秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)與保存研究

1、中國獸醫(yī)科學(xué)󰀁2011,41(10):1001-1004ChineseVeterinaryScience中圖分類號(hào):S852.731󰀁文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A󰀁文章編號(hào):1673-4696(2011)10-1001-04秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)與保存研究李有全,關(guān)貴全,彭欲率,何海寧,羅建勛,殷󰀁宏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州󰀁730046)󰀁󰀁摘要:比較了在OP50-NGM、JM109-NGM、OP50-LB、JM109-LB四種不同培養(yǎng)基上秀麗隱桿線蟲的生長效果;測(cè)定了在三種溫度和含不同甘油濃度凍存液中

2、的蟲體保存效果。結(jié)果顯示,秀麗隱桿線蟲在OP50-NGM培養(yǎng)基中生長良好,在JM109-LB培養(yǎng)基中生長較差。在-80󰀁最佳溫度條件下,秀麗隱桿線蟲在含50mL/L甘油的LB培養(yǎng)基中的存活率達(dá)78%;在含50mL/L甘油的PBS中的存活率達(dá)52%;而在含100mL/L甘油的水溶液中的存活率僅為8%。用液氮保存,成蟲和幼蟲均可存活;而在-80󰀁和-20󰀁條件下,僅有幼蟲存活。結(jié)果表明,秀麗隱桿線蟲在OP50-NGM培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)育生長較好;在-80󰀁條件下,含50mL/L甘油的LB培養(yǎng)基適于保存秀麗隱桿線蟲。關(guān)鍵詞:秀麗隱桿線蟲;培

3、養(yǎng);保存*(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室甘肅省動(dòng)物寄生蟲病StudyonthecultureandpreservationofCaenorhabditiselegansLIYou-quan,GUANGu-iquan,PENGYu-l󰀁,HEHa-ining,LUOJian-xun,YINHong(KeyLaboratoryofVeterinaryParasitologyofGansuProvince/StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology/LanzhouVeterinaryResearch

4、Institute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046,China)Keywords:Caenorhabditiselegans;culture;preservation󰀁󰀁秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)屬于線形動(dòng)物門、小桿亞綱(Rhabditia)、小桿目(Rhabdit-idia)、小桿總科(Rhabditoidea)的線蟲1。它在自然狀態(tài)下與人類的關(guān)系不大,是一種在土壤中營自收稿日期:2011-04-03;修回日期:2011-08-26基金項(xiàng)目:國家肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體

5、系項(xiàng)目(CARS-38);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30800820);歐盟項(xiàng)目EPIZONE(FOOD-CT-2006-016236)作者簡介:李有全(1975-),男,甘肅甘谷人,副研究員,博士,主要從事原蟲免疫學(xué)和分子生物學(xué)研究,Tel員,博士,E-mail:ljxbn由生活的微小線蟲,以細(xì)菌為食,對(duì)人、動(dòng)物和植物沒有危害。成蟲長1mm左右,有雌雄同體蟲和雄蟲二類蟲體,前者產(chǎn)生卵和精子,可自體受精。兩類蟲體可互相進(jìn)行交配,但雌雄同體蟲之間不能交配。1002中國獸醫(yī)科學(xué)第41卷雌雄同體蟲可產(chǎn)卵約300個(gè),卵孵出幼蟲,經(jīng)4次蛻皮發(fā)育為成蟲,該成蟲只有959個(gè)體細(xì)胞;而

6、雄蟲有1031個(gè)體細(xì)胞2-3。1998年,秀麗隱桿線蟲基因組測(cè)序完成,準(zhǔn)確率達(dá)99%,剩下1%的缺口也于2002年10月完成。秀麗隱桿線蟲基因組大小為9󰀁7󰀁10堿基,大約是大腸桿菌基因組的20倍,人類基因組的1/30。編碼序列占整個(gè)基因組的27%,平均每個(gè)基因有1個(gè)內(nèi)含子?；蚪M序列40%與人類同源。秀麗隱桿線蟲是人類第一次完成的多細(xì)胞動(dòng)物基因組序列測(cè)定的動(dòng)物,為后來測(cè)定果蠅、人類和小鼠等基因組序列提供了基因技術(shù)實(shí)踐和完善的機(jī)會(huì),為科學(xué)家研究基因組的功能提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具。󰀁󰀁秀麗隱桿線蟲蟲體在整個(gè)生活史中都是透明的,可在解

7、剖鏡下進(jìn)行觀察和操作?？捎铆傊囵B(yǎng)基或液體培養(yǎng)基進(jìn)行人工培養(yǎng)。目前,有關(guān)秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)和保存方面的報(bào)道并不多,尤其是現(xiàn)有的凍存方法效果不佳或比較繁瑣,或需要液氮保存,費(fèi)用昂貴。本試驗(yàn)就秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)和保存方法進(jìn)行了研究和探討。47NGM培養(yǎng)基接種OP50-NGM,每組培養(yǎng)基各2份。第1組:將所挑取蟲體接種于涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上(OP50-NGM);第2組:將所挑取蟲體接種于涂有大腸桿菌JM109的NGM培養(yǎng)基上(JM109-NGM);第3組:將所挑取蟲體接種于涂有大腸桿菌OP50的LB培養(yǎng)基上(OP50-LB);第4組:將所挑取蟲體接種于涂有大腸桿菌JM109的LB培養(yǎng)

8、基上(JM109-LB)。置于20󰀁生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察蟲體的生長發(fā)育及形態(tài)。1.4󰀁含不同濃度甘油的LB液的凍存比較試驗(yàn)󰀁󰀁在培養(yǎng)至第96小時(shí)的含秀麗隱桿線蟲的NGM平板上,用手術(shù)刀切取四等份膠塊,分別接種于4個(gè)不同NGM平板上,蟲體面朝下,置于20󰀁生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h后,用LB培養(yǎng)液從NGM平板洗下蟲體,靜置。用含不同濃度甘油的LB凍存蟲體;甘油濃度依次為0、50、100、150、200、250和300mL/L。每種濃度蟲體各保存9份,于液氮、-80󰀁和-20󰀁條件下分別保

9、存3份。保存12個(gè)月后,38󰀁水浴快速解凍,靜置20min后,吸取沉淀部分,接種到涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基中,觀察蟲體活力和計(jì)算蟲體成活率。1.5󰀁含不同濃度甘油的PBS液的凍存比較試驗(yàn)󰀁󰀁操作同1.4,僅是將LB培養(yǎng)液換成PBS溶液。1.6󰀁含不同濃度甘油的水溶液的凍存比較試驗(yàn)󰀁󰀁操作同1.4,將LB培養(yǎng)液換成蒸餾水。1󰀁材料與方法1.1󰀁蟲種和菌株󰀁󰀁N2野生型秀麗隱桿線蟲(C.elegans,theBri

10、s-tolstrainN2)和OP50尿嘧啶滲漏突變型大腸桿菌,均由浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院杜愛芳教授和周前進(jìn)博士惠贈(zèng)。大腸桿菌JM109購自大連寶生物工程有限公司。1.2󰀁培養(yǎng)基󰀁󰀁NGM培養(yǎng)基:NaCl0.3g,蛋白胨0.25g,瓊脂1.7g,1mol/LKH2PO4-K2HPO4緩沖液(pH6.0)2.5mL,加水定容至100mL,高壓滅菌后,待培養(yǎng)液降溫至60󰀁,加入膽固醇乙醇溶液(5mg/mL)0.1mL,1mol/LMgSO40.1mL,1mol/LCaCl20.1mL,快速混勻后,制備60mm的NGM培養(yǎng)基平板,4

11、83041;保存。󰀁󰀁LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl10g/L,加水溶解,用NaOH調(diào)節(jié)pH至7󰀁4,并定容至1000mL,高壓滅菌。LB固體培養(yǎng)基需再加入瓊脂15g/L,高壓滅菌后,待培養(yǎng)液降溫至60󰀁,加入氨芐西林(至終濃度100󰀁g/mL)和卡那霉素(至終濃度100󰀁g/mL),快速混勻后,制備60mm的LB固體培養(yǎng)基平板,4󰀁保存。1.3󰀁蟲體的培養(yǎng)󰀁2󰀁結(jié)果2.1󰀁不同培養(yǎng)基對(duì)蟲體

12、生長發(fā)育的影響󰀁󰀁將同量秀麗隱桿線蟲分別接種于OP50-NGM、JM109-NGM、OP50-LB、JM109-LB四種不同培養(yǎng)基上,每組培養(yǎng)基各2份,置于20󰀁培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在4種不同培養(yǎng)基上,肉眼可見有大量蟲體蠕動(dòng),鏡檢發(fā)現(xiàn)大量不同期的幼蟲和成蟲。第1組(OP50-NGM):第4天,成蟲和蟲卵數(shù)均達(dá)到最高值,成蟲數(shù)大約2.5個(gè)/mm2,蟲卵數(shù)大約17.0個(gè)/mm2;第6天,幼蟲數(shù)達(dá)到最高值,75.0個(gè)/mm2。第2組(JM109-NGM):第4天,成蟲和蟲卵數(shù)均達(dá)到最高值,成蟲數(shù)大約1.0個(gè)/mm,蟲卵數(shù)大約12.0個(gè)/mm2;第6天,幼蟲數(shù)

13、達(dá)到最高值,60.0個(gè)/mm2。第3組(OP50-LB):第4天,成蟲和蟲卵數(shù)均達(dá)到最高值,成蟲數(shù)大約1.3個(gè)/mm,蟲卵數(shù)大約4.3個(gè)/mm2;第6天,幼蟲數(shù)達(dá)到最高值,9.3個(gè)/mm2。第4組(JM109-LB):第4天,成蟲和蟲卵數(shù)均達(dá)到最高值,成蟲數(shù)大約0.7個(gè)/mm,蟲卵2;,22第10期󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁李有全等:秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)與保存研究10039󰀁

14、0個(gè)/mm2。2.2󰀁蟲體形態(tài)學(xué)觀察󰀁󰀁培養(yǎng)2448h后,于100倍光學(xué)顯微鏡下,在NGM培養(yǎng)基上可見大量散在蟲卵、14期幼蟲以及成蟲(見圖1)。在即將孵出的蟲卵中,有時(shí)可見蟲體在卵內(nèi)偶爾蠕動(dòng)的現(xiàn)象。成蟲體長1mm左右,通身透明,頭部較粗,體表有一層角質(zhì)覆蓋物,有4條主要的表皮索狀組織及1個(gè)充滿體液的假體腔。雌雄蟲可通過尾部的形態(tài)差異來鑒別:雌雄同體的蟲體尾部較細(xì)長;而雄蟲尾部較粗且尾端鈍圓。蟲體在固體培養(yǎng)基表面蠕動(dòng)較慢,但在液體中運(yùn)動(dòng)較快。存活(見表2)。表1󰀁秀麗隱桿線蟲在含不同濃度甘油的LB液中凍存時(shí)的存活率Table1&#

15、983041;ThesurvivalrateofC.elegansinLBmediumconta-iningdifferentconcentrationofglycerol保存溫度/󰀁-196-80-200.3500不同甘油濃度(mL/L)下的存活率/%SurvivalrateofC.elegansatdifferentconcentrationofglycerol502178010025640150122702007202505003000.700表2󰀁秀麗隱桿線蟲在含不同濃度甘油的PBS液中凍存時(shí)的存活率Table2󰀁Thesurvivalr

16、ateofC.elegansinPBSbufferconta-iningdifferentconcentrationofglycerol保存溫度/󰀁-196-80-200360.5不同甘油濃度(mL/L)下的存活率/%SurvivalrateofC.elegansatdifferentconcentrationofglycerol500520.510003811500150.520001002500803000002.5󰀁含不同濃度甘油的水溶液的凍存試驗(yàn)󰀁󰀁試驗(yàn)結(jié)果表明,在液氮中,線蟲僅在含150mL/L甘油水溶液中存活,存活率為

17、1%。在-80󰀁圖1󰀁秀麗隱桿線蟲各期蟲體形態(tài)󰀁100󰀁Fig.1󰀁ThemorphologyofdifferentstageofC.elegansA:卵;B:成蟲;C:14期幼蟲A:Eggs;B:Adult;C:Larvaeoffourstages時(shí),甘油濃度從0到300mL/L,蟲體均能存活,但甘油含量為100mL/L時(shí)存活率最高,達(dá)8%。在-20󰀁條件下,在甘油濃度從0到300mL/L時(shí),僅有少數(shù)幼蟲存活(見表3)。表3󰀁秀麗隱桿線蟲在含不同濃度甘油的水溶液中凍存時(shí)的存活率Ta

18、ble3󰀁ThesurvivalrateofC.elegansindifferentconcen-trationofglycerolsolution保存溫度/󰀁-196-80-2000.50不同甘油濃度(mL/L)下的存活率/%SurvivalrateofC.elegansatdifferentconcentrationofglycerol50062100081.5150141200021300070.22.3󰀁含不同濃度甘油的LB液的凍存試驗(yàn)󰀁󰀁試驗(yàn)結(jié)果表明,在液氮中,甘油濃度從0到300mL/L,存活率先升高再

19、降低,甘油含量為100mL/L時(shí)存活率最高,達(dá)25%。在-80󰀁時(shí),甘油含量為50mL/L時(shí)存活率最高,達(dá)78%;然后隨甘油濃度升高,存活率迅速下降;當(dāng)甘油濃度達(dá)到250300mL/L時(shí),蟲體不能存活。在-20󰀁條件下,蟲體都不能存活(見表1)。另外在液氮中,成蟲和幼蟲都能存活;而在-80󰀁條件下,僅有幼蟲存活。2.4󰀁含不同濃度甘油的PBS液的凍存試驗(yàn)󰀁󰀁試驗(yàn)結(jié)果表明,在液氮中,蟲體不能存活;而在-80󰀁和-20󰀁條件下,僅有幼蟲存活。-80󰀁時(shí),甘

20、油含量為50mL/L時(shí),蟲體存活率最高,達(dá)52%;然后隨甘油濃度升高,存活率迅速下降,當(dāng)甘油含量達(dá)到300mL/L時(shí),蟲體不能存活;在-20󰀁條件下,甘油濃度從0到150mL/L時(shí),僅有少數(shù)蟲;,3󰀁討論󰀁󰀁秀麗隱桿線蟲作為理想的動(dòng)物模型,已成功應(yīng)用于生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域。本研究結(jié)果表明,在20󰀁時(shí),秀麗隱桿線蟲在OP50-NGM培養(yǎng)基上的生長比在其他3種培養(yǎng)基(JM109-NGM、OP50-LB、-1004中國獸醫(yī)科學(xué)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué),2003,20(10):110-112.第41卷線蟲的培養(yǎng)和保存方法進(jìn)行了研究5-7

21、,如Bren-ner發(fā)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲在530󰀁范圍內(nèi)均能生長,NGM培養(yǎng)基比較適合蟲體生長,蟲體在液氮中可以長期保存。Ward等98LIUEn-qi,CANGLin-rang.Animalmode-lreviewingCae-norhabditiselegansJ.AnimalScienceandAnimalMedicine,2003,20(10):110-112.(inChinese)4󰀁KENYONC.ThenematodeCaenorhabditiselegansJ.Sci-ence,1988,240(4858):1448-1452.5󰀁W

22、ILLIAMSPL,DUSENBERYDB.UsingthenematodeCae-norhabditieleganstopredictmammalianacutelethalitytome-tallicsaltsJ.ToxicolIndHealth,1988,4(4):469-478.6󰀁KENNEYSJ,ANDERSONGL,WILLIAMSPL,etal.Per-sistenceofEscherichiacoliO157:H7,Salmonellanewport,andSalmonellapoonainthegutofafree-livingnematode,Caenor

23、habditiselegans,andtransmissiontoprogenyandunin-fectednematodesJ.IntJFoodMicrobiol,2005,101(2):227-236.7󰀁HASHMIS,HASHMIG,GAUGLERR.Genetictransforma-tionofanentomopathogenicnematodebymicroinjectionJ.JInvertebrPathol,1995,66(3):293-296.8󰀁BRENNERS.ThegeneticsofCaenorhabditiselegansJ.Ge-

24、netics,1974,77(1):71-94.9󰀁WARDS,BURKEDJ,SULSTONJE,etal.Genomicorgan-izationofmajorspermproteingenesandpseudogenesinthenematodeCaenorhabditiselegansJ.JMolBiol,1988,199(1):1-13.10󰀁SULSTONJ,HODGKINJ.MethodsintheNematodeCae-norhabditiElegansM.NewYork:ColdSpringHarborLa-boratoryPress,1988

25、:587-606.11󰀁龐林海,杜愛芳,李孝軍,等.秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)特性與保存方法研究J.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007,19(1):34-36.PANGLin-hai,DUA-ifang,LIXiao-jun,etal.Studyoncul-tureandpreservationofCaenorhabditiselegansJ.ActaAg-riculturaeZhejiangensis,2007,19(1):34-36.(inChinese)12󰀁杜愛芳,龐林海,李孝軍,等.秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)培養(yǎng)特性研究(初報(bào))C/中國畜牧獸

26、醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第五次代表大會(huì)暨第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.桂林,2004:345-347.DUA-ifang,PANGLin-hai,LIXiao-jun,etal.Studyonchar-acteristicsofcultivationofCaenorhabditiselegans(FirstRe-port)C/TheProceedingsofthe5thCongressand8thCon-ferenceoftheBranchofLivestockParasitologyofChineseAssociationofAnimalandVeterinarySciences.Guilin,2004:345-347.(inChinese)(責(zé)任編輯󰀁胡弘博)󰀁、Sulston等10曾經(jīng)使用將NGMK培養(yǎng)基培養(yǎng)蟲體。后來又有龐林海等11培養(yǎng)基與K培養(yǎng)基成分比較后,發(fā)現(xiàn)NGM培養(yǎng)基提供的營養(yǎng)成分更加全面,且