分子生物學(xué)作業(yè)

1、分子生物學(xué)作業(yè)一、名詞解釋1. 斷裂基因真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)相互間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因成為斷裂基因。2. 單核苷酸多態(tài)性單核甘酸多態(tài)性是由基因組 DNA上的單個堿基的變異引起的 DNA序列多態(tài)性。是人群中個體差異最具代表性的DNA多態(tài)性，相當一部分還直接或間接與個體的表型差異、對疾病的易感性或抵抗能力、對藥物的反應(yīng)性等相關(guān)。單核苷酸多態(tài)性被認為是一種能穩(wěn)定遺傳的早期突變。一、 簡答題1. 簡述真核生物基因組的結(jié)構(gòu)與功能特點。真核生物基因組DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，儲存于細胞核內(nèi)，除配子細胞外，體細胞

2、內(nèi)基因組是雙份的（即雙倍體），有兩份同源的基因組。真核生物的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。即一個結(jié)構(gòu)基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄生成一個mRNA子，再翻譯生成一條多肽鏈。真核生物基因組存在重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)可達百萬次以上。真核生物基因組中不編碼的區(qū)域多于編碼的區(qū)域。真核生物的大部分基因都含有內(nèi)含子，因此，基因是不連續(xù)的（斷裂基因）真核生物基因組遠遠大于原核生物的基因組，具有多復(fù)制起始點，而每個復(fù)制子的長度較小。2. 試述雙向凝膠電泳技術(shù)的基本原理。雙向凝膠電泳技術(shù)是指第一向的固相 pH梯度等電聚焦電泳與 第二向SDS-PAG祖成的分離系統(tǒng)，也稱雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳， 簡稱2-DE。等電聚焦電泳是基于蛋白質(zhì)等電點（

3、pI）的差異進行 分離，SDS-PAGEU是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量（MW的不同進行分離。其中等電聚焦指：在電場中電泳基質(zhì)形成一個從正極到負極不斷增大的PH梯度，由于蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，帶負電荷的蛋白質(zhì)分子向正極移動，待正電荷的蛋白質(zhì)分子向負極移動，當?shù)鞍踪|(zhì)分子運動到各自的PI 處時，所帶凈電荷變?yōu)榱?，于是停止遷移而留在該位置上，這種不同的蛋白質(zhì)分別聚焦在各自的PI 處，形成一條狹窄穩(wěn)定的區(qū)帶而彼此分開的現(xiàn)象就稱為等電點聚焦。SDS-PAG罡在PAG系統(tǒng)中加入SD莊口還原劑后所組成的電泳 系統(tǒng)。SDSM一種陰離子去垢劑，疏水端能插入蛋白質(zhì)分子內(nèi)，破 壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵及疏水作用，改變蛋白質(zhì)分子的三級

4、和四 級結(jié)構(gòu)；還原劑則斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子去折疊，結(jié)構(gòu)變得舒展。蛋白質(zhì)分子與 SDS充分結(jié)合后，形成帶負 電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，所帶負電荷大大超過蛋白質(zhì)分子原有 的電荷量，消除了不同分子間原有電荷的差異。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的遷移率不再與電荷相關(guān)，而主要取決于橢圓棒的長軸長度，及蛋白質(zhì)的分子量大小。1. 分子克隆技術(shù)包括哪些基本步驟？包括 : 目的基因的獲取; 載體的選擇; 目的基因與載體連接; 重組DNA1!入受體細胞；重組體的篩選。2. 目的基因和載體連接主要有哪些方法？粘性末端DN砌子的連接 平末端連接法通過同聚尾連接3. 簡述分子克隆中

5、常用的工具酶及其作用。限制性核酸內(nèi)切酶：能根據(jù)需要在特定的位點上精確切割雙鏈DNA分子。DNAt合酶：1. DNA聚合酶I和Klenow片段DNA聚合酶I 5' -3' DN謙合酶活性3' 5'核酸外切酶活性5' 3'核酸外切酶。Klenow 片段作用活性補齊雙鏈 DNA勺3'末端，同時可使3末端DN雨記上 同位素。cDNAS隆中，合成cDNA第二鏈。DNAff列分析。2.Taq DNA 聚合酶 Taq酶具有5' -3'聚合酶活性和依賴于聚合作用的 5' -3' 外切酶活性。3.逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄作用核酸酶H的

6、水解作用依賴D N A 的D N A聚合酶作用。4 .末端脫氧核甘酰轉(zhuǎn)移酶在載體或目的基因3末端加上互補的同質(zhì)多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重組連接。用于DNA 3'末端的同位素探針標記。DNA11接酶：能催化兩個互補粘性末端雙鏈 DN心子的5'磷酸基團與3羥基形成磷酸二酯鍵，將具有相同粘性末端或平末端的DNA連接起來。堿性磷酸酶：能除去DNAt段上的5'磷酸以防自身連接；在使用T4多核甘酸激酶和32P同位素標記前，從RNAlg DNA1出去5'端的 磷酸。 T4 多核苷酸激酶：既能連接粘性末端，又能連接平末端。核酸酶S1:可除去粘性末端以產(chǎn)生平末端，除去

7、 cDNAa成時形成 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，分析RNA勺莖環(huán)2構(gòu)和DNA-RN冊子的雜交情況。4. 舉例說明載體應(yīng)具備的基本要素。能自我復(fù)制并具較高的拷貝數(shù)分子量一般<10Kb帶有遺傳篩選標記有適當?shù)南拗泼该盖形稽c，便于外源 DNA勺插入和篩選如pBR322質(zhì)?？寺≥d體，它是由一系列大腸桿菌質(zhì)粒 DNAS過DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的雙鏈克隆載體，長為4.36Kb。它含有一個能保證高拷貝自我復(fù)制的復(fù)制起始點（Ori ） ，并裝有四環(huán)素抗性（Tetr ）基因和氨節(jié)青霉素抗性（Amp?；蚬┚浜Y選。在這兩個抗性基因中分別含有BamH I 和 Pst I 等限制酶的單一酶切位點，用于插入外源DNAt段。如

8、有外源基因的插入，會導(dǎo)致這些標志性基因的失活。5. 簡述雙抗生素篩選和藍白斑篩選的原理。雙抗生素篩選：某些質(zhì)粒載體如pBR322質(zhì)粒中有Ampr和Tetr抗性 基因，在這兩個基因中裝有幾個常用的 MCS如將外源DNAt段插入BamH識別序列時，則此質(zhì)粒由 Tetr變?yōu)閷λ沫h(huán)素敏感（Tets ）。這種重組子導(dǎo)入宿主菌后，宿主菌在含四環(huán)素瓊脂糖平皿上不能生長而在含氨芐青霉素的平皿上能夠生長。在含四環(huán)素和氨芐青霉素的平皿上都能夠生長的細菌只含有空載體，此篩選方法稱為雙抗生素篩選法藍白班篩選：某些質(zhì)粒載體帶有大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ 基因，該基因含一段編碼-半乳糖甘酶氨基末端145個氨基酸-肽的D

9、NA片段， IPTG 可誘導(dǎo)此片段合成，此片段能與宿主細胞所編碼的缺陷型- 半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)- 互補，形成完整的- 半乳糖苷酶，催化指示劑底物X-gal 形成藍色產(chǎn)物，結(jié)果重組克隆呈藍色菌落。當外源基因插入lacZ 基因中 MCS， lac - 肽基因閱讀框架被破壞，細菌內(nèi)將無- 半乳糖苷酶活性，結(jié)果重組克隆呈白色菌落，這是常用的藍白斑篩選法。6. 有哪些常用的探針標記物？常用的探針標記物有：光敏生物素、生物素化補骨脂素、FITC 和羅丹明、地高辛、%32PdNTP 丫 32PdNTP 35S、3H Bio-ll-dUTP、HR林口 ALB7. 如何進行探針的標記？缺口平移法、隨機引物法、

10、末端標記法、聚合酶鏈式反應(yīng)。8. 影響核酸分子雜交的因素有那些？如何進行雜交條件的優(yōu)化？影響因素：1）核酸分子的濃度和長度：核酸濃度越大，復(fù)性速度越快。探針長度應(yīng)控制在50-300 個堿基對為好。2）溫度：溫度過高不利于復(fù)性，而溫度過低，少數(shù)堿基配對形成的局部雙鏈不易解離，適宜的溫度是較 Tm值低25度。3）離子強度：在低離子強度下，核酸雜交非常緩慢，隨著離子強度增加，雜交反應(yīng)率增加。高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，所以進行序列不完全同源的核酸分子雜交時必須維持雜交反應(yīng)液中鹽濃度和洗膜液中的鹽濃度。4）雜交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸雜交的 TM直，它有以下優(yōu)點：在低溫下探針更穩(wěn)定；能更

11、好地保留非共價結(jié)合的核酸。5） 核酸分子的復(fù)雜性：是指存在于反應(yīng)體系中的不同順序的總長度。兩個不同基因組DNA變性后的相對雜交速率取決于樣品濃度絕對一致時的相對復(fù)雜性（即DNA中的堿基數(shù)）。6）非特異性雜交反應(yīng)：在雜交前應(yīng)對非特異性雜交反應(yīng)位點進行封閉，以減少其對探針的非特異性吸附作用。雜交條件的優(yōu)化：1）探針的選擇：檢測單個堿基改變選用寡核苷酸探針；檢測單鏈靶序列選用與其互補的DN嬋鏈探針或RN琳針；長的雙鏈DN砥針特異性較強，適宜檢測復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體；100bp 左右的探針適合原位雜交。2）探針的標記方法：在檢測單拷貝基因序列時，應(yīng)選用標記效率高、顯示靈敏的探針標記方法；在對靈敏

12、要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術(shù)和價廉的HRPS示系統(tǒng)等。3）探針的濃度：隨探針濃度增加，雜交率也增加，在較窄的范圍內(nèi)， 隨探針濃度增加，敏感性增加。膜雜交中32P標記探針與非放射性標 記探針的用量分別為 5 10ng/ml和251000ng/ml ;原位雜交中， 一般各種標記探針，其用量均為 0.5 5.0 w g/ml。4）雜交最適溫度：若反應(yīng)溫度低于 Tm 1015C,堿基順序高度同 源的互補鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯配對減少。一般情況下，在不含變性劑甲酰胺時，大多數(shù)雜交反應(yīng)在 65c進行，當含50期酰胺時，在 42c進行。5）雜交反應(yīng)時間：雜交時間短了，反應(yīng)無法完成；長了引起非

13、特異 結(jié)合增多。一般雜交20 h左右。6）洗膜溫度：雜交后的最終洗膜溫度一般應(yīng)低于 Tm直572c進行c 7）雜交液的優(yōu)化：通常用于DNA雜交的標準雜交液為5*SSC,1.0%casein, 0.1%十二烷基月K氨酸，0.02%十二烷基硫酸鈉。必要時 可以加一些雜交促進劑，常用的有硫酸葡聚糖，它能促進DNAJ之間 的締合，10麻酸葡聚糖存在時雜交速度可提高10-100倍，缺點是因 其相對分子質(zhì)量大會引起溶液黏度大大增加。聚乙二醇（ PEG也是 常見的雜交促進劑。聚丙烯酸的鈉鹽，使用濃度為 2%-4%優(yōu)點是粘 稠度低，價格低廉。一、名解1 .生物大分子：指的是作為生物體內(nèi)主要活性成分的各種分 子

14、量達到上萬或更多的有機分子。 常見的生物大分子包括蛋白質(zhì)、 核酸、脂類、糖類。2 .酚抽提法：最初于1976年由Stafford及其同事提出，通 過改良，以含EDTA SDS及無DNA!的RNAS裂解緩沖液破碎細 胞，經(jīng)蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA重復(fù) 抽提至一定純度后，根據(jù)不同需要進行透析或沉淀處理獲得所需 的DNA羊品。3 .凝膠過濾層析：凝膠過濾層析也稱分子排阻層析或分子篩 層析，利用凝膠分子篩對大小、形狀不同的分子進行層析分離， 是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。4 .巢式PCR巢式PC幅一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,使 用兩對（而非一對）P

15、CRSI物擴增完整的片段。第一對PC咫I物擴 增片段和普通PCRf似。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在 第一次PCRT增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次 PCRT物內(nèi)部，使得 第二次PCRT增片段短于第一次擴增。巢式 PCR勺好處在于，如 果第一次擴增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引 物配對并擴增的概率極低。因此，巢式 PCR勺擴增非常特異。5 . Real-time PCR實時熒光定量PC敬術(shù)是指在PCR5應(yīng)體 系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR8程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。6 .變性：模板DNAS加熱至94c左右5min聚合酶鏈式反應(yīng) 時間后，

16、使模板DNAX鏈或經(jīng)PCRT增形成的雙鏈DNAS離，使 之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備。7 .復(fù)性：模板DNAS加熱變性成單鏈后，溫度降至55c左右,引物與模板DNA#鏈的互補序列配對結(jié)合8 .退火：溫度突然降至37-58 C時，變性的DN嶂鏈在堿基 互補的基礎(chǔ)上重新形成氫鍵開始復(fù)性。一般退火溫度比引物Tm值約低5C。二、問答1 .根據(jù)作用原理生物分子的分離純化有那幾類？答：根據(jù)作用原理生物分子的分離純化可分為：（1）根據(jù)分子極 性大小和溶解度的不同，如溶劑提取技術(shù)、鹽析法、分配層析法、分 級沉淀法等；（2）根據(jù)分子形狀和大小不同，如凝膠過濾層析等；（3） 根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)不同

17、，如選擇性吸附與吸附層析法等；（4）根據(jù)分子帶電性（電離性質(zhì)）的差異，如離子交換層析、電泳、等電聚焦法 等。（5）根據(jù)配體特異性，如親和層析。2 .什么原因易引起DN解解，該如何解決？答：引起DN解解的原因有：1）材料不新鮮或反復(fù)凍融2）未 很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性3）提取過程操作過于劇烈，DNAt機械 打斷4）外源核酸酶污染5）反復(fù)凍融。相應(yīng)的解決方法有：1）盡量 取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融；液氮研磨或勻漿組織后， 應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液2）在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的 DNA寸，可增加裂解液中螯合劑的含量 3）細胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng) 盡量輕柔4）所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)

18、高溫滅菌 5）將DNA# 裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融。3 .簡述PC敬術(shù)的基本原理及其反應(yīng)體系的一般組成?答：PCF術(shù)的基本原理是DNA勺半保留復(fù)制，是在模板 DNA 引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DN膘合酶的酶促反應(yīng)。在 反應(yīng)中混合下列物質(zhì)：模板DNA四種dNTP（包括dATP dTTP dGTP dCTP、引物1、引物2、TaqDNA!合酶、緩沖液及 Mg2+ （MgC， 然后經(jīng)下列過程大量擴增靶 DNA基本的反應(yīng)分變性、退火、延伸等 三步完成。4 .試分析PCRH現(xiàn)非特異性擴增產(chǎn)物的原因及解決方法？答：（1）引物特異性不高，引物用量過多，應(yīng)調(diào)換引物或降低 引物用量。（2） T

19、aqDNA!合酶質(zhì)量不好或用量偏高，應(yīng)降低酶量或 使用質(zhì)量較好的酶。（3） Mg2裱度過高，可適當調(diào)節(jié)Mg2軟度。（4） 退火溫度過低，退火及延伸時間偏長，可提高退火溫度，減少退火及 延伸時間，或者采用二溫循環(huán)PCRa行擴增。（5）熱循環(huán)次數(shù)過多， 適當增加模板用量，減少循環(huán)次數(shù)。一、名解1. 代謝組學(xué)：通過考察生物體系（細胞、組織或生物體）受刺激或擾 動后（如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化后），其代謝產(chǎn)物的變化 或其隨時間的變化，來研究生物體系的一門科學(xué)。2. 毛細管電泳：是以毛細管為分離通道、采用高壓直流電場為驅(qū)動力 的的新型液相分離技術(shù)，通過離子化合物的質(zhì)荷比（ m/z）不同造成 遷移速

20、率不同來實現(xiàn)分離。3. NMR即核磁共振技術(shù)，是基于具有自旋性質(zhì)的原子核在核外磁場 的作用下，吸收射頻輻射而產(chǎn)生的能級躍遷譜學(xué)，主要用于反映化合物結(jié)構(gòu)中的H和C原子的位置信息。4. gene therapy ：基因治療將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，最終達到治療疾病的目的。5. stem cell ：干細胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。6. CRISPR/Cas system： （ clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated （Cas）

21、 ）系統(tǒng)廣泛存在于細菌及古生菌中，是機體長期進化形成的RNA指導(dǎo)的降解入侵病毒或噬菌體DNA的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)?；诩毦倪@種免疫功能，人們把II型 CRISPR-Cas系統(tǒng)改造成一種全新的人工核酸內(nèi)切酶，從而使該系統(tǒng) 能夠?qū)Π谢蜻M行修飾。二、問答1. 簡述代謝組學(xué)特點？答： （ 1 ）關(guān)注于內(nèi)源性小分子化合物；（ 2）對生物體系中的小分子化合物進行定性定量研究；（ 3） 內(nèi)源性小分子化合物的上調(diào)和下調(diào)指示了與疾病、毒性、基因修飾或環(huán)境因子的影響；（ 4）內(nèi)源性化合物的特點用來表征疾病和藥物篩選。2. 簡述MicroRNA的生物合成過程？答：（1） miRNA基因被車錄成pri-miRNA （RNA 聚合酶H）; （2） pri-miRNA 被 剪 切 成 具 有 70-100 個 核 苷 酸 的 pre-miRNA (Drosha,DGCR8); (3) pre-miRNA 從核內(nèi)被轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)(Exportin-5, Ran-GTP); (4) pre-miRNA被剪切成21-25個核甘酸的雙鏈RNA雙 體(Dicer,TRBP,PACT) ; (5)雙鏈RN敏體中成熟 miRNA®會選