植物基因工程講稿

1、第八章第八章 植物基因工程載體及其構(gòu)建植物基因工程載體及其構(gòu)建第一節(jié)第一節(jié) 植物基因工程載體種類植物基因工程載體種類第二節(jié)第二節(jié) 根癌農(nóng)桿菌根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能第三節(jié)第三節(jié) Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化機(jī)理質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化機(jī)理第四節(jié)第四節(jié) Ti質(zhì)粒的改造及載體構(gòu)建質(zhì)粒的改造及載體構(gòu)建第五節(jié)第五節(jié) 常用選擇標(biāo)記和報(bào)告基因常用選擇標(biāo)記和報(bào)告基因植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)l l 1.載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體、Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體、病毒轉(zhuǎn)化載體）體、病毒轉(zhuǎn)化載體）l l 2. DNA直接導(dǎo)入轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（原生質(zhì)體、基因槍）直接導(dǎo)入轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（原生質(zhì)體、

2、基因槍）l l 3.種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（花粉管通道法、生殖細(xì)胞浸泡法、種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（花粉管通道法、生殖細(xì)胞浸泡法、胚囊子房注射法）。胚囊子房注射法）。 載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是目前植物基因工程中使用最多、載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是目前植物基因工程中使用最多、機(jī)理最清楚、技術(shù)最成熟的、最重要的一種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)機(jī)理最清楚、技術(shù)最成熟的、最重要的一種轉(zhuǎn)化系統(tǒng),其中又以其中又以Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體最為重要。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體最為重要。 第一節(jié)第一節(jié) 植物基因工程載體種類植物基因工程載體種類 根據(jù)其功能和構(gòu)建過程，可分為以下種類。根據(jù)其功能和構(gòu)建過程，可分為以下種類。（1）目的基因克隆載體：其功能是保存和克隆目的基因。與）目的基因克隆載體：其功

3、能是保存和克隆目的基因。與微生物基因工程相似，通常是由多拷貝的微生物基因工程相似，通常是由多拷貝的E. Coli小質(zhì)粒為載小質(zhì)粒為載體。體。（2）中間克隆載體：是構(gòu)建中間表達(dá)載體的基礎(chǔ)質(zhì)粒。是由）中間克隆載體：是構(gòu)建中間表達(dá)載體的基礎(chǔ)質(zhì)粒。是由大腸桿菌質(zhì)粒插入大腸桿菌質(zhì)粒插入T-DNA片段、目的基因和標(biāo)記基因等構(gòu)建片段、目的基因和標(biāo)記基因等構(gòu)建而成。而成。（3）中間表達(dá)載體：是含有植物特異啟動子的中間載體。是）中間表達(dá)載體：是含有植物特異啟動子的中間載體。是構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體的質(zhì)粒。構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體的質(zhì)粒。（4）卸甲載體：是解除武裝的）卸甲載體：是解除武裝的Ti質(zhì)?；蛸|(zhì)粒或Ri質(zhì)粒，是構(gòu)建轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，是構(gòu)

4、建轉(zhuǎn)化載體的受體質(zhì)粒。載體的受體質(zhì)粒。（5）植物基因轉(zhuǎn)化載體：是最后用于目的基因?qū)酥参锛?xì)胞）植物基因轉(zhuǎn)化載體：是最后用于目的基因?qū)酥参锛?xì)胞的載體，亦稱工程載體。它是由中間表達(dá)載體和卸甲載體構(gòu)的載體，亦稱工程載體。它是由中間表達(dá)載體和卸甲載體構(gòu)建而成。建而成。 第二節(jié) 根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能 一、Ti質(zhì)粒的遺傳特性、結(jié)構(gòu)及功能二、T-DNA的基因結(jié)構(gòu)與功能三、Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能 一、Ti質(zhì)粒的遺傳特性、結(jié)構(gòu)及功能1. Ti質(zhì)粒的遺傳特性及類型lTi質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價閉合的環(huán)狀DNA分子，其分子量為95156106D, 約有200kb組成。l根據(jù)

5、其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同，Ti質(zhì)?？梢员环殖伤姆N類型：章魚堿型(octopine)、胭脂堿型(nopaline)、農(nóng)桿堿型（agropine）和農(nóng)桿菌素堿型（agrocinopine）或稱琥珀堿型(succinamopine)2. Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域Ti質(zhì)?？煞譃樗膫€區(qū)。（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNA regions）： T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，稱為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。（2）Vir區(qū)（virulence region）該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒

6、性，故稱之為毒區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰，約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一。（3）Con區(qū)（regions encoding conjugations）該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。（4）Ori區(qū)（origin of replication）該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。 3. Ti質(zhì)粒的生物學(xué)功能Ti質(zhì)粒的功能可歸為以下7個方面:參與寄主細(xì)胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一些細(xì)胞分裂素的活動。誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤并決定所誘導(dǎo)的腫瘤

7、的形態(tài)學(xué)特征和冠癭堿成分。賦予寄主菌株具有分解代謝各種冠癭堿化合物的能力。賦予寄主菌株對土壤桿菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素的反應(yīng)性。為農(nóng)桿菌提供附著于植物細(xì)胞壁的能力。決定寄主菌株的植物寄主范圍。有的Ti質(zhì)粒能夠抑制某些根瘤土壤桿菌噬菌體生長與發(fā)育，即具有對噬菌體的“排外性”。二、T-DNA的基因結(jié)構(gòu)與功能1.T-DNA的發(fā)現(xiàn) Chilton等人（1982）利用同位素標(biāo)記的Ti質(zhì)粒做探針發(fā)現(xiàn)，加入高濃度煙草腫瘤細(xì)胞的DNA后，Ti質(zhì)粒DNA的復(fù)性速度有加快的趨勢。這表明腫瘤DNA中有Ti質(zhì)粒的順序，但該順序不多，而且沒有檢測到完整的Ti質(zhì)粒。以后這些作者將章魚堿型的Ti質(zhì)粒B6-806用內(nèi)切酶Sma I分

8、解成19個片段，分別用同位素標(biāo)記做成探針，然后與腫瘤DNA進(jìn)行分子雜交，結(jié)果有二段Ti質(zhì)粒的DNA（3b和10c。）能和腫瘤DNA雜交，也就是Ti質(zhì)粒中這兩段DNA是與腫瘤DNA同源的部分。進(jìn)一步研究證明，這部分DNA是從質(zhì)粒DNA上切割后，轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞，故稱之為轉(zhuǎn)移DNA（transferred-DNA）。這是首次證明在高等植物的細(xì)胞內(nèi)存在有微生物的DNA順序。2.T-DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)lTi質(zhì)粒T-DNA區(qū)的長度約為23kblT-DNA僅存在于植物腫瘤細(xì)胞的核DNA中；T-DNA含有激發(fā)和保持腫瘤狀態(tài)所必需的基因；T-DNA和植物DNA之間沒有同源l在T-DNA的5端和3端都有真核表達(dá)信號

9、。如TATAbox、AATAAbox及polyA等。lT-DNA的兩端左右邊界各為25bp的重復(fù)序列，即邊界序列（border sequence），分別稱之為左邊界（BL或TL）和右邊界（BR或TR）。(圖8-4)。該25bp邊界序列屬保守序列,但通常右邊界（TR）序列更為保守，左邊界(TL)序列在某些情況下有所變化。其核心部分是14bp，可分為10bp(CACGATATAT)及4bp(GTAA)兩部分,是完全保守的。左邊界（TL）缺失突變?nèi)阅苤铝?但右邊界（TR）缺失則不再能致瘤,這里幾乎完全沒有T-DNA的轉(zhuǎn)移,這說明右邊界(TR)在T-DNA轉(zhuǎn)移中的重要性。 3. T-DNA上的編碼基因

10、及功能上的編碼基因及功能T-DNA的轉(zhuǎn)錄有下述共同點(diǎn)：T-DNA的兩條鏈都是有意義鏈,即都能被轉(zhuǎn)錄。T-DNA上每個基因都有各自的啟動子。基因的轉(zhuǎn)錄由植物細(xì)胞RNA聚合酶完成。T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和終止的調(diào)節(jié)信號，在其5端轉(zhuǎn)錄起始處有TATA和CAAT盒。同時AATAAA加尾信號也在同一條鏈上發(fā)現(xiàn)，故T-DNA的轉(zhuǎn)錄機(jī)理可能與真核生物相同。植物或農(nóng)桿菌中可能有甲基化或去甲基化的調(diào)節(jié)基因活性。T-DNA區(qū)基因的功能區(qū)基因的功能研究方法：用遺傳學(xué)方法在T-DNA區(qū)中引入轉(zhuǎn)座子，使特定的基因發(fā)生突變，從而在腫瘤細(xì)胞中T-DNA的一個或多個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也隨之消朱。基因突變后不能轉(zhuǎn)錄出它

11、所編碼的 mRNA，這時可觀察到帶有突變基因的T-DNA的植物細(xì)胞的表型，從而確定這些基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的功能。用這種方法證明了編碼兩類轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的基因序列： T-DNA區(qū)區(qū)編碼的基因編碼的基因第一類是編碼冠癭堿合成酶及分解代謝基因。第二類是致瘤基因，前兩個基因被稱作為生長素基因（Aux）。Aux基因突變將誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞莖芽產(chǎn)生,因此Aux基因后來被稱作Tms （tumour morphology shoot）基因，即腫瘤形態(tài)莖芽基因或Shi（shoot induction）基因，即莖芽抑制基因。目前已查明，實(shí)際上Aux基因包括兩個基因，一個是Aux-l（Tms-1），編碼色氨酸單加氧酶（typtoph

12、an mono-oxygenase），將色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚乙酰胺（indol acetamid，IAM），故現(xiàn)在也稱為Iam基因；另一個是Aux-2,編碼吲哚乙酰胺水解酶，將IAM轉(zhuǎn)變成乙酸吲哚IAA，現(xiàn)稱為iaaH基因。第三個基因是細(xì)胞分裂素基因（cyt），其突變將引起易生根特性。故稱為Tmr（tumour morphology root）基因，即腫瘤形態(tài)根基因或Roi（root induction）基因，即根抑制基因。 Cyt基因編碼異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（isopentenyltransferase），催化異戊烯基焦磷酸鹽（isopentenylpyrophosphate）和AMP形成細(xì)胞分裂素即

13、異戊烯基-AMP（isopentenyl-AMP），故現(xiàn)稱為Ipt基因。T-DNA區(qū)區(qū)編碼基因的功能編碼基因的功能Aux基因突變將阻斷腫瘤細(xì)胞生長素的大量合成，使細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞分裂素與生長激素的比值升高。野生型腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞分裂素與生長素的比值為022，而突變型該值上升到14.4，因此有利于芽的形態(tài)發(fā)生。同時Cyt基因突變將會阻斷細(xì)胞分裂素的大量合成，兩者之間的比值下降到0.02，因此有利于根的形態(tài)發(fā)生。正是由于Tms和Tmr基因的表達(dá)，使轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞內(nèi)激素平衡紊亂，冠癭瘤細(xì)胞無限生長，形成激素自主性特性，引起癌變。Tms和Tmr基因是致瘤所必須的基因，因此又稱它們?yōu)橹铝龌颍╫nc gene）

14、。三、Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能 1. Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)除T-DNA外，Ti質(zhì)粒的vir區(qū)也是農(nóng)桿菌致瘤所必須的。Vir區(qū)僅位于T區(qū)DNA左側(cè)。兩者之間的距離常隨Ti質(zhì)粒類型不同而有差異:Octopine的間隔距離較大,而Nopaline間隔距離很小。Octopine Ti質(zhì)粒的Vir區(qū)大小為40bp,含有VirA、B、C、D、E、F、G、H(舊稱PinF)等8個操縱子(operon),共24個基因。它們協(xié)同調(diào)節(jié)，形成一個調(diào)控子(regulon),起共調(diào)控作用(co-regulation)。而Nopaline有7個操縱子,比Octoppine少一個VirF操

15、縱子。 2. VirA操縱子的誘導(dǎo)表達(dá)及功能對VirA基因進(jìn)行順序分析發(fā)現(xiàn), VirA是單個基因組成,分子大小為2.8kb，僅編碼一條多肽。Vir基因在接受植物細(xì)胞產(chǎn)生的創(chuàng)傷信號分子后才能轉(zhuǎn)錄活化，其中首先是VirA編碼一種結(jié)合在膜上的化學(xué)受體蛋白（membrane bound chemoreceptor protein， 92kD），可直接對植物產(chǎn)生的酚類化合物感應(yīng)，稱為感應(yīng)蛋白（sensor）。當(dāng)AS與TM-2受體部位結(jié)合后，會使整個VirA蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，其C端活化。VirA蛋白的胞質(zhì)區(qū)有自激酶（autokinase）的功能，可在保守的組氨酸殘基上磷酸化，從而VirA蛋白被激活。磷酸化

16、的VirA蛋白具有轉(zhuǎn)移其磷酸鹽至VirG蛋白的能力，使VirG蛋白激活。3. VirG操縱子的誘導(dǎo)表達(dá)及功能 VirG操縱子小于VirA，只有1.0kb，同樣是單基因結(jié)構(gòu)，只能編碼一條多肽，被稱為VirG蛋白，即DNA結(jié)合活化蛋白（DNA-binding activator protein）。它的C端已知有DNA結(jié)合活性。它的N未端部分具有磷酸化的酸性結(jié)構(gòu)。當(dāng)磷酸化的A蛋白將其磷酸基轉(zhuǎn)到VirG蛋白（30kD）保守的天冬氨酸鹽殘基上時，使VirG蛋白活化。活化的VirG蛋白可能以二體或多體形式結(jié)合到Vir區(qū)啟動子的特定區(qū)域，從而成為其它Vir基因轉(zhuǎn)錄的激活因子，打開VirB、C、D、E、H等幾

17、個基因。并己證明，VirA或VirG突變后會減弱或完全失去對其它Vir位點(diǎn)活化的誘導(dǎo)。VirA及VirG的這種調(diào)控作用被稱為雙因子調(diào)控體系（two一component regu1atory system）。4. VirH、F及及Tzs操縱子的誘導(dǎo)表達(dá)及其功能操縱子的誘導(dǎo)表達(dá)及其功能這些基因?qū)|(zhì)粒是特異性的，在Octopine中有VirF、VirH，在Nopaline中有Tzs。 VirH：可能對植物產(chǎn)生的某些殺菌或抑菌化合物起解毒作用，從而使農(nóng)桿菌的生長不受這些物質(zhì)的抑制，可增強(qiáng)致瘤能力。Tzs：大部分Nopaline菌株的Ti質(zhì)粒上均有Tzs基因,即轉(zhuǎn)運(yùn)玉米素合成酶基因（trans-zeat

18、in synthease gene），在細(xì)菌中表達(dá)后將玉米素分泌到細(xì)胞外。該細(xì)胞分裂素被植物所吸收后，能促進(jìn)農(nóng)桿菌感染部位的植物組織脫分化和細(xì)胞分裂，提高植物對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的感受性。VirF操縱子編碼一個23kD蛋白，它與任何數(shù)據(jù)庫中所有蛋白質(zhì)的序列無明顯同源性。最近采用報(bào)告基因連接插入法研究發(fā)現(xiàn)，VirF在T-DNA運(yùn)輸時發(fā)揮作用。第三節(jié) 農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化機(jī)理已知農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞后，只留在細(xì)胞間隙中。T-DNA首先在細(xì)菌中被加工、剪切、復(fù)制，然后轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并非整個Ti質(zhì)粒都進(jìn)入植物細(xì)胞。該基因轉(zhuǎn)化過程是一個復(fù)雜的遺傳工程。一、T-DNA的加工及轉(zhuǎn)移Vir基因操縱子系統(tǒng)被活化后，在

19、農(nóng)桿菌中可測到單鏈T-DNA（ss T-DNA，亦稱T鏈或正鏈），T鏈的形成取決于VirD1及VirD2兩種蛋白，這些蛋白一起決定內(nèi)切酶活性，在邊界重復(fù)序列的特定位點(diǎn)形成切口，產(chǎn)生單鏈斷裂。因?yàn)門鏈的合成是從右邊界至左邊界，即53，若右邊界缺失，則T鏈的合成便無法開始，故目前認(rèn)為T-DNA是以T鏈形式向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移的，而不是雙鏈的T-DNA分子。左邊界作為DNA合成起始點(diǎn)的效率比右邊界低，這并不是因?yàn)樽蟆⒂疫吔绲暮塑账嵝蛄杏惺裁床煌且驗(yàn)樵谟疫吔绲挠疫吋s17bp的超驅(qū)動序列，它可使T鏈的形成大大增加，故被稱作為“轉(zhuǎn)化增強(qiáng)子（transfer enhancer或overdrive），除去增強(qiáng)

20、子序列導(dǎo)致菌株致病力消失。T鏈的形成過程如圖8-1示出。1. T-DNA的復(fù)制首先是在下鏈（或稱底鏈bottom strand）25bp重復(fù)序列的右邊界左起第3和第4堿基間缺口剪切，然后從缺口3端開始合成新的DNA鏈，并一直延伸到左邊界第22堿基處，置換出原來的下鏈，形成ssDNA，即T鏈。Nopaline T-DNA在缺口剪切后形成包括左右邊界在內(nèi)的單一T鏈，但Octopine T-DNA在剪切后則可形成6種T鏈，即TL、TC、TR、TL-TC、TC-TR,以及TL-TC-TR，這意味著邊界序列的剪切是相互獨(dú)立的。2. VirD1及VirD2的功能 VirD1（16kD）及VirD2（47K

21、d）蛋白與T-DNA的加工有關(guān)，它決定在邊界重復(fù)序列的特定位點(diǎn)上形成切口，產(chǎn)生T鏈斷裂。VirD1及virD2突變，T-DNA邊界便不能缺口剪切并形成T鏈。這種缺口剪切可分成兩步：VirDl首先與25bp邊界序列親和結(jié)合，使邊界序列松弛，然后使VirD2可在特異位點(diǎn)剪切。VirD2至少有兩個功能，特異剪切，并與T鏈的5端共價結(jié)合,應(yīng)當(dāng)指出,農(nóng)桿菌并非以裸露的DNA分子轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞,而是T鏈的5端與VirD2蛋白共價結(jié)合,這樣可使T鏈的5端不受核酸酶的攻擊。導(dǎo)向功能。已知僅VirD2蛋白分子N-端的50%已足以缺口剪切,形成T鏈。VirD2蛋白分子的另一半即C端可作為核定位的信號,引導(dǎo)T鏈進(jìn)到植

22、物的細(xì)胞核,故稱這為“向?qū)А?。這是因?yàn)镃端含有特異的氨基酸序列(核靶序列,nuclear targetng sequence)之故。 3. VirC的功能 VirC編碼兩種蛋白VirC1及VirC2蛋白。VirC1蛋白可特異地與Octopine Ti質(zhì)粒上的超驅(qū)動序列結(jié)合,從而促進(jìn)T-DNA邊界序列的缺口剪切。若VirC操縱子突變，則侵染性減弱。當(dāng)VirD1、VirD2不足時, VirC1有促進(jìn)T-DNA加工的作用，但當(dāng)VirD1、VirD2高量表達(dá)時,則VirC1對T鏈的形成無作用。VirC2蛋白的功能尚不清楚。 其它Vir基因產(chǎn)物與邊界缺口剪切及T鏈形成無關(guān)。二、T鏈蛋白復(fù)合體的形成及Vi

23、rE的功能 T鏈必須橫向跨越細(xì)菌細(xì)胞膜、細(xì)菌細(xì)胞壁、植物細(xì)胞壁、植物細(xì)胞膜及核膜，才能整合進(jìn)植物基因內(nèi)。在此全部轉(zhuǎn)動過程中，鏈必須避免被核酸降解，因此鏈可能以一種DNA-蛋白復(fù)合體(簡稱T鏈復(fù)合體或T復(fù)合體)的形式存在。目前已知至少有兩種Vir特異蛋白即VirE2及VirD2與T鏈復(fù)合體的形成有關(guān)。VirE2的功能: 編碼ssDNA結(jié)合蛋白,該蛋白(60.5kD)可非特異地與任何ssDNA結(jié)合。通達(dá)與鏈非共價結(jié)合，VirE2可包被T鏈,形成細(xì)長的核-蛋白絲,因而可能在T-DNA轉(zhuǎn)移過程中起保護(hù)T 鏈的作用,使ssDNA抗3和5外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶。VirE2與ssDNA結(jié)合后,可使ssDNA

24、解折疊和伸長(約50%),形成一種很細(xì)的蛋白。故VirE2不僅保護(hù)ssDNA,而且T使鏈形變成一種可轉(zhuǎn)運(yùn)的形式。三、三、T鏈復(fù)合體的轉(zhuǎn)運(yùn)及鏈復(fù)合體的轉(zhuǎn)運(yùn)及VirB的功能的功能如上所述,T鏈復(fù)合體至少包括T鏈, VirD2及VirE2。VirD2及VirE2可能已足以保護(hù)鏈并對鏈的轉(zhuǎn)運(yùn)起導(dǎo)向作用，但鏈的轉(zhuǎn)運(yùn)無疑還需要其它活性物質(zhì)。這種活性物質(zhì)可能來自蛋白質(zhì)，可以是細(xì)菌和/或植物的特異蛋白。若為細(xì)菌蛋白，則可能是VirB蛋白。因?yàn)殒溵D(zhuǎn)運(yùn)的第一步是通過細(xì)菌細(xì)胞膜，因此首先必須形成跨膜孔道，需有跨膜或膜結(jié)合蛋白的參與。 1. 跨膜或膜結(jié)合蛋白有兩個主要特性(1) 穿膜通常需在蛋白質(zhì)的N端有一信號肽序列

25、，這種蛋白可能獨(dú)立地或在類似伴隨蛋白受體幫助下穿越細(xì)菌內(nèi)膜（IM），特異肽酶在N端信號序列處剪切，產(chǎn)生成熟蛋白，并停止繼續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)。(2) 有富含疏水殘基的約20個氨基酸的密接伸長段（contiguous stretches）。向IM轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)可以（但非必須）在其N端含剪切的信號序列，但疏水伸長段則有錨式功能，使蛋白質(zhì)駐留（1odging）在膜上。2. VirB的功能對Ti質(zhì)粒的VirB操縱子序列分析表明，VirB操縱子有11個基因組成，其中絕大多數(shù)編碼跨膜蛋白或膜結(jié)合蛋白。VirB蛋白中的10個基因產(chǎn)物具有很好的跨膜拓?fù)涮匦?，其?個已被確定為外膜蛋白，一個為內(nèi)膜蛋白。因此這些蛋白可能一起在膜

26、上形成一種類似于細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移時從供體菌轉(zhuǎn)至受體菌所必需的結(jié)構(gòu)，即接合孔（conjugative pole）或性毛（sex pilus），T-DNA通過這種孔由細(xì)菌通過這種孔由細(xì)菌進(jìn)入植物細(xì)胞進(jìn)入植物細(xì)胞。同時，VirB也可能起運(yùn)輸和提供能量的作也可能起運(yùn)輸和提供能量的作用。用。已知VirB7在Vir蛋白中最小，含信號肽，無跨膜區(qū)，它卻能通過細(xì)菌內(nèi)膜，至外膜定位，它也可能是一種裂解蛋白（lysisprotein），起部分裂解農(nóng)桿菌的作用，使T復(fù)合體從細(xì)菌細(xì)胞中運(yùn)出，或因其定位在外膜上，可促進(jìn)與植物細(xì)胞表面相互作用。VirB11基因上有ATP結(jié)合位點(diǎn)，最近發(fā)現(xiàn)VirB11蛋白確有ATP酶活性，因此

27、它可能在T-DNA轉(zhuǎn)移中起提供所需能量的作用。四、T鏈復(fù)合體靶向植物細(xì)胞核 目前已知VirD2及VirE2上有核定位信號(nuclear localizing signal,簡稱NLS)。前已指出，VirD2端50%已足以特異的剪切T-DNA的邊界序列,C端50%則含NLS。在VirE2中也有類似的序列，將其與Gus融合作為報(bào)告基因，證明virE2可使融合蛋白導(dǎo)向植物細(xì)胞核，但VirE2與VirD2相比，其核定位功能較弱。綜上所述，VirD2可能以一種極性方向，首先將T復(fù)合體定向至核孔，而vir E2則作為一種促進(jìn)因子，保證很長的T復(fù)合體在進(jìn)入核孔時不受干擾。VirD2及VirE2蛋白上的核定

28、位信號與動物相似，說明植物和動物的這種信號從進(jìn)化上講是保守的。 五、五、T鏈整合植物基因組鏈整合植物基因組的分子機(jī)理的分子機(jī)理 1. 整合位點(diǎn)及其特性遺傳作圖的分析表明，T-DNA在植物染色體中的插入是隨機(jī)的。它可插入任何一條植物染色體。但插入位點(diǎn)常插入位點(diǎn)常有以下特點(diǎn)：有以下特點(diǎn)：T-DNA優(yōu)先整合到轉(zhuǎn)錄活躍的植物基因位點(diǎn)；T-DNA與植物DNA連接處富含A，T堿基對；植物DNA上的插入靶位點(diǎn)與T-DNA邊界序列有一定程度的同源性。Matsumoto等人認(rèn)為正是由于這種同源性才使得插入的T-DNA和靶序列能互相靠近，并有效地發(fā)生DNA鏈的交換。非常有趣的是他們還發(fā)現(xiàn)在植物基因組靶序列附近有一

29、段（dG-dT）10序列。這種（dG一dT）10是真核基因組中保守的高度重復(fù)序列。當(dāng)DNA處于負(fù)超螺旋時，該重復(fù)序列極易形成Z-DNA，使位于它附近的序列部分解旋，為DNA重組、T-DNA插入提供位點(diǎn)。2. T-DNA的整合機(jī)理 Mayerhofer等從轉(zhuǎn)化的擬南芥菜中分離并測定插入的T-DNA及插入位點(diǎn)序列，發(fā)現(xiàn)T-DNA的插入使得靶序列缺失2973bp。一部分整合的T-DNA片段不完整，兩端均有缺失。靶序列斷裂處與插入的T-DNA兩端有部分重疊。另一部分整合的T-DNA卻保持完整。其中一些插入的T-DNA能精確地取代植物靶序列，其右邊界與靶序列連接，T-DNA左未端和靶序列裂口同源。還有一

30、種情形則是，T-DNA插入片段的未端與缺失的靶序列裂口處并無同源性，而是在其內(nèi)部有部分短片段與T-DNA未端同源。在靶序列裂口處還發(fā)現(xiàn)有DNA序列的倒位或重復(fù)。T-DNA的整合是異常重組（illegitimaterecombination）的結(jié)果。T-DNA右未端在靶序列的識別及連接中是必需的，T-DNA左未端和兩個靶DNA未端則參與部分配對和DNA修復(fù)。3. T-DNA整合的遺傳效應(yīng) T-DNA插入的位點(diǎn)不同，可使轉(zhuǎn)基因植物具有不同的表型和遺傳特性，即所謂位點(diǎn)效應(yīng)（position effect）。已知T-DNA可插入多個物理位點(diǎn)。遺傳位點(diǎn)數(shù)一般少于或等于插入的物理位點(diǎn)數(shù)，這是因?yàn)榧谆墒?/p>

31、基因不表達(dá)，或者幾個拷貝連鎖在一起。多拷貝的T-DNA可插入不同的獨(dú)立位點(diǎn)，或可首尾串聯(lián)（trandem）插入同一位點(diǎn)，多拷貝T-DNA進(jìn)人同一植物細(xì)胞后，這些拷貝之間可能相互作用，導(dǎo)致基因的沉默，這種現(xiàn)象現(xiàn)被稱為共抑制（co-supression）。T-DNA插入的遺傳特性：(1)T-DNA的插入不引起植物DNA大的重排。但多數(shù)插入會導(dǎo)致靶位點(diǎn)處小的缺失，缺失多至79個核苷酸。(2)另一個常見的結(jié)果是，在T-DNA植物DNA連接處，會有幾個至33個核苷酸的“填充”DNA（Filler DNA）存在，這些“填充”DNA的序列與靠近連接處的植物DNA序列相似。(3)在植物靶位處不要求有特異的序列

32、，但若在T-DNA兩端和植物靶位處之間有一段短序列（510b）同源，則可以在整合中起作用。六、農(nóng)桿菌染色體基因?qū)-DNA轉(zhuǎn)移的調(diào)控目前已發(fā)現(xiàn)位于細(xì)菌染色體上的一些基因也和T-DNA的轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且已經(jīng)了解它們編碼的蛋白質(zhì)的功能。ChvA、ChvB、ChvC參與細(xì)菌的附著功能；Cel位點(diǎn)與細(xì)菌表面纖維絲的合成有關(guān);Att基因影響農(nóng)桿菌細(xì)胞表面蛋白的合成；ivr基因的突變能使農(nóng)桿菌細(xì)胞表面的脂多糖發(fā)生改變而影響農(nóng)桿菌宿主范圍；PscA和ExoC基因與多糖合成有關(guān)，并影響農(nóng)桿菌附著能力。以上這些基因的突變將使細(xì)菌表面成分發(fā)生變化，從而喪失與植物細(xì)胞識別和結(jié)合的能力。此外，ChvD位點(diǎn)影響AS對毒性

33、區(qū)的誘導(dǎo)效率和農(nóng)桿菌的致瘤能力。CbvE位點(diǎn)編碼一個單糖結(jié)合蛋白，與單糖影響Vir區(qū)的表達(dá)有關(guān)。Ros基因與Vir基因的負(fù)調(diào)節(jié)有關(guān)。可見，目前已知農(nóng)桿菌染色體上有10個基因與T-DNA轉(zhuǎn)移有關(guān)。第四節(jié) 農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的改造及載體構(gòu)建 一、Ti質(zhì)粒的改造及卸甲載體構(gòu)建二、中間載體的構(gòu)建三、中間表達(dá)載體的構(gòu)建四、植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建一、Ti質(zhì)粒的改造及卸甲載體構(gòu)建野生型野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體，存在如下質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體，存在如下障礙：障礙：Ti質(zhì)粒分子量過大，一般在160240kb，比pBR322質(zhì)粒大50倍左右，在基因工程中難以操作；大型的野生Ti質(zhì)粒上分布著各種

34、限制酶的多個切點(diǎn)，不論用何種限制酶切割，都會被切成很多片段，因此難以找到可利用的單一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，不能通過體外DNA重組技術(shù)直接向野生型Ti質(zhì)粒導(dǎo)入外源基因；T-DNA區(qū)內(nèi)含有許多編碼基因，其中Onc基因的產(chǎn)物干擾宿主植物中內(nèi)源激素的平衡，轉(zhuǎn)化細(xì)胞長成腫瘤，阻礙細(xì)胞的分化和植株的再生；Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制, 即使得到重組質(zhì)粒，也只能在農(nóng)桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增；而農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化率極低（10左右）,因此，通過Ti質(zhì)粒的體外操作，在常規(guī)分子克隆條件下幾乎不能構(gòu)建在T-DNA中只有單一切點(diǎn)的載體；Ti質(zhì)粒上還存在一些對于T-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。 為了使Ti質(zhì)粒成為有效的外源基因?qū)胼d體，必

35、須對野生型對野生型Ti質(zhì)粒進(jìn)行一番科學(xué)的改造質(zhì)粒進(jìn)行一番科學(xué)的改造。十分幸運(yùn)的是，大腸桿菌具有能與農(nóng)桿菌高效地接合轉(zhuǎn)移的特性。因此，科學(xué)家們可以先將T-DNA片段克隆到大腸桿菌的質(zhì)粒中，并插入外源基因，最后通過接合轉(zhuǎn)移把外源基因引入到農(nóng)桿茵的Ti質(zhì)粒上，這是一種把預(yù)先進(jìn)行亞克隆、切除、插入或置換的T-DNA引入Ti質(zhì)粒的有效方法。帶有重組T-DNA的大腸桿菌質(zhì)粒衍生載體稱為”中間載體”（intermediate vector），而接受中間載體的Ti質(zhì)粒則稱為受體Ti質(zhì)粒（acceptor Ti p1asmid），一般是卸甲載體（disarmed vector）。1Onc-卸甲載體 所謂卸甲載體

36、就是無毒的（non-oncogenic）Ti質(zhì)粒載體。因?yàn)槔靡吧偷腡i質(zhì)粒作載體時，影響植株再生的直接原因是T-DNA中Onc基因的致瘤作用。因此，為了使野生型的Ti質(zhì)粒成為基因轉(zhuǎn)化的載體，必須切除T-DNA上的Onc基因，即“解除”其“ 武裝”,構(gòu)建成所謂“卸甲”或稱“繳械”載體（disarmed vector）。在這種Onc-載體中，已經(jīng)缺失的T-DNA部位被大腸桿菌的一種常用的質(zhì)粒pBR322取代。這樣任何適合于克隆在 pBR322質(zhì)粒中的外源DNA片段，都可以通過與 pBR322質(zhì)粒DNA的同源重組，而被共整合到Onc-Ti質(zhì)粒載體上。2. Onc十十卸甲載體 對于研究外源基因在轉(zhuǎn)

37、基因植株中的表達(dá)，以及對于以改良農(nóng)作物為目的的植物基因工程而言， Onc一體系是最有用的。不過，人們可能還要設(shè)計(jì)一些特殊的實(shí)驗(yàn)來研究外源基因在冠癭瘤組織中的表達(dá)問題。在這種情況下，使用Onc十 菌株載體則比較合適。由于冠癭瘤組織具有不依賴于激素的表型特征，所以這種載體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于它可以快速地增生冠癭組織，比較快速而容易得到轉(zhuǎn)化體。二、中間載體的構(gòu)建 1. 中間載體的基本結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)為解決Ti質(zhì)粒不能直接導(dǎo)入目的基因的困難，構(gòu)建中間載體（intermediate vector ）是有效方法之一。中間載體是一種在一個普通大腸桿菌的克隆載體（例如pBR322質(zhì)粒）中插入了一段合適的T-DNA片段，而

38、構(gòu)成的小型質(zhì)粒。中間載體通常是多拷貝的E.Coli小質(zhì)粒，這一點(diǎn)對于通過體外遺傳操作導(dǎo)入外源基因是非常必要的。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)看可分為兩類中間載體，即共整合系統(tǒng)中間載體和雙元載體系統(tǒng)中間載體。共整合系統(tǒng)中間載體的特征中間載體必須含有與Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)同源的序列，此外含有pBR的序列，在其被引入到根癌農(nóng)桿菌后即可高頻地與Ti質(zhì)粒的T-DNA的同源序列進(jìn)行重組；它應(yīng)具有一個或幾個細(xì)菌選擇標(biāo)記，這將有利于篩選共整合質(zhì)粒；它必須 有bom位點(diǎn)，在有誘導(dǎo)質(zhì)粒存在的情況下，bom位點(diǎn)的存在可以使中間載體在不同細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移；它應(yīng)該含有陽性植物選擇標(biāo)記，以利于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的篩選，例如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(ne

39、omycin phosphotransferase,Npt-)基因，其可賦予轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞卡那霉素抗性；它應(yīng)該含有單一的限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，以利于外源基因的插入；無Ti質(zhì)粒的邊界序列。雙元載體系統(tǒng)的中間載體與共整合系統(tǒng)中間載體不同之處是無同源序列；具有LB和RB;無Co1E1復(fù)制點(diǎn) 三、中間表達(dá)載體的構(gòu)建中間載體從功能看可分為兩大類，即克隆載體和表達(dá)載體?？寺≥d體的主要功能是復(fù)制和擴(kuò)增基因；表達(dá)載體是適于在受體細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。 上述構(gòu)建的中間載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞后，插入的外源基因能否得到表達(dá)是一個十分重要的問題。研究表明，早期曾通過各種中間載體引入的外源基因，如轉(zhuǎn)座子的

40、抗生素抗性基因、酵母的乙醇脫氫酶基因、動物的-珠蛋白基因和干擾素基因等，均未能在植物中表達(dá)。這是因?yàn)檫@些外源基因都缺乏特異啟動子的緣故，后來的研究發(fā)現(xiàn)，在中間載體中加上能在植物細(xì)胞中表達(dá)的各種啟動子后，可使外源基因能在植物細(xì)胞中表達(dá)。這類含植物 特 異 啟 動 子 的 中 間 載 體 就 稱 為 中 間 表 達(dá) 載 體（intermediate expression vector）。1啟動子及其它調(diào)控序列轉(zhuǎn)錄的調(diào)控對真核生物基因表達(dá)起著關(guān)鍵性作用。就真核生物基因表達(dá)調(diào)控序列而言，大多數(shù)真核生物在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的5端上游區(qū)第30至25bp處具有TATA盒，在70至 80bp處還有CAAT盒。在大多數(shù)

41、真核生物基因的3端具有AATAA序列。這些5和3端的調(diào)控序列對真核生物的基因表達(dá)起著關(guān)鍵性作用。Ti質(zhì)粒雖然來源于農(nóng)桿菌， 但其Nos、Ocs、Tmr等基因具有與真核生物啟動子類似的TATA盒和CAAT盒，均能在植物細(xì)胞中表達(dá)，并且無組織特異性。因此，它們成為早期構(gòu)建嵌合基因的啟動子，其中以Nos啟動子（pNos）最常用。1啟動子及其它調(diào)控序列近年來的研究發(fā)現(xiàn),來自花椰菜花葉病毒DNA的CaMV的35s啟動子能使嵌合的外源基因在植物細(xì)胞中表達(dá)，并表現(xiàn)出強(qiáng)烈的表達(dá)功能。由CaMV35s啟動子、外源結(jié)構(gòu)基因及Nos3端的非編碼區(qū)域組成的嵌合基因，能在植物細(xì)胞中很快高效表達(dá)。 CaMV35s啟動子既

42、無組織特異性，又不受發(fā)育時期的影響，是一個理想的植物基因工程的啟動子。另外，近年來也發(fā)現(xiàn)，19s啟動子亦能使嵌合基因在植物細(xì)胞中表達(dá)。近年來，從植物基因中分離出組織特異表達(dá)啟動子及誘導(dǎo)表達(dá)啟動子，為實(shí)現(xiàn)外源基因的定時、定位高效表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。 2.嵌合基因（chimeric gene）構(gòu)建所謂嵌合基因就是來自兩種或兩種以上生物的啟動子、結(jié)構(gòu)基因、終止子連接在一起構(gòu)成基因。3 中間表達(dá)載體的構(gòu)建過程中間表達(dá)載體是由中間載體加上能在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動子及基因構(gòu)成，也就是嵌合基因插入中間載體后構(gòu)成，所以中間載體的構(gòu)建是一個十分復(fù)雜的過程。 下面以pLGV2381為例簡要地說明其構(gòu)建過程。（見圖8-

43、1）四、植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建上述構(gòu)建的中間表達(dá)載體仍然不能直接作為植物外源基因轉(zhuǎn)化的載體，因?yàn)橹虚g表達(dá)載體仍是一種細(xì)菌的質(zhì)粒，不能把外源基因轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞。因此，必須進(jìn)一步把中間載體引入到上述已改造的受體Ti質(zhì)粒中，并構(gòu)建成能侵染植物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化載體，才能應(yīng)用于植物基因的轉(zhuǎn)化。它是由兩種以上質(zhì)粒構(gòu)成的復(fù)合型載體，故稱之為載體系統(tǒng)。近年來的研究已經(jīng)建立許多種載體系統(tǒng)，但目前主要采用兩種Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化載體系統(tǒng)，即一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)。1一元載體系統(tǒng)的構(gòu)建這一類載體是中間表達(dá)載體與改造后的受體Ti質(zhì)粒之間，通過同源重組所產(chǎn)生的一種復(fù)合型載體，通常亦稱為共整合載體（co-intergr

44、ated vecter），又由于該載體的T-DNA區(qū)與Ti質(zhì)粒Vir區(qū)連鎖，因此又稱之為順式載體（cis-vector）。一元載體的特點(diǎn)是:由兩個質(zhì)粒（E.coli質(zhì)粒和Ti質(zhì)粒）重組而成，分子量較大；共合體的形成頻率與兩個質(zhì)粒的重組頻率有關(guān),相對較低；必須用Southern雜交或PCR對大的共整合體質(zhì)粒進(jìn)行檢測；構(gòu)建時比較困難。一元載體系統(tǒng)目前主要有兩種載體：共整合載體和拼接未端載體（split-end vector,SEV）。 （1）共整合載體的構(gòu)建共整合載體的特點(diǎn)是：中間表達(dá)載體與受體Ti卸甲載體，通過同源重組共整合而構(gòu)建；中間表達(dá)載體與受體Ti質(zhì)粒之間同源序列是pBR322。共整合載體

45、的構(gòu)建過程l）中間載體pLGV1103導(dǎo)入農(nóng)桿菌:目前通常 采 用 兩 種 方 法 ， 即 接 合 轉(zhuǎn) 移 法（conjugativetransfer）和三親雜交轉(zhuǎn)移法。2）中間載體與受體Ti質(zhì)粒的同源重組。3）共整合載體的選擇。 （2） SEV的構(gòu)建SEV系統(tǒng)即T-DNA邊界拼接系統(tǒng)，亦稱拼接末端載體（sp1it-end vecter ,SEV）。它是由Freley等人于1985年建立的另一種共整合載體，也因?yàn)樗膬蓚€LIH序列在同源重組前分別處于不同質(zhì)粒上而得名。SEV與pGV3850的差異及構(gòu)建過程如下述：1）SEV的受體Ti質(zhì)粒的T-DNA上的致瘤基因（onc）及TR都已被缺失，T-D

46、NA的保留部分被稱為“左邊界內(nèi)部同源區(qū)”（1eft inside homcology，LIH）。該受體Ti質(zhì)粒還保留了Vir基因及其它正常的功能基因，同時還攜有用于細(xì)菌篩選的抗性基因。2）SEV中間載體具有一個細(xì)菌的抗性基因，一個植物抗性基因及與受體Ti質(zhì)粒同源的LIH序列及TR。 3）通過三親雜交將中間載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌后，由于它們之間都具有LIH同源序列，即可發(fā)生同源重組，形成SEV的共整合載體。 （3） SEV與pGV3850比較兩者都是通過受體Ti質(zhì)粒與中間載體同源重組而形成，故同屬于共整合的一元載體系統(tǒng)，但它們之間有著一定的差異：1）它們的受體Ti質(zhì)粒與中間載體的結(jié)構(gòu)不同。pGV3850

47、的左右邊界在一個受體Ti質(zhì)粒上，而SEV來自二個質(zhì)粒，即TR來自中間載體。、2）同源序列不同。 pGV3850重組的同源序列是pBR322，而SEV是LIH。3）SEV是更有效的共整合載體。由于pGV3850共整合載體，帶有大腸桿菌pBR322序列，外源基因嵌合在該序列中，因而轉(zhuǎn)化的植物中也帶有重復(fù)的pBR322序列。此重復(fù)序列可能對轉(zhuǎn)化植物中的外源基因的穩(wěn)定性有影響，而SEV系統(tǒng)則排除了這種可能。2雙元載體系統(tǒng)雙元載體（binary vecter）系統(tǒng)是指由兩個分別含T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒系統(tǒng),又因?yàn)槠銽-DNA與Vir基因在兩個獨(dú)立的質(zhì)粒上，通過反式激活T-D

48、NA轉(zhuǎn)移,故稱之為反式載體（trans vecter）.（1）雙元載體系統(tǒng)的構(gòu)建原理雙元載體主要包括兩個Ti質(zhì)粒，即微型Ti質(zhì)粒和輔助Ti質(zhì)粒。 Ti質(zhì)粒上的Vir基因與T-DNA具有反式互補(bǔ)作用，Vir基因可以反式激活T-DNA的轉(zhuǎn)移。其次，中間載體含有廣泛寄主范圍質(zhì)粒的復(fù)制起始點(diǎn)（oriV），而代替了共整合載體中用以重組的同源區(qū)，能夠在任何農(nóng)桿菌寄主里自發(fā)復(fù)制。（2）微型Ti質(zhì)粒（mini-Ti plasmid）雙元載體系統(tǒng)是在微型Ti質(zhì)?；A(chǔ)上產(chǎn)生的。所謂微型質(zhì)粒就是含有T-DNA邊界、缺失vir基因的Ti質(zhì)粒。Mini-Ti是一個廣譜質(zhì)粒，除含有T-DNA（左、右邊界）外，還具有廣譜質(zhì)

49、粒的復(fù)制位點(diǎn)oriV及選擇標(biāo)記基因。 Bevan等（1984）構(gòu)建的pBinl9微型質(zhì)粒（圖822）是應(yīng)用得最廣泛的Mini-Ti。它含有來自pTiT37的T-DNA左右邊界序列，在兩個邊界序列之間的T-DNA區(qū)含有植物選擇標(biāo)記NptII基因，以及來自噬菌體M13mpl9的多種酶連接接頭的LacZ基因。在LacZ基因內(nèi)部含有多克隆位點(diǎn)，外源基因可以便利地插入其間使其本身失活。此外，Binl9含有廣宿主質(zhì)粒Rk2的復(fù)制和轉(zhuǎn)移的起始位點(diǎn)。（3）輔助Ti質(zhì)粒含有Vir區(qū)段的Ti質(zhì)粒稱為輔助Ti質(zhì)粒（he1per Ti）。實(shí)際上輔助Ti質(zhì)粒是T-DNA缺失的突變型Ti質(zhì)粒，完全喪失了致瘤功能，因此是相

50、當(dāng)于在共整合載體系統(tǒng)中的卸甲Ti質(zhì)粒（disarmed Ti）。其主要作用是提供Vir基因功能，激活處于反式位置上的T-DNA轉(zhuǎn)移，該卸甲載體在此又稱之為輔助Ti質(zhì)粒（he1per Ti）。 最常用的輔助Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌LBA4404所含有的Ti質(zhì)粒pAL4404。其為章魚堿型Ti質(zhì)粒pTiAch5的衍生質(zhì)粒，其T-DNA區(qū)已發(fā)生缺失突變，但仍保存有完整的Vir基因功能。近年來的研究表明，野生型的Ti質(zhì)粒即不卸甲的Ti質(zhì)粒，同樣可以作為輔助Ti質(zhì)粒，而且具有更強(qiáng)毒性。 （4）雙元載體的構(gòu)建將Mini Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有He1per Ti質(zhì)粒根癌農(nóng)桿菌的途徑有兩條，一條是直接用純化的Mini

51、Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化速凍的根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞；另一條是與共整合載體構(gòu)建一樣，采用三親接合的方式。Mini Ti質(zhì)粒均能以E.coli的pRK2013為輔助質(zhì)粒，通過三親雜交而接合轉(zhuǎn)移到含有輔助Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)。由于E.coli的pRK2013不能在農(nóng)桿菌中復(fù)制最后消失，含有Mini Ti質(zhì)粒和He1per Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌可直接用于植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。 （5）一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)的比較綜上所述，雙元載體系統(tǒng)與一元載體系統(tǒng)之間有著較大的差異： 1）雙元載體不需要共整合過程，因此系統(tǒng)中的兩個質(zhì)粒不必含有同源序列。 2）Mini-Ti質(zhì)粒具有E.coli質(zhì)粒的復(fù)制位點(diǎn)、能在農(nóng)桿菌的寄主中復(fù)制，

52、使其質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加10100倍，而且Mini-Ti質(zhì)粒分子量?。?0kb），可以直接進(jìn)行體外遺傳操作。 3）雙元載體不需經(jīng)過兩個質(zhì)粒的共整合過程，因此構(gòu)建的操作步驟比較簡單。 4）由于mini-Ti質(zhì)粒較小，并無共整合過程，因此質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌比較容易，而且構(gòu)建的頻率較高。（5）一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)的比較5）由于根癌農(nóng)桿菌感染的寄主范圍是由Vir基因及染色體上的基因決定的，因此，使用雙元載體系統(tǒng)更便于根據(jù)轉(zhuǎn)化材料的來源不同選擇適宜的He1per系統(tǒng)。6）雙元載體在外源DNA轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞前，無需進(jìn)行同源重組，插入載體的外源基因變異可能要比pGV3850系統(tǒng)來得小。 7）共整合載體系統(tǒng)比雙

53、元載體系統(tǒng)更難以應(yīng)用，通常一個共整合載體在用于植物轉(zhuǎn)化之前，應(yīng)弄清Ti質(zhì)粒的拷貝數(shù)和大小，所以必須通過southern雜交來鑒定。8) 共整合載體的重組頻率很低，而雙元載體系統(tǒng)的兩個質(zhì)粒接合的頻率較高，一般至少高4倍，因此雙元載體的構(gòu)建頻率較高。9）共整合載體構(gòu)建成功后，工程菌的穩(wěn)定性較好，雙元載體穩(wěn)定性較差，容易丟失。10）雙元載體在外源基因的植物轉(zhuǎn)化中效率高于共整合載體。3載體卡盒當(dāng)一個動植物的外源基因插入轉(zhuǎn)錄載體后實(shí)現(xiàn)表達(dá)的水平高低十分重要，高效表達(dá)系統(tǒng)的建立在基因工程中非常有用。所以科學(xué)家們不斷地構(gòu)建一些復(fù)雜的載體來提供全部必須的表達(dá)信號。最近幾年來，更先進(jìn)的一代表達(dá)載體已得到發(fā)展。這

54、些載體以卡盒形式提供基因表達(dá)所需的全部信號，包括啟動子、終止子、增強(qiáng)子等。然后新的外源基因被插入到表達(dá)信號簇中間的唯一限制性切點(diǎn)，所以稱之為盒式載體。在植物基因轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建中同樣采用了上述原理構(gòu)建成載體卡盒。所謂載體卡盒(vecter cassette)（圖8-23）是將植物標(biāo)記基因、多克隆位點(diǎn)、細(xì)菌標(biāo)記基因和廣譜質(zhì)粒的復(fù)制和動員功能均集于一身的集裝箱似的載體系統(tǒng)。利用載體卡盒可以更便利地構(gòu)建基因轉(zhuǎn)化載體。五、載體構(gòu)建中常用的選擇標(biāo)記及報(bào)告基因如何選擇和篩選轉(zhuǎn)化體同樣是一個重要問題?？茖W(xué)家家一直試圖把轉(zhuǎn)化體帶上一個標(biāo)記，從而便于選擇和篩選。至今己建立了許多標(biāo)記基因，并已插入各種轉(zhuǎn)化載體中，作為一種標(biāo)記基因。（不論是選擇標(biāo)記基因還是篩選標(biāo)記基因，后者亦稱報(bào)告基因）都必須具備以下四個條件：編碼一種不存在于正常植物細(xì)胞中的酶；基因較小，可構(gòu)成嵌合基因；能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達(dá)；檢測容易，并且能定量分析。選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因除具有上述共同之處外，它們在功能和性質(zhì)上還有一定差異。選擇標(biāo)記基因的功能主要是該基因的產(chǎn)物給予植物細(xì)胞產(chǎn)生一種選擇壓力，致使未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長、發(fā)育與分化。而轉(zhuǎn)化細(xì)胞對該標(biāo)記產(chǎn)生抗性，不影響其生長等，從而將轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇出來，例如， Cat（氯霉抗性基因）。篩選標(biāo)記基因強(qiáng)調(diào)給轉(zhuǎn)化細(xì)胞帶上一種標(biāo)記，起報(bào)告和識