生物制藥工藝學(xué)復(fù)習(xí)總結(jié)

1、生物制藥工藝學(xué)第四章萃取分離法（答案）一、填空題1、常用的萃取方法有：單級(jí)萃取、多級(jí)錯(cuò)流萃取、多級(jí)逆流萃取。2、影響溶劑萃取的因素：乳化和破乳化、PH的影響、溫度和萃取時(shí)間的影響、鹽析作用的影響、溶劑種類、用量及萃取方式的影響。3、破乳方法有：加入表面活性劑、離心、加電解質(zhì)、加熱、吸附法破乳、高壓電破乳、稀釋法、超濾、反應(yīng)萃取。4、常用的破乳劑有：陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑。二、名詞解釋1、液-液萃?。菏侵赣靡环N溶劑將物質(zhì)從另一種溶劑（如發(fā)酵液）中提取出來的方法，根據(jù)所用溶劑的性質(zhì)不同或萃取機(jī)制不同，可將液-液萃取分為多種類型。2、萃?。涸谌軇┹腿≈?，被提取的溶液稱為料液，其中與提取的

2、物質(zhì)稱溶質(zhì)，而用以進(jìn)行萃取的溶劑稱為萃取劑。料液與萃取劑接觸后，料液中的溶質(zhì)向萃取劑轉(zhuǎn)移的過程稱為萃取，達(dá)到萃取平衡后，大部分溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中，這種含有溶質(zhì)的萃取劑溶液稱為萃取液，而被萃取出溶質(zhì)以后的料液稱為萃余液。3、反萃?。╯tripping）：是將萃取液與反萃取劑（含無機(jī)酸或堿的水溶液，有時(shí)也可以是水）相接觸，使某種被萃入有機(jī)相的溶質(zhì)轉(zhuǎn)入水相，可把這種過程看作萃取的逆過程。4、分配定律：即在一定溫度，一定壓力下，某一溶質(zhì)在互不能相溶的兩種溶劑間分配時(shí)，達(dá)到平衡后，在兩相中的活度之比為一常數(shù)。5、萃取因素：也稱萃取比，其定義為被萃取溶質(zhì)進(jìn)入萃取相的總量與該溶質(zhì)在萃余相中總量之比，通常以E

3、表示。6、萃取率（percentage extraction）：生產(chǎn)上常用萃取率來表示一種萃取劑對(duì)某種溶質(zhì)的萃取能力，計(jì)算萃取效果，其公式為：7、分離因素：在同一萃取體系內(nèi)兩種溶質(zhì)在同樣條件下分配系數(shù)的比值。三、問答1、簡述溶劑萃取法的優(yōu)點(diǎn)。答：操作可連續(xù)化，反應(yīng)速度快，生產(chǎn)周期短；對(duì)熱敏物質(zhì)破壞少；采用多級(jí)萃取時(shí)，溶質(zhì)濃縮倍數(shù)大、純化度高。2、簡述選擇萃取溶劑應(yīng)遵守的原則。答：分配系數(shù)愈大愈好，若分配系數(shù)未知，則可根據(jù)“相似相容”的原則，選擇與藥物結(jié)構(gòu)相近的溶劑；選擇分離因數(shù)大于1的溶劑；料液與萃取溶劑的互溶度愈小愈好；盡量選擇毒性低的溶劑；溶劑的化學(xué)穩(wěn)定性要高，腐蝕性低，沸點(diǎn)不宜太高，揮發(fā)

4、性要小，價(jià)格便宜，來源方便，便于回收。第五章 沉淀法（答案）一.填空1.固相析出法主要包括鹽析法，有機(jī)溶劑沉淀法，等電點(diǎn)沉淀法，結(jié)晶法及其它多種沉淀方法等。2.按照一般的習(xí)慣，析出物為晶體時(shí)稱為結(jié)晶法，析出物為無定形固體則稱為沉淀法。3.影響鹽析的因素有：無機(jī)鹽的種類、溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）種類的影響、蛋白質(zhì)濃度的影響、溫度的影響、pH的影響4. 結(jié)晶包括三個(gè)過程：(1) 形成過飽和溶液；(2) 晶核形成 ；(3) 晶體生長。5. 影晶體大小的主要因素，歸納起來與過飽和度、溫度、攪拌速度、晶種等直接有關(guān)。6. 晶體的質(zhì)量主要是指晶體的大小、形狀和純度等3個(gè)方面二選擇1、 在一定的pH和溫度下改變離子

5、強(qiáng)度（鹽濃度）進(jìn)行鹽析，稱作 ( A )AKS鹽析法 B鹽析法 C重復(fù)鹽析法 D分部鹽析法2、當(dāng)向蛋白質(zhì)純?nèi)芤褐屑尤胫行喳}時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度 （ C ）A增大 B. 減小 C. 先增大，后減小 D. 先減小，后增大3、鹽析法與有機(jī)溶劑沉淀法比較，其優(yōu)點(diǎn)是 （ B ）A.分辨率高 B.變性作用小 C.雜質(zhì)易除 D.沉淀易分離4、當(dāng)向蛋白質(zhì)純?nèi)芤褐屑尤胫行喳}時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度 （ C ）A增大 B. 減小 C. 先增大，后減小 D. 先減小，后增大5、鹽析常數(shù)Ks是生物大分子的特征常數(shù)，它與下列哪種因素關(guān)系密切。 （ B ）A鹽濃度 B. 鹽種類 C. 溶質(zhì)濃度 D介質(zhì)pH6、 將配基與可溶性的載體偶

6、聯(lián)后形成載體-配基復(fù)合物，該復(fù)合物可選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合，在一定條件下沉淀出來，此方法稱為 （ A）A親和沉淀 B聚合物沉淀 C金屬離子沉淀 D鹽析沉淀7、 將四環(huán)素粗品溶于pH2的水中，用氨水調(diào)pH4.54.6，2830保溫，即有四環(huán)素沉淀結(jié)晶析出 。此沉淀方法稱為 （B ）A有機(jī)溶劑結(jié)晶法 B等電點(diǎn)法 C透析結(jié)晶法 D鹽析結(jié)晶法8、影響體大小的主要因素與下列哪些因素?zé)o關(guān) ( D )A過飽和度 B溫度 C攪拌速度 D飽和度9、下列沉淀試劑不屬于表面活性劑的是 （ D）ACTAB BCPC CSDS DPEG三 名詞解釋：1. 鹽析法：是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中引

7、入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達(dá)到純化目的的方法。2. Ks鹽析：在一定的pH和溫度下改變離子強(qiáng)度（鹽濃度）進(jìn)行鹽析，稱作Ks鹽析法。Ks鹽析法多用于提取液的前期分離工作。3鹽析：在一定離子強(qiáng)度下僅改變pH和溫度進(jìn)行鹽析，稱作鹽析法。在分離的后期階段，為了求得較好的分辨率，或者為了達(dá)到結(jié)晶的目的，有時(shí)應(yīng)用鹽析法。鹽析法由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢且變化幅度小，沉淀分辨率比KS鹽析法好。4親和沉淀: 利用親和反應(yīng)原理，將配基與可溶性的載體偶聯(lián)后形成載體-配基復(fù)合物（親和沉淀劑），該復(fù)合物可選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合，在一定條件下沉淀出來。四 問答1.什么是鹽析作用？鹽析的原理是什么？答：鹽

8、析作用：向蛋白質(zhì)溶液中逐漸加入中性鹽，在高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度隨之減小，發(fā)生了鹽析作用。產(chǎn)生鹽析作用的一個(gè)原因是由于鹽離子與蛋白質(zhì)表面具相反電性的離子基團(tuán)結(jié)合，形成離子對(duì)，因此鹽離子部分中和了蛋白質(zhì)的電性，使蛋白質(zhì)分子之間電排斥作用減弱而能相互靠攏，聚集起來。鹽析作用的另一個(gè)原因是由于中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，鹽離子在水中發(fā)生水化而使蛋白質(zhì)脫去了水化膜，暴露出疏水區(qū)域，由于疏水區(qū)域的相互作用，使其沉淀。2.如何選擇鹽析所用中性鹽？（1）鹽析作用要強(qiáng)。一般來說多價(jià)陰離子的鹽析作用強(qiáng)，有時(shí)多價(jià)陽離子反而使鹽析作用降低。（2）鹽析用鹽要有足夠大的溶解度，且溶解度受溫度影響應(yīng)盡可能小。這樣便于獲得高

9、濃度鹽溶液，有利于操作，尤其是在較低溫度下的操作，不致造成鹽結(jié)晶析出，影響鹽析效果。（3）鹽析用鹽在生物學(xué)上是惰性的，不致影響蛋白質(zhì)等生物分子的活性，最好不引入給分離或測定帶來麻煩的雜質(zhì)。（4）來源豐富、經(jīng)濟(jì)。3.有機(jī)溶劑沉淀的原理是什么？答：親水性有機(jī)溶劑加入溶液后降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀；水溶性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度，降低了它的親水性，導(dǎo)致脫水凝集。4.有機(jī)溶劑沉淀影響沉淀效果的因素有那些？答： （1）有機(jī)溶劑種類及用量（2）pH的影響（3）溫度無機(jī)鹽的含量（4）某些金屬離子的助沉淀作用(5)

10、樣品濃度第六章 吸附分離法（答案）一、填空1、吸附劑按其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為兩大類：一類是有機(jī)吸附劑，如 活性炭 、 淀粉 、大孔吸附樹脂 等；另一類是無機(jī)吸附劑，如白陶土、 氧化鋁 、 硅膠 、 硅藻土 等。2、常用的吸附劑有 活性炭 、 硅膠 和 白陶土 等。3、大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑是在樹脂聚合時(shí)加入 惰性 致孔劑，待網(wǎng)格骨架固化和鏈結(jié)構(gòu)單元形成后，用溶劑萃取或蒸餾水洗將致孔劑去掉，形成不受外界環(huán)境條件影響的 孔隙 ，其孔徑遠(yuǎn)大于24nm，可達(dá) 100nm ，故稱“大孔”。4、大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑按骨架的極性強(qiáng)弱，可分為非極性、中等極性、極性和強(qiáng)極性吸附劑四類。二、選擇題1、用大網(wǎng)格高聚物吸附劑

11、吸附的弱酸性物質(zhì)，一般用下列哪種溶液洗脫 （ D ）A.水 B.高鹽 C.低pH D. 高pH2、“類似物容易吸附類似物”的原則,一般極性吸附劑適宜于從何種溶劑中吸附極性物質(zhì) （ B ）A.極性溶劑 B.非極性溶劑 C.水 D.溶劑3、“類似物容易吸附類似物”的原則, 一般非極性吸附劑適宜于從下列何種溶劑中吸附非極性物質(zhì)。 （ A ）A.極性溶劑 B.非極性溶劑 C.三氯甲烷 D.溶劑4、下列屬于無機(jī)吸附劑的是： （A） A.白陶土 B.活性炭 C.淀粉 D.纖維素 5、活性炭在下列哪種溶劑中吸附能力最強(qiáng)？ （A） A.水 B.甲醇 C.乙醇 D.三氯甲烷 6、 關(guān)于大孔樹脂洗脫條件的說法，錯(cuò)

12、誤的是： （A） A .最常用的是以高級(jí)醇、酮或其水溶液解吸。 B. 對(duì)弱酸性物質(zhì)可用堿來解吸。 C. 對(duì)弱堿性物質(zhì)可用酸來解吸。D.如吸附系在高濃度鹽類溶液中進(jìn)行時(shí)，則常常僅用水洗就能解吸下來。三、名詞解釋1、 吸附法(adsorption method)：指利用吸附作用，將樣品中的生物活性物質(zhì)或雜質(zhì)吸附于適當(dāng)?shù)奈絼┥希梦絼?duì)活性物質(zhì)和雜質(zhì)間吸附能力的差異，使目的物和其它物質(zhì)分離，達(dá)到濃縮和提純目的的方法。2、 大網(wǎng)格高聚物吸附劑（macroreticular adsorbent）：在合成樹脂時(shí)，加入一種惰性組分，它不參與聚合反應(yīng)，但能和單體互溶，稱為致孔劑。待網(wǎng)絡(luò)骨架固化和鏈結(jié)構(gòu)單

13、元形成后，用溶劑萃取或水洗蒸餾的方法將致孔劑去掉，就留下了不受外界條件影響的永久孔隙，其孔徑遠(yuǎn)大于24nm，可達(dá)到100nm甚至1000nm以上，故稱“大孔”。與大孔網(wǎng)狀離子交換樹脂相比，它不含離子交換樹脂的功能團(tuán)，僅保留了多孔的骨架，其性質(zhì)與活性炭、硅膠等吸附劑相似，稱為大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑。四、問答題1、簡述吸附法的定義和特點(diǎn)。吸附法(adsorption method)指利用吸附作用，將樣品中的生物活性物質(zhì)或雜質(zhì)吸附于適當(dāng)?shù)奈絼┥?，利用吸附劑?duì)活性物質(zhì)和雜質(zhì)間吸附能力的差異，使目的物和其它物質(zhì)分離，達(dá)到濃縮和提純目的的方法。吸附法具有下列特點(diǎn)： (1)設(shè)備簡單、操作簡便、價(jià)廉、安全。

14、(2)少用或不用有機(jī)溶劑，吸附與洗脫過程中pH變化小，較少引起生物活性物質(zhì)的變性失活。(3)天然吸附劑(特別是無機(jī)吸附劑)的吸附性能和吸附條件較難控制，吸附選擇性差，收率不高，難以連續(xù)操作。2、影響吸附的因素有哪些？ 吸附劑的特性： 吸附現(xiàn)象在界面發(fā)生，因此吸附劑比表面積愈大，吸附量愈多。通過活化的方法也可增加吸附劑的吸附容量。另外還要求吸附劑的機(jī)械強(qiáng)度好，吸附速度快 吸附物的性質(zhì)：能使表面張力降低的物質(zhì)，易為表面所吸附；一般極性吸附劑易吸附極性物質(zhì)，非極性吸附劑易吸附非極性物質(zhì)；溶質(zhì)從較易溶解的溶劑中被吸附時(shí)，吸附量較少；對(duì)于同系列物質(zhì)，吸附量的變化是有規(guī)則的；吸附物若能與溶劑形成氫鍵，則吸

15、附物極易溶于溶劑之中。 吸附條件：溫度：吸附熱越大，溫度對(duì)吸附的影響越大。PH值：溶液的pH值溶液pH值可控制吸附劑或吸附物解離情況，進(jìn)而影響吸附量，對(duì)蛋白質(zhì)或酶類等兩性物質(zhì)，一般在等電點(diǎn)附近吸附量最大。鹽濃度：溶劑的影響：單溶劑與混合溶劑對(duì)吸附作用有不同的影響。 吸附物濃度與吸附劑用量一般情況下吸附物濃度大時(shí)，吸附量也大。第七章 凝膠層析一、填空題1、凝膠層析的分離原理有凝膠層析的分離原理有平衡排除理論、擴(kuò)散分離理論、流動(dòng)分離理論。這三種分離原理是互相補(bǔ)充的，在通常情況下平衡排除理論起主導(dǎo)作用；擴(kuò)散分離理論的作用隨流速增加而加強(qiáng)；只有在流速很高時(shí)流動(dòng)分離理論才起作用。2、瓊脂糖凝膠的一個(gè)特征

16、是分離的分子量范圍非常大，其分離范圍隨著凝膠濃度上升而下降，顆粒強(qiáng)度隨濃度上升而提高。3、凝膠粒度的大小對(duì)分離效果有直接的影響。一般來說，細(xì)粒凝膠柱流速低，洗脫峰窄，分辨率 高 ，多用于精制分離 等。粗粒凝膠柱流速高，洗脫峰平坦，分辨率 低 ，多用于多用于脫鹽等。4、在作分級(jí)分離時(shí)，為了提高分辨率，多采用比樣品體積大 25 倍以上的柱體積， 25 以上的柱比，較 大 吸液量、較 細(xì) 粒的凝膠固定相。5、溶質(zhì)通過色譜柱時(shí)造成的峰加寬效應(yīng)包括 分子擴(kuò)散 、渦流擴(kuò)散 、 流動(dòng)相中傳質(zhì)阻力 、 固定相中傳質(zhì)阻力。6、葡聚糖凝膠的孔徑大小取決于交聯(lián)度，其越小，凝膠孔徑 越 大 ；而瓊脂糖凝膠的孔徑卻依賴

17、于瓊脂糖濃度。二、選擇題1、凝膠層析中，有時(shí)溶質(zhì)的Kd>1，其原因是 （ B ）A.凝膠排斥 B.凝膠吸附 C.柱床過長 D.流速過低2、凝膠層析中，有時(shí)小分子溶質(zhì)的Kd<1，其原因是 （ A）A.水合作用 B.凝膠吸附 C.柱床過長 D.流速過低3、在凝膠層析中樣品各組分最先淋出的是 （ B）A.分子量最大的 B.體積最大的 C.分子量最小的 D.體積最小的4、為了進(jìn)一步檢查凝膠柱的質(zhì)量，通常用一種大分子的有色物質(zhì)溶液過柱，常見的檢查物質(zhì)為藍(lán)色葡聚糖，下面不屬于它的作用的是 （C）A.觀察柱床有無溝流 B.觀察色帶是否平整C.測量流速 D.測量層析柱的外水體積5、在選用凝膠層析柱

18、時(shí)，為了提高分辨率，宜選用的層析柱是 （A）A.粗且長的 B.粗且短的 C.細(xì)且長的 D.細(xì)且短的三、名詞解釋1、全排阻： 當(dāng)具有一定分子量分布的高聚物溶液從柱中通過時(shí)，較大的分子完全不能進(jìn)入顆粒內(nèi)部，只能從顆粒間隙流過，稱“全排阻”。其流經(jīng)體積最小，等于外水體積V0。2、類分離：將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開，如蛋白質(zhì)與鹽類，稱作類分離或組分離.選擇凝膠時(shí)，應(yīng)使樣品中大分子組的分子量大于其排阻限，而小分子組的分子量小于滲入限。大分子的分配系數(shù)Kd=0，小分子的Kd=1。3、分級(jí)分離：將分子量相差不大的大分子物質(zhì)加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，分級(jí)分離應(yīng)盡量使待分離各物質(zhì)的Kd值相差大些，

19、并使分子量分布不在凝膠分離范圍的一側(cè)。4、柱比：層析柱的長度與直徑的比值一般稱作“柱比”。5、操作壓：凝膠層析柱由于進(jìn)出口之間液位壓力差形成的對(duì)凝膠顆粒的壓力稱作“操作壓”。6、全滲入：被分離組分的分子量小于該種凝膠的滲入限，其分子可以自由進(jìn)出凝膠顆粒，這叫做“全滲入”。 其流經(jīng)體積最大，等于外水體積與內(nèi)水體積之和，V0 Vi。7、分離度Rs： 式中 Ve1、Ve2對(duì)應(yīng)于兩個(gè)峰的淋出體積；W1、W2和1、2兩個(gè)峰寬度和標(biāo)準(zhǔn)偏差。四、問答題1、試述公式Ve=V0+KdVi 各字母的物理意義。答：公式Ve=V0+KdVi中Ve代表被分離組分的流經(jīng)體積，V0代表外水體積，Vi代表內(nèi)水體積。Kd稱作“

20、排阻系數(shù)” 或“分配系數(shù)”， 它反映了物質(zhì)分子進(jìn)入凝膠顆粒的程度。對(duì)一定種類規(guī)格的凝膠，物質(zhì)的Kd值為該物質(zhì)的特征常數(shù)。排阻系數(shù)： 當(dāng)Kd=1時(shí)，洗脫體積Ve=V0+Vi，為全滲入。當(dāng)Kd=0時(shí)，洗脫體積Ve=V0，為全排阻。0Kd1時(shí)，洗脫體積Ve=Vo+KdVi，為部分滲入。2、利用凝膠層析如何測定蛋白質(zhì)的分子量？ 答：當(dāng)具有一定分子量分布的高聚物溶液從柱中通過時(shí)，較小的分子在柱中停留時(shí)間比大分子停留的時(shí)間要長，于是樣品各組分即按分子大小順序而分開，最先淋出的是最大的分子（2分）。對(duì)于一個(gè)特定體系（凝膠柱），待測定物質(zhì)的洗脫體積與分子量的關(guān)系符合公式Ve=-KlogM +C先以3個(gè)以上（最

21、好更多些）的已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白過柱，測取各自的Ve值。以Ve作縱坐標(biāo)，logM作橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（2分）。在同一測定系統(tǒng)中測取未知物質(zhì)的Ve值便可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得分子量（2分）。3、凝膠層析的應(yīng)用主要有哪些？并說明其原理。當(dāng)具有一定分子量分布的高聚物溶液從柱中通過時(shí)，較小的分子在柱中停留時(shí)間比大分子停留的時(shí)間要長，于是樣品各組分即按分子大小順序而分開，最先淋出的是最大的分子（2分）。應(yīng)用：一、脫鹽：脫鹽用的凝膠多為大粒度的，高交聯(lián)度的凝膠。此時(shí)溶液中蛋白質(zhì)等大分子的Kd=0，鹽類的Kd=1。由于交聯(lián)度大，凝膠顆粒的強(qiáng)度較好，加之凝膠粒度大，柱層操作比較便利，流速也高。二、分子量測定：對(duì)于一個(gè)

22、特定體系（凝膠柱），待測定物質(zhì)的洗脫體積與分子量的關(guān)系符合公式Ve=-KlogM+C先以3個(gè)以上（最好更多些）的已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白過柱，測取各自的Ve值。以Ve作縱坐標(biāo)，logM作橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在同一測定系統(tǒng)中測取未知物質(zhì)的Ve值便可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得分子量。三、分離純化：根據(jù)分子量不同流出先后順序不同，收集單一洗脫峰的物質(zhì)，得以純化。第八章 離子交換法一、填空題1、離子交換劑由 惰性的不溶性載體 、 功能基團(tuán) 和 平衡離子 組成。 平衡離子帶 正電荷 為陽離子交換樹脂，平衡離子帶 負(fù)電荷 稱陰離子交換樹脂。2、常見的離子交換劑有離子交換樹脂，離子交換纖維素，葡聚糖凝膠離子交換劑等。3、離

23、子交換樹脂的基本要求有 有盡可能大的交換容量 、 有良好的交換選擇性 、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、 化學(xué)動(dòng)力學(xué)性能好 和 物理性能好 。4、影響離子交換選擇性的因素主要有 離子價(jià)與離子水合半徑 、 離子價(jià)與離子濃度 、交換環(huán)境 、 樹脂結(jié)構(gòu) 、 偶極離子排斥 等。5、請(qǐng)寫出下列離子交換劑的名稱和類型：CM-C的名稱是羧甲基纖維素，屬于弱酸型陽離子交換纖維素; DEAE-C的名稱是二乙基氨基乙基纖維素，屬于強(qiáng)堿型陰離子交換纖維素;。6、色譜聚焦（chromatofocusing）是一種高分辨的新型的蛋白質(zhì)純化技術(shù)。它是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，結(jié)合離子交換技術(shù)的大容量色譜，能分離幾百毫克蛋白質(zhì)樣品，洗脫峰被聚焦效

24、應(yīng)濃縮，分辨率很高，操作簡單。7、寫出下列離子交換劑類型：732 強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂 ，724 弱酸型陽離子交換樹脂 ，717 強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂 ，CM-C 陽離子交換纖維素 ,DEAE-C 陰離子交換纖維素 ，PBE94 陰離子交換劑 。8、在采用多緩沖陰離子交換劑作固定相的離子交換聚焦色譜過程中，當(dāng)柱中某位點(diǎn)之pH值下降到蛋白質(zhì)組分 PI(等電點(diǎn)) 值以下時(shí)，它因帶 正 電荷而 下移 ，如果柱中有兩種蛋白組分，pI值較 大（高） 者會(huì)超過另一組分，移動(dòng)至柱下部pH較 高 的位點(diǎn)進(jìn)行 聚焦（交換） 。9、影響離子交換選擇性的因素有 離子水合半徑 、 離子價(jià)與離子濃度 、交換環(huán)境 、 樹

25、脂結(jié)構(gòu) 、 偶極離子排斥 。二、選擇題1、用鈉型陽離子交換樹脂處理氨基酸時(shí)，吸附量很低，這是因?yàn)?（C）A. 偶極排斥 B.離子競爭 C. 解離低 D. 其它2、在酸性條件下用下列哪種樹脂吸附氨基酸有較大的交換容量 （ C ）A.羥型陰 B.氯型陰 C.氫型陽 D.鈉型陽3、在尼柯爾斯基方程式中，K值為離子交換常數(shù)， K1說明樹脂對(duì)交換離子吸引力（ ）。A. 小于平衡離子 B.大于平衡離子 C. 等于平衡離子 D. 其它三、名詞解釋1、蛇籠樹脂：由丙烯酸或甲基丙烯酸在季胺型陰離子交換樹脂（如Dowex）中聚合而成的一類樹脂稱蛇籠樹脂。它是一種兩性樹脂，它適宜于從有機(jī)物質(zhì)（如甘油）水溶液中吸附鹽

26、類，再生時(shí)用水洗，就可將吸著的離子洗下來。2、尼柯爾斯基方程式： 即 其中m1、m2及C1、C2分別代表樹脂上和溶液中的兩種離子的濃度。K值的大小取決于樹脂和交換離子的性質(zhì)，以及交換條件。K1時(shí)說明離子A1比離子A2對(duì)樹脂有較大的吸引力；反之，K1時(shí)樹脂對(duì)A2的吸引力大于A1。3、偶極離子排斥作用：許多生化物質(zhì)都是兩性物質(zhì)。其中有些是偶極離子。因?yàn)樗鼈兗词箖綦姾蔀榱銜r(shí)，正電中心和負(fù)電中心并不重疊，遂成偶極。偶極離子在離子交換過程中的行為是很特殊的?，F(xiàn)以氨基酸的離子交換為例。 式中由于使用了鈉型樹脂，被吸附氨基酸的羧基所帶的負(fù)電荷與樹脂磺酸基之負(fù)電荷產(chǎn)生排斥力。這就是所謂偶極離子的排斥作用。因此

27、使樹脂對(duì)氨基酸的吸附量大大降低。四、問答題1、簡述離子交換纖維素的特點(diǎn)有哪些？答：離子交換纖維素的特點(diǎn)是：離子交換纖維素為開放的長鏈骨架，大分子物質(zhì)能自由地在其中擴(kuò)散和交換，親水性強(qiáng)，表面積大，吸易附大分子；交換基團(tuán)稀疏，對(duì)大分子的實(shí)際交換容量大；吸附力弱，交換和洗脫條件緩和，不易引起變性；分辨力強(qiáng)，能分離復(fù)雜的生物大分子混合物。2、請(qǐng)以CM-C為例說明離子交換纖維素分離純化蛋白質(zhì)時(shí)的洗脫方法有哪些？并說出各種方法的洗脫原理。答：無論是升高環(huán)境的pH還是降低pH或是增加離子強(qiáng)度都能將被吸附物質(zhì)洗脫下來?，F(xiàn)以羧甲基纖維素為例加以說明，圖中H2N-P表示蛋白質(zhì)，C表示纖維素。 （1）、升高環(huán)境的p

28、H，使蛋白質(zhì)在此pH下失去電荷，從而喪失與CM-C結(jié)合力而被洗脫下來。（2）、降低環(huán)境的pH，使CM-C在此pH下不解離，從而不能吸附蛋白質(zhì)而被洗脫下來。（3）、用高濃度的同性離子根據(jù)質(zhì)量作用定律將目的物離子取代下來。3、請(qǐng)以DEAE-C為例說明離子交換纖維素分離純化蛋白質(zhì)時(shí)的洗脫方法有哪些？并說出各種方法的洗脫原理。答：無論是升高環(huán)境的pH還是降低pH或是增加離子強(qiáng)度都能將被吸附物質(zhì)洗脫下來。（1）、升高環(huán)境的pH，使DEAE-C在此pH下不解離，從而不能吸附蛋白質(zhì)而被洗脫下來。（2）、降低環(huán)境的pH，使蛋白質(zhì)在此pH下失去電荷，從而喪失與DEAE-C結(jié)合力而被洗脫下來。（3）、用高濃度的同

29、性離子根據(jù)質(zhì)量作用定律將目的物離子取代下來。4、由下圖，利用給出的兩種離子交換劑（E1，E2）分離3種蛋白質(zhì)（P1、P2、P3），用箭頭流程圖表示(并指出E1，E2的類型)。 E1為陰離子交換劑E2為陽離子交換劑5、下圖為離子交換法應(yīng)用實(shí)例，請(qǐng)?zhí)顚懮a(chǎn)工藝流程中的空格（可選因素：陰離子交換樹脂，陽離子交換樹脂， 0.05mol/L氨水，0.1mol/L氨水，2mol/L氨水）。簡述從“濾液”開始，以后步驟的分離原理？答：陽離子交換樹脂， 0.05mol/L氨水，0.1mol/L氨水，2mol/L氨水濾液調(diào)節(jié)到pH2.5時(shí)，氨基酸帶正電荷，因此選用陽離子交換樹脂，之后根據(jù)氨基酸等電點(diǎn)的不同，依次

30、用0.05mol/L氨水，0.1mol/L氨水，2mol/L氨水洗脫。酸性氨基酸等電點(diǎn)低，因此用0.05mol/L氨水就可洗脫下來，而堿性氨基酸等電點(diǎn)高，因此需用2mol/L氨水才能將之洗脫下來。第九章 親和純化技術(shù)一、填空題1、親和層析洗脫方法有非專一性洗脫 ， 特殊洗脫， 專一性洗脫。2、親和力大小除由親和對(duì)本身的 解離常數(shù) 決定外，還受許多因素的影響，其中包括親和吸附劑 微環(huán)境 、 載體空間位阻 、 載體孔徑 、 配基和配體的濃度 、 配基結(jié)構(gòu) 等。3、親和層析中常用作分離酶的配基有 酶抑制劑 ， 輔酶 ， 底物 和 底物結(jié)構(gòu)類似物 。4、親和層析中非專一性吸附有離子效應(yīng)、疏水基團(tuán)、復(fù)合

31、親和力。5、親和過濾指的是將 親和層析 和 膜過濾技術(shù) 結(jié)合運(yùn)用，它包括 親和錯(cuò)流過濾 和 親和膜分離 兩大方法。二、選擇題1、下面關(guān)于親和層析載體的說法錯(cuò)誤的是 （ B ）A.載體必須能充分功能化。B.載體必須有較好的理化穩(wěn)定性和生物親和性，盡量減少非專一性吸附。C.載體必須具有高度的水不溶性和親水性。D.理想的親和層析載體外觀上應(yīng)為大小均勻的剛性小球。2、制備親和柱時(shí)，應(yīng)首先選用的配基是 （ A ）A.大分子的 B.小分子的 C.中等大小的 D.不確定3、親和層析的洗脫過程中，在流動(dòng)相中加入配基的洗脫方法稱作 （ C ）A. 陰性洗脫 B. 劇烈洗脫 C. 競爭洗脫 D. 非競爭洗脫4、親

32、和層析的洗脫過程中，在流動(dòng)相中減去配基的洗脫方法稱作 （ D ）A. 陰性洗脫 B. 劇烈洗脫 C. 正洗脫 D. 負(fù)洗脫三、名詞解釋1、親和反膠團(tuán)萃?。ˋffinity-based resersed micellar extraction）：是指在反膠團(tuán)相中除通常的表面活性劑（如AOT）以外，添加另一種親水頭部為目標(biāo)分子的親和配基的助表面活性劑，通過親和配基與目標(biāo)分子的親和結(jié)合作用，促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物在反膠團(tuán)相的分配，提高目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)和反膠團(tuán)萃取分離的選擇性。2、親和膜：利用親和配基修飾微濾膜為親和吸附介質(zhì)親和純化目標(biāo)蛋白質(zhì)，是固定床親和層析的變型。將一張微濾膜比喻為一個(gè)固定床，則膜厚即為床

33、層高度.優(yōu)點(diǎn)是傳質(zhì)阻力小，達(dá)到吸附平衡的時(shí)間短，配基利用率高；壓降小，流速快，設(shè)備體積小，配基用量低。3、二次作用親和沉淀（secondary-effect affinity precipitation）：利用在物理場（如pH、離子強(qiáng)度、溫度和添加金屬離子等）改變時(shí)溶解度下降、發(fā)生可逆性沉淀的水溶性聚合物為載體固定親和配基，制備親和沉淀介質(zhì)。親和介質(zhì)結(jié)合目標(biāo)分子后，通過改變物理場使介質(zhì)與目標(biāo)分子共同沉淀的方法成為二次作用親和沉淀。4、親和萃取：利用聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）或聚乙二醇/無機(jī)鹽等雙水相系統(tǒng)萃取分離蛋白質(zhì)等大生物分子，特別是胞內(nèi)酶的雙水相萃取法。利用偶聯(lián)親和配基的PEG為成

34、相聚合物進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物的雙水相萃取，可在親和配基的親和結(jié)合作用下促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物在PEG相（上相）的分配，提高目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)和選擇性。5、親和吸附劑：由載體及配基偶聯(lián)構(gòu)成，在親和層析中起可逆結(jié)合的特異性物質(zhì)稱為配基（Ligand），與配基結(jié)合的層析介質(zhì)稱為載體（Matrix）。6、負(fù)洗脫：在雙底物反應(yīng)中，與配基互補(bǔ)的酶的親和吸附，如果吸附取決于A物的存在與否，則洗脫液中除去A物時(shí)，吸附在配基上的互補(bǔ)分子也會(huì)洗脫下來，這種洗脫方法也稱負(fù)洗脫。四、問答題1、親和層析的原理是什么？主要特點(diǎn)是什么？答：親和層析的設(shè)計(jì)和過程大致分為以下三步：1）配基固定化：選擇合適的配基與不溶性的支撐載體偶鏈，或共價(jià)結(jié)合

35、成具有特異親和性的分離介質(zhì)；2）吸附樣品：親和層析介質(zhì)選擇性吸附酶或其他生物活性物質(zhì)，雜質(zhì)與層析介質(zhì)間沒有親和作用，故不能被吸附而被洗滌去除；3）樣品解析：選擇適宜的條件使被吸附的親和介質(zhì)上的酶或其他生物活性物質(zhì)解析下柱。親和層析技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)在于，利用它從提取液中經(jīng)過一次簡單的處理便可得到所需的高純度活性物質(zhì)。此外親和層析還有對(duì)設(shè)備要求不高、操作簡便、適用范圍廣、特異性強(qiáng)、分離速度快、分離效果好、分離條件溫和等優(yōu)點(diǎn)：其主要缺點(diǎn)是親和吸附劑通用性較差，故要分離一種物質(zhì)差不多都得重新制備專用的吸附劑。另外由于洗脫條件較苛刻，須很好地控制洗脫條件，以避免生物活性物質(zhì)的變性失活。2、對(duì)親和層析的公式

36、 進(jìn)行說明。設(shè) KL=10-7，求L0 （6分） Ve為洗脫體積（1分）；V0固定相（柱床）體積（1分）；L0為固定化配基濃度（1分）；KL為親和對(duì)解離常數(shù)（親和勢）（1分）；只有當(dāng)阻留值10時(shí)，親和層析才是有效（分離）的。1+L0/ KL 10，將KL =10-7代入得：L0/10-79，所以，L09×10-7（2分）。3、何謂“手臂”？其長短與親和層析效果有何聯(lián)系？為什么？答：有時(shí)候用小分子物質(zhì)（如酶的輔因子）作為配基直接偶聯(lián)至瓊脂糖凝膠珠粒上制備親和層析介質(zhì)時(shí)，盡管配基和酶間的親和力在合適的范圍內(nèi)，但其吸附容量往往是低的。這是由于酶的活性中心常是埋藏在其結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，它們與介質(zhì)的

37、空間障礙影響其與親和配基的結(jié)合作用。為了改變這種情況可在載體和配基間插入一個(gè)物質(zhì)稱為“手臂”，以消除空間障礙。手臂的長度是有限的，不可太短也不可太長，太短不能起消除空間障礙的作用，太長往往會(huì)使非特異性吸附增加。4、從親和沉淀的機(jī)理和分離操作的角度出發(fā)，簡述親和沉淀純化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。答：從親和沉淀的機(jī)理和分離操作的角度可以看出，親和沉淀純化技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)：1）配基與目標(biāo)分子的親和結(jié)合作用在自由溶液中進(jìn)行，無擴(kuò)散傳質(zhì)阻力，親和結(jié)合速度快；2）親和配基裸露在溶液之中，可更有效的結(jié)合目標(biāo)分子，即親和沉淀的配基利用率高；3）利用成熟的離心或過濾技術(shù)回收沉淀，易于規(guī)模放大；4）親和沉析法可用于高粘度或含微

38、粒的料液中目標(biāo)產(chǎn)物的純化，因此可在分離操作的較初期采用，有利于減少分離操作步驟，降低成本。同時(shí)，在分離過程的早期階段除去對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物有毒的雜質(zhì)（如蛋白酶），有利于提高目標(biāo)產(chǎn)物質(zhì)量和收率。第十章 離心技術(shù)一、填空：1、制備型離心機(jī)的轉(zhuǎn)子有 角度 轉(zhuǎn)子、 水平 轉(zhuǎn)子、垂直 轉(zhuǎn)子、 區(qū)帶。 轉(zhuǎn)子。2、密度梯度的制備方法有:手工制備法 、 梯度混合儀制備法、 離心形成法 反復(fù)凍融法3 、梯度的取出和收集方法：取代法、穿刺法、切割法、虹吸法二、選擇題：在離心分離過程中,若離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分種,離心半徑為10厘米,則相對(duì)離心力為 ( A )A. 1789(g) B. 4000(g) C. 8000

39、(g) D. 2000(g)三、 名詞解釋：1、相對(duì)離心力：由于各種離心機(jī)轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力而受變化，RCF就是實(shí)際離心場轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。2、離心力：在一定角度速度下作圓周運(yùn)動(dòng)的任何物體都受到的向外的力。離心力（Fc）的大小等于離心加速度2r與顆粒質(zhì)量m的乘積，即：F=m2r3、沉降速度：即在離心力作用下，物質(zhì)粒子于單位時(shí)間內(nèi)沿離心力方向移動(dòng)的距離。4、沉降系數(shù)：在單位離心力場中，顆粒的沉降速度謂之“沉降系數(shù)”四、問答題1、試述等密度離心法及其特點(diǎn)。2、試述差分離心法：3、試述速度區(qū)帶離心法及其特點(diǎn)。4、密度梯度介質(zhì)應(yīng)具備哪些基本條件？5 、影響沉降速度的因素有哪些? 6、簡述