實(shí)驗(yàn)(三)厚薄血膜涂片法檢測(cè)病原體

1、實(shí)驗(yàn)（三）厚薄血膜涂片法檢測(cè)病原體實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、 掌握班氏和馬來(lái)絲蟲(chóng)微絲蚴、布氏姜片吸蟲(chóng)成蟲(chóng)及蟲(chóng)卵的形態(tài)結(jié)構(gòu)。2、 掌握厚薄血膜涂片法操作過(guò)程及應(yīng)用3、 加深絲蟲(chóng)和布氏姜片吸蟲(chóng)的有關(guān)理論內(nèi)容。4、 了解布氏姜片吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的形態(tài)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1、 復(fù)習(xí)絲蟲(chóng)、布氏姜片吸蟲(chóng)的有關(guān)理論內(nèi)容。2、 觀察班氏微絲蚴、馬來(lái)微絲蚴的玻片標(biāo)本；觀察布氏姜片吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵。3、 小白鼠尾取血厚薄血膜涂片法操作，瑞氏染色鏡檢。4、 觀察布氏姜片吸蟲(chóng)的成蟲(chóng)大體標(biāo)本。5、 作業(yè)：畫(huà)出班氏微絲蚴、馬來(lái)微絲蚴、布氏姜片吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵的形態(tài)。微絲蚴班氏微絲蚴馬來(lái)微絲蚴大小244296×537177230×56體態(tài)柔和，彎

2、曲自然，無(wú)小彎彎曲僵硬，大彎上有小彎頭間隙（長(zhǎng)寬）較短，11或12較長(zhǎng)，21體核較小，分布均勻，清晰可數(shù)較大，排列緊密，相互重疊，不宜分清尾核無(wú)有2個(gè)尾核，前后排列，尾核出角皮膨大布氏姜片吸蟲(chóng)成蟲(chóng)（染色標(biāo)本） （l）蟲(chóng)體呈長(zhǎng)橢圓形，前端略尖，后端鈍圓，背面稍隆起，腹面扁平，較肥厚。長(zhǎng)2075mm，寬820mm，厚0.53mm。 （2）口吸盤(pán)位于蟲(chóng)體亞頂端；腹吸盤(pán)靠近口吸盤(pán)，呈漏斗狀，較大，肌肉發(fā)達(dá)，比口吸盤(pán)大 45倍，肉眼可見(jiàn)。 （3）消化道有口、咽、食道和腸支。腸支在腹吸盤(pán)前分為兩支，呈波浪狀向后延伸至蟲(chóng)體末端，形成盲管。 （4）雌雄同體。兩個(gè)睪丸前后排列，高度分支呈珊瑚狀，占據(jù)蟲(chóng)體的后半部

3、。 卵巢分支，位于睪丸與子宮之間，以輸卵管與卵模相通。卵模位于睪丸前的體中橫線上，外有梅氏腺包繞，有勞氏管，無(wú)受精囊。卵黃腺發(fā)達(dá)，分布于蟲(chóng)體兩側(cè)，從腹吸盤(pán)以下直至蟲(chóng)體末端。生殖孔位于腹吸盤(pán)前緣。布氏姜片吸蟲(chóng)卵 為寄生于人體最大的蟲(chóng)卵。大小為130140×8085m，淡黃色，橢圓形，卵殼薄而均勻，一端有一不明顯的卵蓋，卵內(nèi)含一個(gè)卵細(xì)胞和2040個(gè)卵黃細(xì)胞。厚薄血膜涂片法：常用于絲蟲(chóng)病，瘧原蟲(chóng)的檢測(cè)。操作方法：   (1)采血：采血時(shí)間  在普查時(shí)，一般無(wú)法考慮采血時(shí)間。在臨床上，對(duì)現(xiàn)癥病人一般可隨時(shí)采血，但為了提高檢出率，就應(yīng)當(dāng)考慮采血的適當(dāng)時(shí)間。對(duì)典型發(fā)

4、作的間日瘧及三日瘧患者，應(yīng)選擇發(fā)作后數(shù)小時(shí)至10余小時(shí)采血為好。此時(shí)瘧原蟲(chóng)發(fā)育至環(huán)狀體乃至大滋養(yǎng)體，蟲(chóng)體大，瘧色素已形成，受染紅細(xì)胞也出現(xiàn)變化，有利于瘧原蟲(chóng)的檢出。惡性瘧原蟲(chóng)大滋養(yǎng)體和裂殖體是在皮下、脂肪和內(nèi)臟微血管中發(fā)育的，通常在外周血液中不易查到，配子體在環(huán)狀體出現(xiàn)1周后方能見(jiàn)于外周血液，故在發(fā)作時(shí)采血。 采血部位  從患者耳垂或指尖（以左手無(wú)名指為宜）取血，嬰兒通常從大姆趾第二趾骨腹面針刺采血。采血方法  用75%乙醇棉球消毒取血部位皮膚，待干后用左手拇指和食指捏住采血部位，右手持針迅速刺入皮膚，待血液流出或輕輕擠出血滴，供制作涂片用，采血完畢用干棉球輕壓傷口止血。(

5、2)制片：薄血膜的制作  取1滴血于1張潔凈的載玻片上，選1張邊緣平整、光滑的載玻片作推片，用左手拇指和中指夾持其兩端，將推片的邊緣中點(diǎn)與血滴接觸，并與載玻片呈30o45o夾 角，待血滴沿推片邊緣向兩側(cè)展開(kāi)后，立即由右向左迅速推成薄血膜。理想的薄血膜要求紅細(xì)胞均勻地鋪成一層，無(wú)裂痕，其末端凸出呈舌尖形。注意：推片時(shí)用力 和速度要均勻，不能中途停頓或重復(fù)推片，以免造成血膜斷裂或厚薄不勻。如取血量多，夾角宜??；取血量小，則夾角可大些。厚血膜的制作  用推片的一角接觸刺血點(diǎn)上的血滴，取血2滴，置載玻片上，并從里向外作旋轉(zhuǎn)涂布，使成直徑為0.8cm大小的圓形血膜，厚薄要均勻，然后平

6、置桌上，待自然干燥。厚薄血膜同片制作  用目測(cè)法將載玻片從右到左等分成6格，厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前緣至第6格中部，第1、2格可用于貼標(biāo)簽，制作厚、薄血膜方法同上。(3)染色：瑞氏染色法（Wrightstaining）  厚血膜需先溶血，溶血方法為：滴加數(shù)滴蒸餾水于厚血膜上，使紅細(xì)胞溶解，待血膜呈灰白色時(shí)，將水倒去，晾干。取制作好的血片，在血膜兩端用玻璃蠟筆各劃一豎線，滴加瑞氏染液數(shù)滴，使其布滿(mǎn)血膜，染液中含甲醇，約0.51分鐘將血膜固定，然后加等量緩沖液或蒸餾水，輕搖載玻片，使之與染液混勻，很快液面出現(xiàn)燦銅色膜，約經(jīng)35分鐘染色后，用緩沖液、蒸餾水或自來(lái)水

7、沖洗。注意：切勿傾去染液再用水沖洗，以免血膜上沉著染料顆粒，影響鏡檢。如厚、薄血膜涂在同一張載玻片上，先在厚、薄血膜中間及兩側(cè)用蠟筆各劃一條豎線，滴蒸餾水于厚血膜上，使之溶血，待血膜干后，與薄血膜一起染色。吉氏染色法（Giemsastaining）  取吉氏染液原液，用pH7.07.2的磷酸緩沖液稀釋1020倍。厚血膜不需固定，薄血膜先用甲醇固定（如厚血膜在同一張載玻片上，切勿延及厚血膜），干后滴加稀釋的吉氏染液，布滿(mǎn)血膜（如大批染片，可置入染色缸），染2030分鐘，沖洗，晾干后鏡檢。稀釋的染液，宜用時(shí)現(xiàn)配，否則易產(chǎn)生沉淀，影響染色效果，大批染片時(shí)，應(yīng)根據(jù)染色時(shí)的條件，如不同病人的血

8、片，染色時(shí)的室溫、染液稀釋程度、沖洗水的pH值等情況的不同，先試染少量血片，摸索出染色效果最佳的時(shí)間和條件，再大批染片。此外，染色時(shí)間應(yīng)隨染液稀釋情況作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，染液濃度高，染色時(shí)間可短些，反之則長(zhǎng)。吉氏染液配制：吉氏染劑粉1g，甘油50ml，甲醇50ml。將染劑粉置研缽中，加少量甘油，充分研磨，再邊加甘油邊研磨，直至甘油用完。然后加少量甲醇，研磨后倒入棕色瓶中，剩余的甲醇分幾次沖洗研缽中的染液，全部倒入瓶?jī)?nèi)，塞緊瓶塞充分搖勻，置65溫箱內(nèi)24小時(shí)或室溫下1周后過(guò)濾，即成原液。瑞氏染色法操作簡(jiǎn)便、快速，臨床上經(jīng)常使用，因甲醇易于蒸發(fā)，如掌握不當(dāng)可能在血膜上產(chǎn)生沉淀，妨礙觀察。同時(shí)染色結(jié)果也不

9、大一致，在較熱的環(huán)境中較易褪 色，保存時(shí)間較短。吉氏染色法染色效果良好，對(duì)厚血膜尤佳。經(jīng)稀釋后的染液對(duì)厚血膜兼有溶血和染色的雙重作用。染色后，瘧原蟲(chóng)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)紅藍(lán)分明，很 少出現(xiàn)沉淀，不易褪色。適用染大批血片標(biāo)本，供教學(xué)使用，但染色需時(shí)較長(zhǎng)。(4)鏡檢  在檢查薄血膜過(guò)程中，有時(shí)遇見(jiàn)與瘧原蟲(chóng)形態(tài)類(lèi)似的物體，應(yīng)注意區(qū)別排除。如單個(gè)血小板附于紅細(xì)胞上，易誤認(rèn)為環(huán)狀體或成長(zhǎng)中的滋養(yǎng)體。成堆的血小板誤以為成熟的裂殖體。血小板的形狀多樣，或呈圓形，卵圓形，有時(shí)呈不規(guī)則多角形，其長(zhǎng)徑約為紅細(xì)胞的1/31/4。 血小板中央部常呈紫紅色顆粒狀結(jié)構(gòu)，周邊部分著色淺，但不如瘧原蟲(chóng)紫紅色胞核與淺藍(lán)色胞質(zhì)分得清楚。此外，還有染色液沉淀顆粒以及偶有細(xì)菌、霉菌、塵粒、 白細(xì)胞碎片重疊于紅細(xì)胞上，很像環(huán)狀體和成長(zhǎng)中的滋養(yǎng)體。但這些物質(zhì)大多呈一種顏色，如細(xì)調(diào)顯微鏡焦距，可以看出它們與紅細(xì)胞不在同一水平面上。厚血膜中 瘧原蟲(chóng)比較集中（一個(gè)視野可見(jiàn)到的細(xì)胞數(shù)約相當(dāng)于20個(gè) 薄血膜視野），但厚血膜經(jīng)溶血后，紅細(xì)胞輪廓已消失，原