大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)指標(biāo)及方法

1、大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥效學(xué)指標(biāo)及檢測(cè)方法孫玉亮 池建淮 萬(wàn)毅 余煒 孫世紅 侯杰（安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230038）安徽省教育廳自然科學(xué)自籌重點(diǎn)項(xiàng)目艾灸各組分對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠治療作用及可能機(jī)制研究項(xiàng)目編號(hào)：100408的發(fā)表文章摘 要：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎、破壞性關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕卣鞯穆?、進(jìn)行性、侵襲性自身免疫性疾病，致畸、致殘率極高且大多數(shù)患者反復(fù)發(fā)作。目前，改善臨床癥狀的抗風(fēng)濕藥是治療RA的主要手段，但由于傳統(tǒng)抗風(fēng)濕藥的不良反應(yīng)較大，而生物制劑價(jià)格昂貴，因而患者長(zhǎng)期服用依從性差，不利于疾病控制。因此研制開(kāi)發(fā)有效、不良反應(yīng)

2、小的抗風(fēng)濕藥物勢(shì)在必行。研究并建立合理有效的RA動(dòng)物模型是研制開(kāi)發(fā)有效治療藥物和制訂有效治療措施的關(guān)鍵，而正確的檢測(cè)也能準(zhǔn)確地反映出藥物的療效。因此以Wistar大鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)其進(jìn)行免疫，從關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)定、血清學(xué)、病理學(xué)和影像學(xué)檢測(cè)等方面進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，從而測(cè)評(píng)抗風(fēng)濕藥物藥效。關(guān)鍵詞：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；一般狀態(tài)觀察；關(guān)節(jié)腫脹程度；免疫學(xué)檢測(cè)；病理學(xué)檢測(cè)；影像學(xué)檢測(cè)中圖分類號(hào)：R965.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674 - 6376 (2012) 02 - 0 0Testing indexes and methods in pharmacodynamics experimentof rhe

3、umatoid arthritis with ratsSUN Yu-liang,CHI Jian-huai,Wan Yi,Yu Wei, SUN Shi-hong,Hou JieAnhui University of Traditional Chinese Medicine, Hefei 230038, ChinaAbstract: Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic, progressive, and aggressive autoimmune disease, the main characters of which include joint s

4、ynovial inflammation and destructive arthropathy. RA is teratogenic and most of the patients are with high morbidity repeated attacks in the duration of symptoms. At present, medicine to improve the clinical symptoms of rheumatism is the main treatment for RA. But because of the side effects of trad

5、itional medicine and the cost of biological agents, patients have poor compliance in long-term use and there are difficulties in disease control. Therefore it is imperative to develop effective antirheumatic agents, with small side effects. To study and establish an effective rheumatoid arthritis an

6、imal model is the key to develop effective drugs and make effective treatment measures. Appropriate testing also could reflect the therapeutic efficacy of drugs accurately. So Wistar rats on the immune were used as test animals, and arthritis index evaluation, serologic, pathologic, and iconographic

7、 detection were carried out so as to evaluate the potency of antirheumatic agents.Key words: rheumatoid arthritis (RA); general state observation; joint swelling degree; immunological characteristics; pathology testing; Imaging detection類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征，以慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的全

8、身免疫性疾病，能導(dǎo)致晚期關(guān)節(jié)畸形、功能活動(dòng)障礙，最終導(dǎo)致不同程度的殘疾，甚至影響心、腎、脊椎功能，是主要的致殘性疾病之一，嚴(yán)重影響人類健康1-2。因此，研制有效、不良反應(yīng)小的藥物刻不容緩。而正確的檢測(cè)指標(biāo)及方法對(duì)評(píng)定藥物的療效有著舉足輕重的作用。1 一般狀態(tài)觀察正常大鼠精神狀態(tài)良好，能正常覓食、飲水，體質(zhì)量穩(wěn)定，被毛光澤，行為活躍。而免疫后的大鼠精神萎靡、倦怠，進(jìn)食減少，體質(zhì)量減輕，毛發(fā)失去光澤，活躍度降低。因此，在進(jìn)行藥物治療后，可以通過(guò)對(duì)大鼠狀態(tài)的觀察，對(duì)藥物的作用效果進(jìn)行初步判斷。 2 關(guān)節(jié)腫脹程度的評(píng)價(jià) 免疫后的大鼠因病情的不同變化，會(huì)出現(xiàn)足跖部的腫脹。根據(jù)有關(guān)關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究的文獻(xiàn)

9、報(bào)道3，多數(shù)采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)定或用游標(biāo)卡尺測(cè)量收稿日期：2012-01-11足跖部腫脹度作為評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)炎腫脹程度的依據(jù)。前作者簡(jiǎn)介：孫玉亮，碩士研究生。Tel:E-mail: sunyuliang2004者的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為5級(jí)評(píng)分法：0分，無(wú)關(guān)節(jié)炎；1分，個(gè)別足趾發(fā)紅、腫脹；2分，大部分足趾及足底腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)及以下腫脹；4分，腫脹累及踝關(guān)節(jié)以上且不能負(fù)重。后者用游標(biāo)卡尺測(cè)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物足跖部腫脹度，分別測(cè)量3次，取平均值。因此，可以通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)腫脹程度的評(píng)定，來(lái)判斷大鼠的預(yù)后狀況，進(jìn)而進(jìn)行藥效評(píng)定。 3 免疫學(xué)檢測(cè)隨機(jī)選取大鼠，ip給予10%水合氯醛（3 mL/kg

10、）麻醉，斷頸處死，迅速腹股溝動(dòng)脈取血，于3 000 r/min離心15 min后，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)抗體4。 3.1 自身抗體RA患者血清中可出現(xiàn)多種自身抗體。除傳統(tǒng)的類風(fēng)濕因子外，近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)了對(duì)RA診斷及研究均有意義的多種自身抗體5，包括抗核周因子、抗角蛋白抗體及抗RA33/36抗體等。對(duì)這些抗體的檢測(cè)可以更好地反映大鼠的預(yù)后情況及藥物的療效。3.1.1 類風(fēng)濕因子（RF） 1912年發(fā)現(xiàn)RA患者血清中含有RF，這對(duì)該病的診斷和發(fā)病機(jī)制的研究具有重要意義，但RF并不是一項(xiàng)足以令人滿意的診斷指標(biāo)，因?yàn)镽F在RA患者中的檢出率不高，特異性較低，在早期往往呈陰性，RF

11、陽(yáng)性也可見(jiàn)于慢性感染、其他結(jié)締組織疾病和正常的老年人。近年來(lái)隨著各種新的檢測(cè)方法相繼出現(xiàn)，檢出率不斷提高。RF可分為IgM、IgA、IgG及IgE 4種類型，其中IgM、IgA易于檢測(cè)，對(duì)RA診斷有較好的參考價(jià)值6。3.1.2 抗核周因子（APF） RA患者中APF陽(yáng)性率為48.6%86.0%，血清滴度亦遠(yuǎn)高于其他結(jié)締組織病。該抗體診斷RA的特異性為72.7%90%。文獻(xiàn)中該抗體陽(yáng)性率的差異可能與底物制作技術(shù)、保存條件及陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)定有關(guān)。APF的陽(yáng)性率可高于RF。大約l/3的RF陰性的RA患者可檢出APF。因此，APF測(cè)定在一定的程度上可彌補(bǔ)RF的不足。研究證明，APF可出現(xiàn)于RA的早期階段

12、，而HLA- DR4/DRI陽(yáng)性的RA患者有較高的APF陽(yáng)性率。 3.1.3 抗角蛋白抗體（AKA） 在RA患者中，AKA的陽(yáng)性率為60%73%。其特異性達(dá)87%95%7。AKA可見(jiàn)于早期RA患者，發(fā)病1年內(nèi)，38%的患者該抗體為陽(yáng)性。多數(shù)研究認(rèn)為，同時(shí)檢查AKA與APF可提高對(duì)RA的診斷水平。近幾年國(guó)內(nèi)已有不少單位開(kāi)展了這項(xiàng)工作。3.1.4 抗SA抗體 抗SA抗體陽(yáng)性率達(dá)68.4%8。SA抗體對(duì)RA診斷的特異性為78%97%。在發(fā)病1年內(nèi)的早期RA患者，抗SA抗體的陽(yáng)性率達(dá)29%。在血清RF陰性的RA患者中，抗SA抗體陽(yáng)性率為27%。3.1.5 抗型膠原抗體（anti collagen ty

13、pe ） 型膠原是關(guān)節(jié)軟骨的主要成分，63%的RA患者的天然型膠原抗體以IgG型抗體為主9。型膠原抗體對(duì)于RA的診斷特異性可達(dá)97%，且在早期類風(fēng)濕患者中的陽(yáng)性率高于晚期RA患者，而且有助于RA的早期診斷。3.2 急性時(shí)相反應(yīng)物指標(biāo)3.2.1 C-反應(yīng)蛋白 C-反應(yīng)蛋白是一種能很好反映RA病情的指標(biāo)。C-反應(yīng)蛋白與病情活動(dòng)指數(shù)、晨僵時(shí)間、握力、關(guān)節(jié)疼痛及腫脹指數(shù)、血沉和血紅蛋白水平密切相關(guān)。病情緩解時(shí)C-反應(yīng)蛋白下降、反之則上升。3.2.2 血沉 是一種操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好的急性時(shí)相反應(yīng)指標(biāo)。一般說(shuō)來(lái)，血沉與RA的活動(dòng)性有關(guān)。病情加重則血沉增快，而病情緩解時(shí)血沉可恢復(fù)至正常。應(yīng)當(dāng)指出，血沉只是反

14、映病情的指標(biāo)之一，并受到多種因素的影響。而且，約有5%的RA患者在病情活動(dòng)時(shí)血沉并不增快。因此，判斷RA活動(dòng)程度應(yīng)以臨床癥狀和體征為主，血沉及C-反應(yīng)蛋白等作為參考指標(biāo)10。 3.3 細(xì)胞免疫功能的檢測(cè)3.3.1 淋巴細(xì)胞亞群 近些年研究結(jié)果表明，RA除了體液免疫異常外，還有明顯的細(xì)胞免疫異常，細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)異常是本病的關(guān)鍵，也已成為RA發(fā)病機(jī)制研究的重點(diǎn)。CD3+即為總T淋巴細(xì)胞，可分為兩個(gè)主要亞群：CD4+和CD8+細(xì)胞。CD4+為輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（Th/Ti），具有輔助T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)細(xì)胞，B細(xì)胞生成抗體和巨噬細(xì)胞活化等功能，起輔助、誘導(dǎo)細(xì)胞及體液免疫的作用；CD8+為抑制/殺傷細(xì)胞（Ts

15、/CTL），具有抑制T細(xì)胞活化，抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，起抑制細(xì)胞及體液免疫的作用。RA患者與正常人比較，CD3+、CD4+無(wú)變化，而CD8+明顯減少，CD4+/CD8+值明顯升高。RA滑膜CD4+/CD8+值在一定程度上反映其疾病的病期、活動(dòng)性和嚴(yán)重性，對(duì)早期RA的診斷可能提供一定的幫助。3.3.2 白細(xì)胞介素 RA是免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病，因此多種細(xì)胞因子直接或間接介導(dǎo)炎癥和組織損傷。目前比較有診斷價(jià)值的細(xì)胞因子有白細(xì)胞介素1（IL-1）、白細(xì)胞介素2及其可溶性受體（IL-2、sIL-2R）、白細(xì)胞介素6（IL-6）和白細(xì)胞介素8（IL-8）等。IL-1主要由活化的單核巨噬細(xì)

16、胞產(chǎn)生，RA患者單核細(xì)胞分泌IL-1明顯增高，血中IL-1濃度升高，而且與RA活動(dòng)度（如貧血）相關(guān)。IL-1既是免疫調(diào)節(jié)因子，又是炎癥介質(zhì)，在RA發(fā)病過(guò)程中起重要作用。IL-2主要由成熟的T淋巴細(xì)胞（CD4細(xì)胞為主）產(chǎn)生，RA患者無(wú)論在血液還是在關(guān)節(jié)液中IL-2量均明顯減少，導(dǎo)致了免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，因此IL-2在RA致病過(guò)程的異常免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵性作用。sIL-2R是T淋巴細(xì)胞活化后，膜IL-2Ra鏈，即Tac抗原脫落所致。RA患者血清sIL-2R水平顯著高于對(duì)照組，且濃度變化與RF陽(yáng)性檢出率相平行，在RF陰、陽(yáng)性兩組中有顯著差異。在RA活動(dòng)期水平明顯高于非活動(dòng)期，提示RA患者有異常增多的激活

17、免疫細(xì)胞。另外血清sIL-2R水平還與RA患者的關(guān)節(jié)僵硬、腫痛等癥狀及血沉、C反應(yīng)蛋白等明顯相關(guān)，所以測(cè)定sIL-2R對(duì)于RA患者的早期診斷或鑒別診斷很有意義。IL-6是一種具有重要生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，它由多種淋巴及非淋巴類免疫細(xì)胞（T、B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等）產(chǎn)生，對(duì)機(jī)體多種組織及細(xì)胞均有不同程度的作用。RA患者血清中IL-6水平明顯高于正常人和骨性關(guān)節(jié)炎對(duì)照組，在活動(dòng)期RA患者的滑膜液內(nèi)也檢測(cè)到異常升高的IL-6。IL-6水平還與RA病變程度有關(guān)，病情好轉(zhuǎn)后，血清中增高的IL-6水平迅速下降，IL-6是RA病程進(jìn)展的一個(gè)重要病理因子。IL-8是多種細(xì)胞產(chǎn)生的具有趨化中性粒細(xì)胞

18、、T淋巴細(xì)胞、參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，RA患者血清IL-8水平明顯升高。有人在RA患者關(guān)節(jié)滑液中檢出高水平的IL-8，IL-8在IL-1存在條件下，可破壞軟骨酶。因此推測(cè)IL-8是致關(guān)節(jié)損傷的炎癥因子之一。3.3.3 腫瘤壞死因子（TNF-） RA是活性T細(xì)胞浸潤(rùn)引起滑膜血管增殖及血管翳形成，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞。TNF-是一種促炎性細(xì)胞因子，在免疫反應(yīng)、炎癥和對(duì)損傷的反應(yīng)中起重要作用，主要影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，并與其他細(xì)胞因子一起形成復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)。在RA炎癥局部細(xì)胞因子相互作用網(wǎng)絡(luò)中，TNF起著很關(guān)鍵的作用11。在RA患者體內(nèi)中，TNF-主要由外周血單核細(xì)胞和關(guān)節(jié)滑膜的巨噬細(xì)胞分

19、泌，其他類型的細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等在一定條件下也具有產(chǎn)生和釋放TNF-的能力。關(guān)節(jié)病變組織中檢測(cè)的多是TNF-，在RA患者的血清、關(guān)節(jié)滑膜和關(guān)節(jié)液中，TNF-均有很高的表達(dá)。在疾病活動(dòng)期或進(jìn)展期，TNF呈高水平分泌，導(dǎo)致一系列臨床癥狀及局部關(guān)節(jié)組織的破壞，慢性期TNF水平相對(duì)較低且穩(wěn)定，其濃度的高低與RA患者的嚴(yán)重程度一致12。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，中和TNF-能降低關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度13。RA患者治療后，血清TNF-水平隨同期關(guān)節(jié)炎活動(dòng)指數(shù)的改善而顯著下降，提示RA療效可表現(xiàn)在細(xì)胞因子水平的下降。因此TNF-水平檢測(cè)可作為判斷RA臨床疾病活動(dòng)指標(biāo)之一。4 病理學(xué)檢測(cè)大鼠斷頸處死，剪

20、取踝關(guān)節(jié)，厚度小于0.5 cm，面積小于15 cm×15 cm，標(biāo)記近端、遠(yuǎn)端；迅速置于10%甲醛固定脫鈣液中，脫鈣時(shí)間以23 d為標(biāo)準(zhǔn)至針刺組織無(wú)抵抗時(shí)為止。脫鈣時(shí)禁蓋瓶蓋，以使脫鈣時(shí)產(chǎn)生的氣泡逸出。脫鈣處理后進(jìn)行石蠟包埋、切片，最后用蘇木精和伊紅染色，鏡下觀察14。正常大鼠的組織切片，可見(jiàn)清晰的關(guān)節(jié)腔，滑膜由13層滑膜細(xì)胞組成并有序排列?；そM織中無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)纖維組織增生，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，骨纖維整齊排列。而在免疫的大鼠中可見(jiàn)滑膜組織中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)腔中可見(jiàn)炎癥細(xì)胞。同時(shí)見(jiàn)到滑膜增生，排列疏散、紊亂，滑膜下纖維素增生，膠原纖維沉著，并可見(jiàn)到滑膜脂肪墊水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等

21、現(xiàn)象。比較不同治療階段大鼠的病理切片變化，可以清晰地看到藥物的作用效果。 5 影像學(xué)檢測(cè)隨機(jī)選取大鼠，ip給予10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，并將其仰位固定于X射線操作臺(tái)上，進(jìn)行足部及踝關(guān)節(jié)處的X光片照射。觀察和比較大鼠足部及踝關(guān)節(jié)處的組織形態(tài)的改變。正常大鼠踝關(guān)節(jié)X片顯示，大鼠軟組織無(wú)腫脹，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整，骨質(zhì)無(wú)破壞，足趾小關(guān)節(jié)間隙清 7 胡朝英, 錢(qián) 柳, 張冬青. 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎免疫學(xué)研究進(jìn)展 J. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2011, 31(7): 楚15。而免疫后的大鼠，可見(jiàn)骨關(guān)節(jié)邊緣模糊，表面軟骨破壞，骨質(zhì)侵蝕。同時(shí)新生骨增生明顯，并在趾節(jié)間、腕骨等部位出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)僵硬。因此

22、，X線對(duì)于療效的檢測(cè)也是一個(gè)不錯(cuò)的方法。 6 結(jié)語(yǔ)總之，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測(cè)工具的不斷研制和發(fā)明，越來(lái)越多的針對(duì)RA檢測(cè)方法將被發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也將越來(lái)越可信。這對(duì)于更快研制出新的、療效好的藥物有著重大意義。參考文獻(xiàn)1 胡長(zhǎng)玲, 林 兵, 鄭承劍, 等. 抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的天然藥物及其作用機(jī)制研究進(jìn)展 J. 中草藥, 2011, 42(7): 1435-1440.2 李霞蘭, 王少軍, 楊艷平, 等. 中西醫(yī)結(jié)合治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎臨床研究概況 J. 中草藥, 2007, 38(6): 附2-附4.3 白洪宇. 大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑴c評(píng)價(jià)D. 哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 200

23、9.4 柴鐵玲. 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型在中醫(yī)藥研究中的進(jìn)展及思考 J. 環(huán)球中醫(yī)藥, 2011, 4(3): 215-217. 5 由艷秋. 各種檢驗(yàn)指標(biāo)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷中的應(yīng)用 J. 黑龍江醫(yī)學(xué), 2011, 35(8): 566-569.6 趙文秀，李 妍. 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的免疫學(xué)診斷研究進(jìn)展 J. 解放軍醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào), 1999, 27(2): 152-154.1035-1040.8 白洲霞. 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)的分析探討J. 甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 21(3): 50-52.9 府偉靈. 臨床檢驗(yàn)學(xué)實(shí)用技術(shù)與新進(jìn)展 M. 人民軍醫(yī)出版社, 2005.10 韓 冰, 張家穎, 武廣恒, 等. 大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型制備及血沉和組織學(xué)檢測(cè) J. 吉林醫(yī)學(xué), 2009, 30(7): 587-588.11 Rangnat