霉酚酸酯及地塞米松對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響

1、    霉酚酸酯及地塞米松對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞 功能的影響        摘要目的：研究霉酚酸酯，地塞米松對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響，進(jìn)一步探討這兩種免疫抑制劑抗炎作用的機(jī)制。方法：以臍靜脈來源的內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，通過建立體外內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生（angiogenesis）模型，觀察并比較了兩種免疫抑制劑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生，內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力（Scratchwoundclosureassay）和內(nèi)皮細(xì)胞增生（3H-TdR摻入）的影響。結(jié)果：霉酚酸酯對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞體外血管發(fā)生有著

2、較強(qiáng)的抑制作用，而地塞米松的抑制作用相對(duì)較弱。此外，霉酚酸酯還能顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和遷移能力，而地塞米松則對(duì)此無顯著作用。結(jié)論：在對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響上，霉酚酸酯具有比地塞米松更為廣泛和顯著的抑制效應(yīng)，這可能是霉酚酸酯對(duì)一些激素治療無效的血管炎患者仍有良好療效的分子機(jī)制之一。關(guān)鍵詞血管內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生霉酚酸酯 INFLUENCE OF MYCOPHENOLATE MOFETIL AND DEXAMETHASONE ON THE FUNCTION OF ENDOTHELIAL CELLSLIU HaoLIU ZhihongHUANG Haidong CHEN ZhaohongLI Yi

3、ngjian LI Leishi（Research Institute of Nephrology， Jinling Hospital， Nanjing University School of Medicine， Nanjing 210002）OBJECTIVE To explore the effect of mycophenolate mofetil（MMF） and dexamethasone（DEX） on endothelial cells METHODOLOGY A cell line of human umbilical vein endothelial cells （HUVE

4、C） from ATCC was used in the study In vitro angiogenesis assay model was established to verify the effect of MMF and DEX on the angiogenic activity in HUVEC The migration ability of HUVEC was measured by the scratch wound closure assay and the cell proliferation was determined by 3H-TdR incorporatio

5、n assay RESULTS MMF and DEX were found to inhibit angiogenesis of HUVEC in vitro， and this effect was more potent in MMF The migration and proliferation ability of HUVEC was inhibited significantly by MMF， but not DEX CONCLUSION As an immunosuppressant， MMF is not only effect on the lymphocytes， but

6、 also inhibit the angiogenesis， cell migration and proliferation of endothelial cells These effects of MMF are quite different from dexamethasonKey words vascular endothelial cells angiogenesis mycophenolate mofetil霉酚酸酯（mycophenolatemofetil，MMF）以其獨(dú)特的免疫抑制效應(yīng)，在抗移植物排斥反應(yīng)中的作用已得到了充分的肯定。在臨床實(shí)踐中我們發(fā)現(xiàn)，MMF對(duì)一些激素和

7、環(huán)磷酰胺治療無效的彌漫增生型（型）難治性狼瘡性腎炎有顯著的療效，其中以伴腎組織血管炎病變者效果尤為顯著1，2。MMF除了選擇性地抑制淋巴細(xì)胞增生外，還具有抑制粘附分子產(chǎn)生，抑制血管平滑肌細(xì)胞增生的作用3，4。MMF是否對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有直接的作用？其作用形式如何？目前國內(nèi)外尚無完整資料可考。本項(xiàng)研究以血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶細(xì)胞，通過建立體外內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生（angiogenesis）模型，分別觀察了MMF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生，內(nèi)皮細(xì)胞遷移以及內(nèi)皮細(xì)胞增生能力的影響，并與地塞米松進(jìn)行了比較，以期進(jìn)一步闡明MMF治療作用的機(jī)制，為指導(dǎo)MMF的臨床合理應(yīng)用提供依據(jù)。1材料與方法11藥品與試劑MMF在體內(nèi)需轉(zhuǎn)化

8、成具有活力的霉酚酸發(fā)揮其作用，因此，在實(shí)驗(yàn)中我們選用了霉酚酸進(jìn)行觀察。地塞米松，霉酚酸及堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF），血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF），纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）均購自Sigma公司。12細(xì)胞培養(yǎng)人臍靜脈來源的內(nèi)皮細(xì)胞系（humanumbilicalveinendothelialcells，HUVEC）購自美國ATCC。HUVEC在含10胎牛血清（FCS）的F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。13內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生體外模型的建立利用低濃度血清和血管發(fā)生因

9、子，建立體外血管發(fā)生模型。將HUVEC接種于FN預(yù)先包被的六孔板上，在含10FCS的F12培養(yǎng)基中生長至近融合狀態(tài)。將培養(yǎng)基換為含1FCS的F12繼續(xù)培養(yǎng)12h后，每孔加入bFGF10gL和VEGF15gL誘導(dǎo)血管發(fā)生57。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同濃度的地塞米松（1 molL，10 molL）及霉酚酸（10molL，50molL）共同孵育，每隔兩天用上述培養(yǎng)基換液一次。相位差顯微鏡下每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野，每12h觀察一次，記錄特定視野下細(xì)胞形成芽生狀管狀結(jié)構(gòu)數(shù)目以及管狀樣結(jié)構(gòu)的長度，連續(xù)觀察120 h。14內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力測定采用劃傷愈復(fù)測定（scratchwoundclosureassay）對(duì)內(nèi)

10、皮細(xì)胞遷移能力進(jìn)行檢測。HUVEC種于六孔板上，生長至融合狀態(tài)后以不含F(xiàn)CS的F12培養(yǎng)基靜止12h，以無菌刮鏟劃痕，造成細(xì)胞間的刮溝。用PBS沖洗兩次，加入不同濃度的霉酚酸及地塞米松，每孔隨機(jī)取三點(diǎn)標(biāo)記并于顯微鏡下觀察劃痕寬度的變化，每24h重復(fù)觀察一次，連續(xù)觀察2天8。15內(nèi)皮細(xì)胞增生能力測定采用3H-TdR摻入法測定HUVEC增生能力。正常培養(yǎng)下的HUVEC以胰酶-EDTA消化，用F1210FCS終止后調(diào)細(xì)胞濃度為3×107L，按100l孔接種于96孔板上，繼續(xù)以F1210FCS培養(yǎng)24h，隨后以無血清F12培養(yǎng)液靜止細(xì)胞24h，再分別加入不同濃度的地塞米松及霉酚酸在F1210

11、FCS培養(yǎng)液中繼續(xù)孵育24h，最后12h各孔均加入1Ci3H-TdR。處理完畢以胰酶-EDTA消化各組HUVEC，收集于玻璃濾紙上，干燥后加入閃爍液在液閃儀上記取其DPM值。16統(tǒng)計(jì)學(xué)方法組間差異采用t檢驗(yàn)，P值0.05為差異顯著。2結(jié)果21VEGF，bFGF可以在合適的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)HUVEC血管發(fā)生VEGF和bFGF是目前公認(rèn)的具有刺激血管發(fā)生作用的生長因子。它們的作用具有相加作用。我們發(fā)現(xiàn)用FN預(yù)先包被的培養(yǎng)板上，在含1FCS的F12液中同時(shí)加入bFGF10gL和VEGF15gL能成功地誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生。經(jīng)上述處理的內(nèi)皮細(xì)胞增生能力明顯下降，同時(shí)貼壁細(xì)胞的形態(tài)也發(fā)生了顯著的改變，表現(xiàn)

12、為細(xì)胞拉長，相鄰的細(xì)胞間常以管狀結(jié)構(gòu)相互聯(lián)接，胞體不規(guī)則并有芽生狀管狀結(jié)構(gòu)伸出，這種管狀結(jié)構(gòu)不斷延伸，隨后延胞體縱軸?？梢娪型该鞯目张莼蛄严冻霈F(xiàn)，排列成行或交織成網(wǎng)狀（1）。目前認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞的這些改變類似于其在體內(nèi)血管發(fā)生過程中的變化，可以作為體外研究內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生的基本模型511。故本項(xiàng)研究中我們采用這一模型來觀察不同免疫抑制劑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生的影響。Fig1AngiogenesisofendothelialcellsEndothelialcellsalignedthemselvesendtoendandelongated，thesproutsfromdifferentcellsconn

13、ectedtoformanetwork（phasecontrast，×200）22霉酚酸、地塞米松對(duì)HUVEC血管發(fā)生的影響我們分別以內(nèi)皮細(xì)胞芽生狀管狀結(jié)構(gòu)數(shù)目和管狀結(jié)構(gòu)長度為指標(biāo)，觀察了霉酚酸和地塞米松對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生的影響。雖然，霉酚酸和地塞米松對(duì)血管發(fā)生均有抑制作用，但其作用特點(diǎn)仍不盡相同。霉酚酸的作用比地塞米松強(qiáng)，尤其在抑制內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)方面。而地塞米松在維持細(xì)胞生存狀態(tài)方面比霉酚酸強(qiáng)，細(xì)胞在120h時(shí)仍大都存活，而霉酚酸處理的細(xì)胞則在108h就大部分脫落了（2A，B）。Fig2TheeffectofMMFandDEXonangiogenesisofHUVECinvitr

14、oAsproutsnumberfield，Bsproutlengthfield23霉酚酸及地塞米松對(duì)HUVEC遷移能力的影響本實(shí)驗(yàn)我們以劃傷愈復(fù)測定檢測兩種免疫抑制劑對(duì)HUVEC遷移能力的影響。實(shí)驗(yàn)中，融合狀態(tài)的HUVEC以無血清F12靜止后劃傷，再繼續(xù)孵育于無血清F12培養(yǎng)液中以抑制細(xì)胞增生，此時(shí)觀察到的HUVEC間劃痕的縮窄即可反映細(xì)胞的遷移能力：細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)，劃痕的縮窄便越顯著。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：地塞米松處理對(duì)HUVEC遷移能力無明顯影響，在48h里，地塞米松10 molL處理組HUVEC的劃痕縮窄了30.8，而地塞米松10 molL處理組的劃痕縮窄了29.8與正常對(duì)照組比無顯著性

15、差異，而霉酚酸兩組劑量的處理組均可使HUVEC的遷移能力明顯降低，這一效應(yīng)在第二天時(shí)更為顯著，且具有劑量依賴關(guān)系（表1）。Table1TheeffectofMMFandDEXonthemigrationabilityofHUVEC（n3）Treatment0-24h24h-48h0-48hControl13.815.214.5DEX105M14.616.215.4DEX106M15.614.214.9MMF10M9.28.9*9.1*MMF5010.67.1*8.8*P0.05 vscontrol 24霉酚酸及地塞米松對(duì)HUVEC體外增生能力的影響本實(shí)驗(yàn)中以3H-TdR摻入法測定了兩種免疫抑制

16、劑對(duì)HUVEC增生能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：地塞米松對(duì)HUVEC增生沒有明顯的影響，而霉酚酸則能顯著的抑制HUVEC的增生（3）。Fig3TheeffectofMMFandDEXontheproliferationofHUVECinvitro1：control；2：DEX1molL；3：DEX10 molL；4：MMF10 molL；5：MMF50molL*P0.05，vs13討論內(nèi)皮細(xì)胞增生是血管炎癥反應(yīng)的一個(gè)常見現(xiàn)象。在缺氧，炎癥因子刺激下可使局部VEGF產(chǎn)生增多，使血管的通透性增加，繼而以血管再生的形式參與血管炎癥損傷反應(yīng)。在這個(gè)過程中往往伴隨有細(xì)胞外基質(zhì)增生和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移12，13。腎臟

17、是一個(gè)血運(yùn)非常豐富的器官，腎小球獨(dú)特的二級(jí)毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)使內(nèi)皮細(xì)胞功能及其調(diào)控機(jī)制在腎臟病理情況下顯得尤為重要14，15。免疫抑制劑的應(yīng)用是腎臟疾病治療中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。以往有關(guān)免疫抑制劑作用機(jī)制的研究更多的還是局限于其對(duì)機(jī)體免疫活性細(xì)胞的影響。事實(shí)上，許多免疫抑制劑的作用是比較廣泛的：MMF不僅可以抑制細(xì)胞核酸代謝途徑中的限速酶（IMPDH）抑制淋巴細(xì)胞增生，而且還能通過抑制細(xì)胞內(nèi)糖蛋白的合成，從而抑制多種粘附分子如E-選擇素，P-選擇素，ICAM-1和VCAM-1及其配體的合成。此外，MMF對(duì)腎小球系膜細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞的增生也有抑制作用3，4。MMF對(duì)狼瘡性腎炎及其它血管炎顯著的療效提

18、示血管內(nèi)皮細(xì)胞有可能是它的效應(yīng)器官之一1，2，16。然而有關(guān)MMF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響目前尚無完整的報(bào)道。為了進(jìn)一步較全面的驗(yàn)證這個(gè)問題，我們首先建立了內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生的體外模型。內(nèi)皮細(xì)胞在低血清濃度誘導(dǎo)和bFGF及VEGF的刺激下，逐漸呈現(xiàn)出典型的血管發(fā)生的形態(tài)學(xué)改變。借助這個(gè)模型我們發(fā)現(xiàn)MMF能夠顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生，并且此作用明顯強(qiáng)于地塞米松。不僅如此，MMF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增生和內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力均有顯著的抑制作用，而地塞米松則沒有上述作用。以上結(jié)果表明，MMF與地塞米松對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用存在著顯著差異。MMF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有多重直接作用：MMF不僅可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生，而且對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞

19、遷移能力以及血管發(fā)生均有較強(qiáng)的抑制作用。本項(xiàng)研究以內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，論證了霉酚酸酯不同于地塞米松，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移和內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生等諸多方面均具有顯著的抑制作用。上述機(jī)制的闡明有助于我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)霉酚酸酯的臨床療效，也為臨床合理應(yīng)用霉酚酸酯提供了依據(jù)。劉浩（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士研究生）劉志紅（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院解放軍腎臟病研究所南京，210002）黃海東（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士研究生）陳朝紅（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院解放軍腎臟病研究所南京，210002）李穎?。暇┐髮W(xué)醫(yī)學(xué)院博士研究生）黎磊石（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院解放軍腎臟病研究所南京，210002）參考文獻(xiàn)1，胡偉新，劉志紅，陳惠萍等霉酚酸酯治療

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