2019年細菌檢驗的質(zhì)量保證

1、臨床細菌檢驗的質(zhì)量保證臨床細菌學(xué)檢驗在檢驗醫(yī)學(xué)中具有特殊的位置， 主要表現(xiàn)在它的高風險性 （如腦脊液培養(yǎng)結(jié)果正確與否直接關(guān)系到患者的生死） 、高干擾性（如標本采 集、運送等過程中的諸多因素都會干擾檢出率和正確率） 、高技術(shù)性和高嚴謹 性（準確表達、報告和解釋結(jié)果直接影響治療的成?。?。因此，細菌培養(yǎng)和藥 敏試驗等屬于高度復(fù)雜的試驗范疇。由于致病菌的多樣性和變異性， 臨床細菌學(xué)始終是一門知識更新和發(fā)展較 快的學(xué)科。 為此，從事臨床細菌檢驗的醫(yī)師和技師必須具有較好的業(yè)務(wù)素質(zhì)和 敬業(yè)精神，要勤于學(xué)習和探索，要有嚴謹求實的作風和對新事物的敏感性，這 是高質(zhì)量完成細菌檢驗任務(wù)的首要條件。細菌檢驗的質(zhì)量保

2、證是一個連續(xù)的質(zhì)量管理系統(tǒng)，包括從患者準備，申請 單書寫，標本采集、標識、保存、運送、處理和檢驗，結(jié)果分析和報告，直至 醫(yī)師的理解和應(yīng)用（診治） 。為了對這一過程的質(zhì)量進行管理，本規(guī)范從檢驗 前、檢驗中和檢驗后三個方面提出相關(guān)要求。一、 檢驗前的質(zhì)量管理（一）檢驗項目的申請細菌檢驗項目的申請要有針對性和合理性。 臨床醫(yī)師應(yīng)在熟悉人體各部位 正常菌群以及常見致病菌的基礎(chǔ)上，結(jié)合感染患者的癥狀、體征，科學(xué)地提出 檢驗申請。對于有感染跡象者（ WBC 增高，中性粒細胞升高， CRP>20mg/L 等），應(yīng)盡快申請做細菌培養(yǎng)與藥敏試驗，并力爭在使用抗菌藥物之前送檢標 本，以便及時獲得致病菌的有關(guān)

3、資料和藥敏結(jié)果，正確選用抗菌藥。對于低臨 床價值的細菌標本，如口腔和腸內(nèi)容物、直腸周圍膿腫、褥瘡、多毛的膿腫、 惡露、嘔吐物、 Foley 導(dǎo)管尖等，由于易受正常菌群的污染，細菌培養(yǎng)價值較 低，一般不做細菌培養(yǎng)；必須申請細菌培養(yǎng)時，其結(jié)果應(yīng)結(jié)合臨床分析。由于 細菌檢驗的特殊性， 細菌檢驗申請單必須提供臨床信息， 特別應(yīng)說明患者是否 使用過抗菌藥以及使用過何種抗菌藥， 以便于實驗室有的放矢地抵消抗菌藥的 作用，提高細菌培養(yǎng)陽性率。（二）檢驗標本的采集、保存、運送和驗收1 患者的準備 主要包括兩個方面： 一是做好采集部位的清潔和消毒工 作，防止正常菌群的污染；二是耐心細致地交待患者，使其主動配合以

4、便 采集到有價值的標本。2 標本采集 標本正確采集十分重要，其目的是千方百計捕捉病原菌并 保持其活性，以提高檢出率， 同時又要盡可能避免非病原菌的污染和干擾。 為此， 要根據(jù)各種感染性疾病和目標病原菌的不同特點， 正確合理地確定 采樣部位、時機和次數(shù)。要選用恰當?shù)牟蓸悠鞑膰栏癜匆?guī)范操作。一般來 講，采樣量多一些有利于病原菌的檢出，但應(yīng)以不影響患者健康和便于操 作為前提，因此采樣量要恰當。3標本保存與送檢 盛標本的容器應(yīng)無菌、 不漏和便于密封。 要根據(jù)目標病原菌的特點決定是否使用保菌液、運送液或增菌液，以及選擇何種保菌 液、運送液或增菌液。標本采集后應(yīng)盡可能立即送檢。如不能及時送檢， 要根據(jù)目標

5、病原菌的特點確定保存條件 （如溫度等），在規(guī)定的時間內(nèi)送到 實驗室。4驗收和登記 標本的驗收和登記要有專人負責。驗收的內(nèi)容主要包括： 采樣時間與送檢時間（的間距）以及送檢條件是否符合保存致病菌活力的 要求；盛標本容器是否有溢漏和污染；申請單是否填寫完整；標本標識是 否與申請單一致和唯一等。對不合格的標本要拒收，并向送檢醫(yī)護人員說 明拒收原因，告知正確送檢的要求，囑其重新采集和送檢標本。以上各項均與細菌檢驗的質(zhì)量密切相關(guān)，檢驗科（細菌室）應(yīng)與臨床科 室通過共同研討，認真制定有關(guān)的要求和標準操作程序，并嚴格執(zhí)行。檢驗中質(zhì)量管理（一）致病菌分離鑒定1. 標本（細菌）的接種、分離和鑒定根據(jù)標本和檢驗?zāi)?/p>

6、的的不同接種不同 的培養(yǎng)基。對陽性培養(yǎng)要分離純化，然后進行分群和種屬鑒定。整個操作 過程要按標準操作程序（SOP）進行，不得隨意更改操作程序，對于疑難菌 株，要查閱文獻、組織會診，不能草率作出結(jié)論。2. 檢驗過程的記錄和結(jié)果報告 檢驗過程中所見現(xiàn)象和發(fā)現(xiàn)的問題，均應(yīng)如 實地記錄，以便于分析實驗結(jié)果，作出正確結(jié)論和發(fā)出可信的報告，亦可 作為今后總結(jié)和改進工作的依據(jù)。所發(fā)報告內(nèi)容要登記，以便查詢；如原（初步）報告有誤或不完善，應(yīng)發(fā)糾正報告。（二）藥敏試驗質(zhì)控藥敏試驗應(yīng)嚴格按NCCLS規(guī)定的培養(yǎng)基、操作方法、藥敏紙片和判定標 準進行。為了監(jiān)控試驗過程的質(zhì)量，必須做好藥敏質(zhì)控。1常用的藥敏質(zhì)控標準菌株

7、NCCLS從美國菌種收集中心（ATCC）選擇推薦了一些菌株作為質(zhì)控標準 株（見表1）。表1常用藥敏質(zhì)控標準株標準菌株名稱ATCC編號用途大腸埃希菌25922用于常規(guī)紙片法藥敏質(zhì)金黃色葡萄球菌25923控銅綠假單胞菌27853大腸埃布困35218產(chǎn)B 內(nèi)酰胺酶，用于含肺炎克雷伯困700603B 內(nèi)酰胺酶抑制物的 復(fù)方制劑的質(zhì)控和ESBLs的檢測質(zhì)控流感嗜血桿菌49247、 49766和 10211用于嗜血桿菌的藥敏質(zhì) 控淋病奈瑟菌49226用于淋病奈瑟菌的藥敏 質(zhì)控糞腸球菌29212 和 33186用于磺胺類和TMP的藥敏質(zhì)控金黃色葡萄球菌29213用于MIC測定的質(zhì)控以替換25923肺炎鏈球菌

8、49619用于肺炎鏈球菌的藥敏質(zhì)控幽門螺桿菌43504用于HP的MIC質(zhì)控脆弱擬桿菌 多形擬桿菌 產(chǎn)氣夾膜梭困 遲緩真桿菌25285297411312443055用于厭氧菌的藥敏質(zhì)控2質(zhì)控株的保存 盡管質(zhì)控標準株比其他一些菌株藥敏結(jié)果是相對穩(wěn) 定的，但反復(fù)多次的傳代不可避免地會造成菌株的變異。為防止變異，必須將 標準株凍干保存。每月從凍干株中復(fù)蘇 1次，種入大豆酪蛋白消化肉湯中（厭 氧菌可用GAM肉湯等）作為工作株。工作株可存于 48C，并于每周轉(zhuǎn)種1 次。通常工作株轉(zhuǎn)種45次后即須棄去。在質(zhì)控中，如發(fā)現(xiàn)工作株結(jié)果有疑問， 應(yīng)予以更換。反復(fù)傳代亦易使其敏感性變異，特別是銅綠假單胞菌（ATCC2

9、7853），將會丟失對脲基青霉素的敏感性。如無凍干條件時，可于肉湯中加入 15%的甘油和脫纖維羊（或兔）血，或使用含 50%小牛血清的肉湯，然后接種 標準株，存于-20C以下環(huán)境中，亦可防止變異。3藥敏質(zhì)控方法質(zhì)控株應(yīng)每天隨臨床分離株一道進行藥敏試驗質(zhì)控株的藥敏結(jié)果如果在質(zhì)控允許范圍內(nèi)（參見最新NCCLS文件），說明實驗條件 符合要求，結(jié)果可信；若藥敏結(jié)果在質(zhì)控允許范圍外，則實驗中可能存在差錯。 由于質(zhì)控允許范圍的最大值與最小值是質(zhì)控株在標準條件下多次重復(fù)實驗的 95%可信限，故20次連續(xù)質(zhì)控結(jié)果中僅允許1次落在范圍外，但不能偏離質(zhì) 控允許范圍中間值（最大值+最小值）/24個標準差。由于允許范

10、圍恰好包括 4個標準差，故落在允許范圍外的抑菌圈直徑一定要在離中間值一個允許范圍 （中間值土 1個允許范圍）之內(nèi)。此外，20次或更多次藥敏結(jié)果的平均值應(yīng)接 近中間值。如果20次連續(xù)質(zhì)控結(jié)果中連續(xù)2次或不連續(xù)3次以上的結(jié)果超出 了允許范圍，則提示實驗過程中存在問題，必須查找原因加以解決。常規(guī)的藥敏質(zhì)控可按下法進行：連續(xù)測定某藥對質(zhì)控株的藥敏結(jié)果，每天 一次，共測30天，取得30個值。如果僅有三個以下的值超出允許范圍，則結(jié)果基本可信，可改每天質(zhì)控 一次為每周一次。此后，若某周出現(xiàn)一次質(zhì)控值超出允許范圍，則須連續(xù)質(zhì)控 五天，每天一次：若五次結(jié)果皆在允許范圍以內(nèi)，則繼續(xù)每周一次的質(zhì)控； 五次結(jié)果只要有

11、一次失控，則改每周一次質(zhì)控為每天一次，直至完成30天, 其間失控次數(shù)若在三次以內(nèi)，則再改為每周一次。如果有四個以上的值超過允許范圍，則繼續(xù)做每天一次的質(zhì)控。每當改變試劑、藥敏紙片和培養(yǎng)基等時，均要重新進行連續(xù)30天的質(zhì)控。每次失控均要查找原因，糾正后才能發(fā)出報告。（三）培養(yǎng)基、試劑和染色的質(zhì)控1培養(yǎng)基的質(zhì)控 培養(yǎng)基無論是自制的還是商業(yè)購買的，都應(yīng)注明生產(chǎn)日 期和效期。培養(yǎng)基的質(zhì)控主要包括以下四個方面：無菌試驗，每批培養(yǎng)基在高壓或過濾除菌后均要抽取樣本進行培養(yǎng)，以證實無菌生長。支持生長試驗 以適宜的菌株接種，經(jīng)培養(yǎng)應(yīng)生長良好。選擇和抑制生長試驗，對選 擇性培養(yǎng)基應(yīng)至少分別選1株可生長、1株被抑制

12、菌進行接種培養(yǎng)，可生長菌 應(yīng)生長良好，被抑制菌應(yīng)不能生長。 生化反應(yīng)培養(yǎng)基至少應(yīng)分別選陽性和 陰性反應(yīng)菌株各1株，以證實應(yīng)有的生化反應(yīng)。常用的質(zhì)控菌見表 2,請正確 選用。2生化反應(yīng)試紙和試劑的質(zhì)控試紙和試劑無論是外購的還是自制的，在使用時一定要注明開啟時間和失效期。測定代謝產(chǎn)物的試紙或試劑，要用已知 陽性和陰性的菌株進行測試，并作好測試記錄。測定代謝產(chǎn)物的試劑，要防止 細菌的污染。觸酶、氧化酶、凝固酶試劑在開瓶時以及使用中，每天至少要分 別用一陽性和陰性菌測試1次。桿菌肽、Optochin、ONPG、XV紙片（條）在開瓶時以及使用中，每周至 少要分別用一陽性和陰性菌測試1次（XV紙片僅做陽性

13、菌）。用于分枝桿菌鑒 定的試劑在開瓶或配制時，以及每次使用時，均要做陽性菌對照（鐵的攝取試 驗還要做陰性對照）。抗血清在開瓶時和使用中每月需分別用陽性反應(yīng)和陰性反應(yīng)菌做1次測試?？乖瓩z測試劑和DNA探針在每次操作時，均要設(shè)陰、陽性對照。其他試劑和紙片僅在開瓶或配制時， 做1次陰、陽性反應(yīng)測試即可。各種 常用試紙和試劑的質(zhì)控菌和預(yù)期結(jié)果見表 3。表2 常用的質(zhì)控菌菌株名NCTC編號ATCC編號醋酸鈣不動桿菌784415308嗜水氣單胞菌78109071產(chǎn)氣腸桿菌1000613048陰溝腸桿菌1000513047糞腸球菌8213大腸埃布困900111775流感嗜血桿菌10211幽門螺桿菌33290

14、肺炎克雷伯困41815380普通變形桿菌417513315雷極普羅威登斯菌7475粘質(zhì)沙雷菌11935遲緩愛德華菌11934鼠傷寒沙門菌7413311宋內(nèi)志賀困9290金黃色葡萄球菌853212600表皮葡萄球困12228銅綠假單胞菌72447700無乳鏈球菌818113813肺炎鏈球菌746510015副溶血弧菌1090317802表3 試紙片（條）和試劑的質(zhì)控試紙片、紙條或 試劑質(zhì)控菌預(yù)期反應(yīng)結(jié)果說明桿菌肽化膿鏈球菌敏感：24h內(nèi)紙片任何抑菌區(qū)都認為是（A群）周圍有生長抑制區(qū)有效的，僅作為A鏈域的一個推定試驗糞腸球菌耐藥：24 h內(nèi)周圍 無生長抑制區(qū)域觸酶金黃色葡萄球陽性：立即產(chǎn)生氣使用3

15、%出02，其活性菌、鏈球菌屬泡通過加幾滴H2O2到有陰性：無氣泡血的試管中來檢測凝集試驗含抗原的陽性質(zhì)控菌陽性（膠乳）不含抗原的陰性質(zhì)控菌陰性細菌抗原檢測抗原提取液陽性血漿凝固酶金黃色葡萄球菌陽性：在4 h內(nèi)有 任何程度凝集表皮葡萄球菌陰性：無凝集或絲狀物生長因子流感嗜血桿菌24 h內(nèi)在XV因子接種到浸液或M-H平X、V 和 XV周圍生長；24 h內(nèi)皿，置X與V因子紙在X和V之間生長片相隔1cm,離XV因 子紙片至少6cm遠處， 空氣或CO2中孵育吲哚大腸埃布困、產(chǎn)培養(yǎng)24 h后，陽性：Kovacs 試劑和 Ehrlich氣腸桿菌界面為紅環(huán)；陰性：試劑產(chǎn)生同樣顏色，取界面為黃環(huán)其中一種即可甲基

16、紅大腸埃布困培養(yǎng)48h后，加甲 基紅立即紅色為陽常與V-P結(jié)果相反產(chǎn)氣桿菌性陰性：無顏色改變B -半乳糖甘酶大腸埃布困陽性：24 h內(nèi)黃色(ONPG)普通變形桿菌陰性：無顏色改變奧普托辛肺炎鏈球菌24 h內(nèi)敏感，有生敏感：6mm紙片，14(Optochin )長抑制區(qū)域mm區(qū)帶；10 mm紙 片，16 mm區(qū)帶草綠色鏈球菌耐藥：無生長抑制中敏：6mm紙片，7（a -溶血鏈球區(qū)10 mm區(qū)帶；10 mm紙菌）片，1115 mm區(qū)帶如果中敏，做膽汁溶菌試驗氧化酶銅綠假單胞菌1020 s內(nèi)陽性：紫色到黑色大腸埃布困陰性: 不顯色1020 s內(nèi)氧化酶紙片或紙銅綠假單胞菌陽性:30 s內(nèi)紫色氧化酶試劑在

17、10 s內(nèi)條大腸埃布困陰性:無顏色變化讀結(jié)果，或加到菌落上30 s內(nèi)觀察結(jié)果吡嗪酰胺酶（耶小腸結(jié)腸炎耶爾陽性:15 min內(nèi)紅于2530C下斜面培爾森菌屬瓊脂）森菌（非致病菌）棕色養(yǎng)48h，加新鮮的小腸結(jié)腸炎耶爾陰性:不出現(xiàn)紅棕10g/L硫酸亞鐵銨鹽于森菌（致病菌）色斜面上，非致病菌含有 吡嗪酰胺酶能轉(zhuǎn)化吡 嗪酰胺為吡嗪酸，在二 價鐵鹽存在的條件下， 后者呈棕色V-P試驗產(chǎn)氣腸桿菌培養(yǎng)48h后加試400 g/L KOH （水溶劑，若5 min內(nèi)出液）;50 g/L a -萘酚（無現(xiàn)紅色為陽性（加水乙醇溶液）O-Meara試劑則于O-Meara為含 400 g/L大腸埃布困4 h后觀察結(jié)果 陰性

18、：無顏色變化 或僅為銅色KOH的肌酸溶液3 染色的質(zhì)控 常用染色的質(zhì)控要求見表4,質(zhì)控結(jié)果應(yīng)作好記錄。（四）儀器設(shè)備質(zhì)量監(jiān)測實驗室內(nèi)的各種儀器設(shè)備的運行情況， 應(yīng)每天進行監(jiān)測，每一儀器均要有 專人維護保養(yǎng)，儀器上要貼有運行記錄卡，每天由維護保養(yǎng)人記錄溫度等指標 的變化情況。一旦發(fā)現(xiàn)問題，立即進行維修。（五）積極參加室間質(zhì)評要按規(guī)定參加細菌學(xué)的室間質(zhì)評， 對實驗室質(zhì)控水平進行全面評估，不斷 提高檢測水平。表4染色液的質(zhì)控染色質(zhì)控頻率生物或其他物 質(zhì)預(yù)期結(jié)果陽性 陰性鞭毛染色X開啟新瓶時和銅綠假單胞單或兩極鞭毛使用中每天一困、糞產(chǎn)堿桿周毛次菌革蘭染色XX開啟新瓶時和金黃色葡萄球陽性：紫紅到使用中每周一困、大腸埃布藍色的球菌次菌陰性：粉紅色到紅色桿菌Kinyoun 抗酸染色X開啟新瓶時和 使用中每周一戈登分枝桿菌以藍色為本底 的短、長和成次團的粉紅色桿菌芽胞染色X開啟新瓶時和芽胞桿菌屬任菌體中含有不使用中每天一一種腫脹的卵圓形次芽胞，芽胞可 被單染（顏色 依所用染料而 定），而桿菌可染成對比色Ziehl-Ne