬等形成穩(wěn)定的水溶性配合物。在這里主要作用是降低細胞膜的穩(wěn)定性。TE緩沖液:TE是由Tris和EDTA配置而成的，呈弱堿性,主要用于溶解DNA，能穩(wěn)定儲存DNA。RNase A：是一種被詳細研究和具有廣泛應用的5核酸內切酶。RNase A 對RNA有水解作用，但對DNA則不起作用。RNase A專一地催化RNA的核糖在C（胞嘧啶）和U（尿嘧啶）殘基下一個核苷酸的5磷酸二酯鍵裂開

4、，形成具有 2,3-環(huán)磷酸衍生物3C或3U寡聚核苷酸。如 pG-pG-pC-pA-pG 被切割產生pG-pG-pCp 和 A-pG?？梢杂脕砣コ鼶NA制品中的污染RNA。 DNase：脫氧核糖核酸酶。是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內切酶。二、實驗原理 在含有SDS的堿性條件下，細菌細胞壁破裂，釋放出來的染色體DNA、質粒DNA和蛋白質等都發(fā)生變性。當加入酸性的醋酸鉀溶液將pH中和至中性時，質粒DNA為共價閉合環(huán)狀結構，很快復性并溶解在溶液中。而染色體DNA由于相對分子質量大難以復性而形成纏連的網狀結構。通過離心，纏結的染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子

5、RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去;然后用酚/氯仿抽提進一步除去少量殘留的蛋白質；最后用乙醇沉淀獲得質粒DNA。三、實驗器材與試劑（一）器材 高壓滅菌器，恒溫搖床，高速離心機，微量可調試移液器，1.5mL離心管等。（二）試劑 1.LB液體培養(yǎng)基 胰蛋白胨10 g，酵母提取物5g,NaCl 10 g,去離子水950mL。待溶質完全溶解后，用NaOH調節(jié)pH至7.0，加入去離子水至總體積1000mL，121，1.01105 Pa高壓蒸汽滅菌20min。 2.氨芐西林 100 mg/mL。 3.溶液一 50 mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) ,

6、 10mmol/L EDTA (pH 8.0)。 4.溶液二 （新鮮配制） 0.2mol/L NaOH , 1 SDS。 5.溶液三 0.5mol/L醋酸鉀60 mL , 冰醋酸11.5 mL ，H2O 28.5 mL。 6.酚/氯仿 將酚和氯仿等體積混合，用Tris-HCl平衡至pH 7.6 ， 置于棕色瓶中4保存。 7.TE緩沖液（pH 8.0) 10mol/L Tris-HCl (pH 8.0) , 1mmol/L EDTA 8.RNase A (10 mg/mL)。 9.70%乙醇、無水乙醇。四、實驗操作 1.細菌培養(yǎng) 將含有pQE30質粒的大腸埃希菌TG1 10 L 接種到10 mL

7、含氨芐西林（100 g/mL)的LB培養(yǎng)液中，37振搖過夜。 2.收集細菌 取1.5 ml菌液轉入離心管中，10000 r/min離心1 min，棄上清。 3.懸浮細菌 將細菌沉淀重懸于100 L用冰預冷的溶液一中，劇烈振蕩使細菌沉淀懸浮。 注意：細胞懸液必須懸浮均勻，無可見沉淀塊，否則所提質粒DNA的純度及得率會大大降低。 溶液一的作用是分散細胞，并鰲合金屬離子使能夠破壞質粒DNA的DNase失活。 4.堿液裂解 加200 L新配制的溶液二。輕緩顛倒離心管68次，使管內內容物混勻，禁止劇烈振蕩。置冰浴中放置2min。 溶液二的作用是使細菌細胞壁破裂釋放內容物，核酸和蛋白質在堿性條件下變性。

8、5.中和與復性 加150L用冰預冷的溶液三。輕緩顛倒數次，使溶液三在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，隨后置冰浴中5 min。 溶液三的作用是使pH恢復中性，質粒DNA復性，而染色體DNA與蛋白質-SDS復合物形成白色沉淀。 6.離心沉淀 用臺式高速離心機12000 r/min 離心5 min，將含有質粒DNA的上清轉入另一離心管中。 7.酚/氯仿抽提除蛋白 加等體積酚-氯仿，劇烈振蕩混勻，靜置3 min待其分層后，12000 r/min離心10 min，將上層液轉入另一離心管中。 8.乙醇沉淀質粒DNA 加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混合，靜置5min使質粒DNA形成沉淀。12000 r/min 離

9、心10 min，收集質粒DNA沉淀，棄上清液。 9.乙醇洗鹽 質粒DNA沉淀里含有一定量的鹽分需除去。加1 ml 70%乙醇，輕緩搖動數次，12000 r/min離心2 min。棄上清液。 10.溶解質粒DNA 待殘余乙醇揮發(fā)干凈后，加30 L TE緩沖液（pH 8.0）溶解沉淀，加2 L RNase A (10 mg/mL), 37保溫30min以去除RNA。所得質粒DNA置-20保存?zhèn)溆谩Ｙ|粒DNA的還有以下幾種提取方法：煮沸裂解；羥基磷灰石柱層析法，質粒DNA釋放法；酸酚法等但堿裂解法有操作簡便、快速、得率高的優(yōu)點。五、思考題 1.溶液一，二，三的作用分別是什么？加溶液一、二、三時要注意哪些問題? 溶液一的作用是分散細胞，并鰲合金屬離子使能夠破壞質粒DNA的DNase失活。溶液一使用前需用冰預冷。 溶液二的作用是使細菌細胞壁破裂釋放內容物，核酸和蛋白質在堿性條件下變性。溶液需要新鮮配制。 溶液三的作用是使pH恢復中性，質粒DNA復性，而染色體DNA與蛋白質-SD