腫瘤模型專題

1、腫瘤模型專題1.最新的藥效學指導(dǎo)原則要求化藥臨床前進行至少5種人源腫瘤的體內(nèi)抗癌活性評價，以確定藥效及抗瘤譜。2.瘤株對藥物的敏感性通過體外篩選可以說明，而體內(nèi)評價更大程度上是考慮藥物經(jīng)體內(nèi)吸收、分布、代謝之后的活性，由于目前的腫瘤模型多采用皮下接種，并不能完全反映藥物的組織分布對其影響，所以感覺這種要求就顯得不是很必要。注解：體內(nèi)的敏感性不是僅考慮吸收分布代謝的影響，一些樣品，體外活性都是不錯的，體內(nèi)甚至是瘤內(nèi)直接注射給到很高劑量都沒有效果，腫瘤細胞在體內(nèi)和體外的生存環(huán)境差別很大，體外模擬的生存環(huán)境完全不能體現(xiàn)出體內(nèi)的狀態(tài)。3.皮下接種是一個目前能找到的最好的權(quán)宜之計了，實際上，SFDA明確

2、表示，鼓勵原位腫瘤模型，但是由于技術(shù)的原因，很多瘤株都無法實現(xiàn)。而皮下模型有它的一系列優(yōu)點：穩(wěn)定，便于觀察,易于構(gòu)建，易于控制等等，能夠在一定程度上反映藥物經(jīng)過體內(nèi)過程的療效，所以目前只能用它來進行評價。4.實際上原位腫瘤模型仍然不能很好的反映臨床腫瘤的特點，目前能夠預(yù)見得到最好的模型應(yīng)該是經(jīng)過基因修飾（轉(zhuǎn)基因等）的能夠集中比較均勻的自發(fā)模型，這才是和臨床最接近的腫瘤模型。但是目前的經(jīng)過基因修飾的自發(fā)腫瘤模型種類很少，而且可控制5.6.性差，周期長，所以還要經(jīng)過很長時間的改善才能大規(guī)模的應(yīng)用。常規(guī)的腫瘤細胞株接種后如果不能成瘤，細胞懸液就會被動物吸瘤體積可用游標卡尺量最長徑（a）和最短徑（b）

3、，體積計算公式:V=n ab八2/6,每2-3天測一次。體積二寬八2*長/2的公式計算腫瘤體積；抑瘤率二（對照組-治療組）/對照組*100% ; tumor size=width 2 length 0.52). ;nab2/6 ;關(guān)于腫瘤體積的計算:3.1415926/6 約等于/2。如果想做得講究一點，應(yīng)該用 RTV計算腫瘤體積：RTV （某日某老鼠的相對腫瘤體積）二TV（測量當天該老鼠的腫瘤體積）/TV （分組當天該老鼠的腫瘤體積）*100 ,在此基礎(chǔ)上進行平均值SD等數(shù)據(jù)的計算7.是否必須稱重小鼠的胸腺和脾臟8. 超過7天的腹水再傳代就很容易出現(xiàn)血性；動物的周齡也不要太大，6周左右。傳代

4、次數(shù)太多也很容易出現(xiàn)血性腹水。血性腹水可以離心后加0.17 N的NH4CL溶液破紅細胞，然后精確一些的控制條件（接種量，傳代時間，動物周齡等）傳幾代，很多情況F再傳一兩代后會有不血性的種鼠出現(xiàn)，然后用這只種鼠的腹水繼續(xù)傳代9. 皮下接種與剝瘤子：小鼠腫瘤剝瘤子是一個艱難的過程，但是可以一定程度上的改善一下：接種的時候要精確控制接種在皮下，靠皮內(nèi)會與皮膚強烈粘連，靠肌肉會與肌肉強烈粘連，而且不要太靠腋窩里面，可以往尾部靠一些，也可以稍微的往背部靠一點,不要往腹部靠，容易使腫瘤被墊料磨爛。10. LD50是毒理中的半數(shù)致死量，ED50是體外試驗中的半數(shù)有效量,般體內(nèi)實驗沒有類似的指標，如果想比較幾

5、個類似物的藥效還是做量效曲線比較好。11. 劑量設(shè)置應(yīng)該按照LD10（10%致死劑量，也叫最大耐受劑量）來分組，一般分別采用 1/2 LD10, 1/4 LD10, 1/7 LD10 或 1/10 LD,但最大劑量不得超過LD10。這里面還得考慮ED 50丄D10與ED50的劑量相差越大越好。 用LD50作為標準設(shè)置劑量是不現(xiàn)實的,因為動物實驗是不可能允許10%以上動物死亡的。12. 說到療效的比較，如只是發(fā)文章，比較不同基團之間可能對母體抑瘤率的影響，一般做做體外試驗，比一比大家的IC50就好了,不太做體內(nèi)。如是真正的篩藥，我個人有些觀點：這個不是孤立起來看某個或者某幾個劑量下誰比誰的抑瘤率

6、高。主要要看誰更具有可開發(fā)性。首先，要考慮它的毒性以及 治療窗口的大小，通俗的說，就是這個要在發(fā)揮療效的劑量下，毒性是否大？比如A藥，10mg抑瘤率有50%，但是體重下降了 20%;而B藥，10mg的時候根本無效，30mg的時候有40%的抑瘤率，60mg的時候抑瘤率高達80%，而且體重幾乎沒有下降，這個時候A藥與B藥如何比較？特別如果是公司篩選新藥，還要考慮成本，病人可接受度（動物上的有效劑量換算到人一天要吃 2斤，這種藥也是不現(xiàn)實的），制劑，工藝等等方面。如果單純從藥理的角度給出答案,至少要考慮毒性和劑量限制 的問題。13. 關(guān)于劑量選擇，LD50的幾分之一是一種比較通用的方法，目前相對更合

7、理一些的劑量選擇是做一個簡單的多次給藥的毒理試驗來確定劑量，我們一般會連續(xù)給藥一周，然后再觀察一周，這樣摸出來的最大劑量可以直接用于藥效試驗，然后其他的劑量都在此劑量的基礎(chǔ)上往下減。14.說到給藥療程，一般初篩的藥物都是連續(xù)天天給藥，qd。但是給藥途徑，特別是i.v與i.p的選擇，我們都是先做一個簡單的PK試驗考察一下，再確定，特別是如果PK試驗的結(jié)果顯示，血藥濃度甚至達不到體外IC50的濃度，那么是否進行體內(nèi)試驗，就有待商榷了。連續(xù)i.p，小鼠的皮膚有時候會變厚，你可以換一邊給藥。15.動物選擇：KM小鼠，裸鼠,C57等均可作為，但是個人認為KM能做出來最好，畢竟比較有普遍性，還是正常生理狀

8、態(tài)的健康動物，比較有說服力,還便宜，裸鼠或者其他特定品種，比較適合特定的瘤株16. 關(guān)于腫瘤細胞活力的問題：一般培養(yǎng)的腫瘤細胞活力往往是不夠的,很難在短時間內(nèi)長到規(guī)定重量，所以建議至少在動物體內(nèi)傳2代，讓腫瘤細胞活力充分體現(xiàn)以后再開始用于實驗.傳代數(shù)次的原因在于讓腫瘤細胞充分活化，要不活化也行，多接種點吧17. 關(guān)于接種部位的問題：以小鼠為例一般可以選擇腋下或者后肢，背部血管不發(fā)達,營養(yǎng)不夠，一般不建議采用.接種一般采用皮下注射，針頭沿皮膚水平進入，然后挑起表皮，注射18. 關(guān)于腫瘤重量的問題：模型組腫瘤重量應(yīng)該不低于0.5g19. 肺內(nèi)原位注射制作腫瘤模型效果頗好，流程如下:麻醉->

9、固定-> 皮膚消毒-> 剪開左側(cè)胸部皮膚，大約第2-3肋間的位置-> 用鑷子輕輕撥開皮下筋膜，可以看到呼吸運動的肺葉-> 將準備好的腫瘤細胞注射入肺<30微升-> 分層縫合OK20.胸膜活檢穿刺針 規(guī)格： #20 #25(14G 12G) L 65 mm ;用途:供人體胸腔穿刺，鉤取胸膜活體組織用21.開始做腫瘤藥效評價，應(yīng)該采用S180這些小鼠腫瘤模型。一個方面這些腫瘤對于藥物很敏感,而且周期短，花費也少。但如果要成藥，裸鼠模型是必需的。22. 一般瘤重的SD在平均值的7080%以下就還湊活，漂亮一點的是在30%以下，實在不行,100%也勉強，就是特別難看

10、，但是SD越大，統(tǒng)計上就越不利 23.皮下腫瘤模型中，腋下最適合腫瘤生長。接種時由裸鼠體側(cè)腰部稍靠上的部位進針，要保證與接種點的距離小于針頭的長度，向頭部方穿行，絕對不能刺破皮膚或者刺破肌肉層，當針頭到達接種位點時注射，退出針頭，這樣操作的目的并不完全是避免漏液,其實熟練后，不需要皮下穿行也不會漏液，主要是避免污染，進針點還有少量污染的可能性的，針頭在皮下穿行一段后，接種點離進針點較遠，最大限度減少污染的可能。24.如果是藥效試驗，不建議你用手術(shù)標本，因為SFDA的臨床前研究指導(dǎo)原則上明確指出要用建株的腫瘤株進行試驗，因為用手術(shù)標本的試驗可重復(fù)性太差25. 一般用4-5WK，體重15- 17g

11、鼠，年輕鼠接種瘤容易長 26.種植腎被膜下：第一該區(qū)免疫豁免，第二貼近腎可以從此獲得充分的養(yǎng)料.在實驗時先用顯微用的鑷子在腎被膜上撕慨一個小口子，然后種植。注意：腎被膜和腎臟是有一個間隙可以用鑷子在被膜下趕腫瘤組織到遠離撕開口處，不用縫合被膜.這樣就可以了27.人腫瘤模型用裸鼠，基本上沒有可成腹水的，只能皮下接種傳代 28. nude mice的數(shù)據(jù)在SCID mice上是比較有參考價值的，另外,因為免疫系統(tǒng)的進一步缺乏，腫瘤生長的進程可能會比nude mice上更快一點29.接種后，用干凈的棉簽按住注射部位才拔針，拔針后再按住10秒種左右，一般不會有液體滲出30. K562第一代細胞接種的成

12、瘤很好，傳一代就很差了，沒有幾只成瘤的，到第三代就全軍覆沒31. 不贊同用7901這個瘤株，國際公認度比較差32. 分組要求平行性，盡量縮小組間差異，組內(nèi)差異是實際情況的反映。你可以按照腫瘤體積分層隨機分組，這樣平行性比較好33. 腫瘤細胞懸液裸鼠接種前稀釋效果順序：相應(yīng)的無血清培養(yǎng)基>卩 BS>sali ne 34.現(xiàn)在常用的陽性對照藥物是 CTX和cisplatin，另外乳腺癌可以用Taxol。陽性藥的劑量途徑和療程不要求和樣品一致，不過給藥途徑盡量一樣。還有，最好選用機制類似或者結(jié)構(gòu)類似的陽性對照。般來說陽性對照的抑制率都會在 60%以上或者更大，少數(shù)情況下只有50%左右。3

13、5.細胞毒類抗腫瘤藥物臨床前體內(nèi)試驗一般至少應(yīng)選用6種人癌移植瘤模型，其中應(yīng)包括II期臨床試驗中擬篩選的腫瘤組織類型。36.針對每一種人癌移植瘤模型，推薦采用相對腫瘤增殖率T/C (% )作為試驗評價指標，評價標準通常為：T/C (% ) >40 %為無效;T/C (% )< 40%,并經(jīng)統(tǒng)計學處理P < 0.05為有效。在體內(nèi)有效性試驗采用的全部人癌移植模型中，一般至少應(yīng)有1/3達到有效標準。注解：對于T/CV40%，按照這個標準，很多現(xiàn)有的一線化療藥物都會被淘汰37. 適于接種的瘤源的直徑最好為 1cm或者稍大一點，直徑2cm可能對于有些瘤株來說會太大了一點。一般來說，插

14、塊法，一個瘤源接種30只動物是沒有問題的，勻漿法一般 2只也可以接種30只了38. 新的抗腫瘤藥物指導(dǎo)原則上強調(diào)要3代以上才能用，并且不能超過1520代(人腫瘤)。39. 只有少部分的小鼠實體瘤可以腹水傳代，人實體瘤幾乎沒有能夠腹水傳代的40. 一般來說，小鼠腫瘤比較推薦路易斯肺癌和B16。國內(nèi)的S180并不好，各實驗室之間的變異很大。國外基本都不用它。其實并不是因為S180有多好大家才選用他，而是他進行實驗的成本低,周期短，操作較容易41.灌胃藥溶解用生理鹽水可以嗎：不一定,根據(jù)混懸效果來看,般多用0.5-2% 甲基纖維素鈉（CMC-Na）42. 實體腫瘤不可以采用生命持續(xù)時間這個指標，這個

15、是明確有規(guī)定43. 正常的實體腫瘤都是越長越大，最后可能會潰破，但是沒有消亡這個現(xiàn)象，如果腫瘤整體的自發(fā)消亡，說明模型有問題，最大可能是被污染了44. 出針掛組織的問題，關(guān)鍵在于針頭的磨制，在針后部的小突起于小缺口吻合后，實體針彎曲方向應(yīng)該與套管針磨制的斜面一致,接種時，實體針要推到底，也就是后面的小突起與小缺口契合,然后針頭 舔住”肌肉層轉(zhuǎn)一圈再退針，還有就是瘤塊一定要完全塞入針頭內(nèi)，外面不能有漏出來的。45.S180、H22不需要測量腫瘤體積，試驗結(jié)束后直接剝?nèi)∧[瘤成瘤46. 瘤株皮下成瘤率好，那么到了原位應(yīng)該會更好47. 建議最好流水線操作，確保每一個步驟都是同一個人做到底的,比如插塊法

16、，可以一個人切，一個人塞瘤塊，一個人接種；比較忌諱每個人自己切自己塞自己接種，然后只做一部分的動物48. B16是小鼠黑色素瘤，宿主一般多用 C57小鼠，因為這個腫瘤的細胞是黑色的，用它做肺轉(zhuǎn)移，在白色的肺葉上是黑色的轉(zhuǎn)移灶,很容易分辨。49. 在注射腫瘤細胞前對小鼠使用"環(huán)磷酰氨"或"放射線照射"，有利于移植瘤的生長50. 對于水不溶藥物：低濃度的 DMSO確實是一個不錯的解決手段,當然這么做進行報批是不能夠被接受的，因為臨床不允許這樣的制劑血液給藥，但是動物實驗湊合可以，1%的濃度很低了，實際上，給小鼠（包括裸鼠）尾靜脈注射 DMSO，5%以下基本沒

17、有任何反應(yīng)，10%的時候需要較慢的速度注射，但是動物也能夠接受，再高就不行了51. 瘤內(nèi)注射：總注射量只能為瘤體積的10%，最多20%，瘤內(nèi)注射有一定的技巧，我們就是用的4號針頭，但是進針點要遠一點,讓針頭在皮下多走一段，然后再刺入瘤內(nèi)，一個腫瘤可以多點注射，但是一定要注意，刺入一點注射完畢以后，針頭退出瘤組織,但是絕對不能退出皮下，然后換個地方再刺進去，一個點只能注射1015ul，不要多打，比如要注射20ul，就分兩個點注射，每個點10ul。52. 腫瘤模型一般常用的有小鼠模型和人腫瘤裸小鼠移植瘤模型。其中用得最多的是皮下模型，另外還有腹水（或者尾靜脈注射）以及原位模型，其他的模型很少用53

18、. 小鼠模型分三大類:a）第一類：以S180、EAC、H22等為代表的，他們的宿主小鼠多選用KM,可產(chǎn)生腹水，也可在皮下成瘤。多以腹水傳代, 實驗時抽取腹水，經(jīng)過一定稀釋后皮下接種構(gòu)建模型， 接踵后 第二天開始給藥，給藥7到10天，接種10天后結(jié)束試驗,ii.i.iii.剝?nèi)∧[瘤稱瘤重。關(guān)于構(gòu)建瘤種：可以用體外細胞株培養(yǎng)后，用PBS懸浮至13x 106/0.1ml/mouse , i.p接種即可，最好用6號左右的針頭，就是常用的2ml 一次性注射的針頭。關(guān)于腹水傳代：觀察到第一代的種鼠肚子較大后（一般約89天左右），可以傳代，傳代時取1ml注射器，用2ml注射器的針頭，種鼠腹部消毒后直接將針頭

19、插入抽取腹水即可，注意不要把針頭插得很深，盡量淺一點，還可以把老鼠拎起來，利用重力，讓腹水集中在某處便于抽取，一般抽個0.5ml就可以了，不用離心，直接用 PBS36倍稀釋后，接種到新的老鼠腹腔，腹水顏色為白色或者略有發(fā)黃都是正常的，但是血性腹水說明不好，需要注意調(diào)整,第二代以后，盡量67天的時候傳代，不要等的時間太久,否則腹水容易血性。三代后可用于試驗。關(guān)于接種進行試驗：這個時候抽取的腹水需要量比較多,般需要處死種鼠后，小心地用消毒眼科剪刀鑷子剝開腹部皮膚，注意不要弄破肌肉，然后，用鑷子（最好是那種 前面有倒勾的鑷子，學名好像是唇型鑷）拎起腹部的肌肉, 用剪刀剪開一個小口，然后用玻璃滴管或者

20、去掉針頭的注 射器吸取腹水。然后經(jīng)過一定的稀釋后，接種到小鼠的腋 下。關(guān)于稀釋量，各個實驗室的情況都不一樣，最好摸索 一下，開始的時候可以適當?shù)挠嫈?shù)，但是要用臺盼蘭染色后計活細胞數(shù)。接種部位在小鼠腋下，但是不要深入到腋 窩里面，會給以后的操作帶來麻煩。接種時的進針處離接 種處遠一點，讓針頭在皮下多走一段，不容易污染。有的 人接種的時候喜歡針頭向上用力，緊貼著表皮往里走，然 后注射的時候感覺阻力較大，打出來的皮丘又緊又圓，這 樣的接種，會使腫瘤與皮膚嚴重粘連，不利于最后腫瘤的 剝?nèi)?。也不要緊靠肌肉，腫瘤會與肌肉嚴重粘連。應(yīng)該在 兩者之間，進針的感覺輕松自如，針頭很自由，雖然打出 來的腫瘤不會很圓很漂亮，但是相對好剝?nèi)∫恍?。iv.關(guān)于觀測指標：主要是按時稱體重，試驗結(jié)束后剝?nèi)∧[瘤稱瘤重。因為出瘤已經(jīng)是接種后的第6天左右了，第10天就結(jié)束時間，瘤體積的數(shù)據(jù)意義就不大。小鼠腫瘤很難 剝，這是沒有辦法的，只能耐心，沒有太好的辦法，剝多 了以后，手上會掌握一些巧力，有一些幫助，但是我們還 是很頭痛小鼠腫瘤試驗結(jié)束。腫瘤組織周圍經(jīng)常會有一些 血竇的形成，弄破后會有血和黃色的液體流出，正常的， 但是剝瘤子的時候不要把它弄破，會嚴重影響瘤重。按照SFDA的規(guī)定，平均瘤重小于1g,或者單個瘤重小于 200mg，認為腫瘤生長不良，試驗作廢。b）第二類：以lew