2019年蛋白純化protocol

1、常見的實驗注意事項貴重的親和層析樹脂經(jīng)常發(fā)生結塊該怎么辦？ 可用 0.1 N NaOH / 0.1% SDS 洗 結塊Ni-chelating錯用DTT后發(fā)生黑色沉淀該怎么辦？盡快用0.1 N HCI沖洗Nan drop:帳號李大偉老師(li d w)密碼：62732710自己的超聲波：用大10頭，功率600W；用小3頭，功率不大于200W如果 pcr 不成功 , 可能是 pfu 出了問題， 也許是 pfu 沒有活力 (太多，太少 或者 buffer 不對)做酶切回收的質(zhì)粒一定要用 kit 提 質(zhì)粒連不上可能是膠回收問題，最好加異丙醇，終濃度可達50做SDS-PAG的30%丙烯酰胺一定要過濾

2、蛋白質(zhì)離心濃縮一定要用水平轉(zhuǎn)子 蛋白質(zhì)純化一定用 milli Q 的水，最好每步都加 1mM DTT 所有的FPLC柱子和填料一定要用20聽醇保存mono Q結合蛋白質(zhì)洗脫不下來，可能都被mono Q吸附上雜質(zhì)或長菌，可能 是柱子上濾膜出了問題Mono Q洗柱子的方法：（實在不行重新灌柱）isopropanol 10 vol ; 1MNaCl10 vol ； 0.5M HCl, 飽和 EDTA, 0.5% triton, 一些 CTAB,10 vol ； 1M NaCl10 vol ； 0.0 M NaCl 10 vol每周都要洗一次Superpose 6 洗柱子的方法 : （實在不行重新灌柱

3、 ） isopropanol 10 vol ； 1MNaCl 10 vol； 0.5M HCl, 飽和 EDTA, 0.5% triton, 一些 CTAB,10 vol ； 1M NaCl 10 vol ； 0.0 M NaCl 10 volpH 8 調(diào)到 用 1M 溶液調(diào) pH 值 pH6.01:4, 一般是 1:10pet 15b 加上 Met MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM 共 21 個氨基酸 pet 32b 除去 trx MHHHHHHSSGLGGENL YFQGS 共 21 個氨基酸300ml 10N NaOH 非精制胰蛋白胨 /L370ml 10N NaOH 精制胰蛋

4、白胨Trx: 14.6kDa pI 5.9Tev ： pI 8.5可溶于堿的污染物0.1 mol/L NaOH 洗滌Milli-Q 純化的蒸餾水洗滌 結合緩沖液洗滌可以除去諸如脂類、蛋白質(zhì)和核酸這類的污染物。對于疏水性污染物乙醇溶液（如70%的乙醇）或非離子型的去污劑洗滌可以除去脂類和其他的疏水性物質(zhì)。金屬污染物EDTA飽和的10 mmol/L HCI （即pH=2 ）處理柱子沉淀物雜質(zhì)去污劑、尿素和鹽酸胍，可將柱子在6 moI/L的尿素中平衡和溫育，然后用去離子水和緩沖液洗滌Centrifuge samples to avoid the risk of non-specific bindin

5、g of the target molecule to afilter. Samples such as serum can be filtered through glass wool to remove remaining lipids.Non-specific cause: proteins binding to medium and/or to the plastic tubes or the presenceof protein aggregates that co-precipitate with the immune complexIt is reported that CHAP

6、S stabilizes GR and preve nts non-specific adsorpti on of GRto tubes and mono-beads 6 and 7.載體：7.5 ulNEB buffer 2 1ulBSA 0.25ulT4 dna pol 0.25ul100mm dttp 0.5ul100mm Dtt 0.5 ul反應體系于22C 30min后，75C 20min將酶滅活。（另：一個文獻上沒有說明的優(yōu)點，NEB T4 DNA POL 在普通的限制性內(nèi)切酶Buffer中的T4處理，簡化了實活性為100%，也就是說，載體酶切后不用乙醇沉淀，就可以直接用于實驗室協(xié)

7、議前期工作1. 進查是否已經(jīng)有結構發(fā)表，特別注意unreleased 部分2. 進搜索目標基因，輸入基因名，找出對應的種屬把之下載，看看這個蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)，如是否有發(fā)表的結構、功能、是否有跨膜區(qū)、 所含的domain （可以進入InterPro、pfam和smart看看）、氨基酸序列、mRN威genomic DNA 序列等。3. 找出蛋白所對應的 mRNA序列如果基因是從別人獲得，直接向別人要mRNA序列或DNA序列如果基因是從庫中PCR 獲得，那么從 ncbi中輸入基因名，找出對應mRNA and Protei n(s)點(http:/ww

8、w. ncbi. nlm.n /e ntrez/query.fcgi?db=ge ne)的種屬。點擊進入，里面有很多文獻，介紹內(nèi)容比較全面，找出 擊找出 mRNA序列或genomic DNA序列結構預測1 cn. 中找出 Proteomics and seque nee an alysis tools 下的 Secondary里面的內(nèi)容很全， 有計算 Compute pI/Mw計算等電點和分子量PeptideCutter預測蛋白酶可能的酶切位置Tertiary structure predictio n在我們關心的Secondary structure pre

9、dict ion下主要是 PSIpred最有名，也是最常用的當然還有 PredictProtein也偶爾用一下2. 另外一個預測的站點：http:/bioinf.cs.ucl.ac.uk/dompred/DomPredform.html這個站點可以預測蛋白質(zhì)的各個domain的可能位置，可以大概告訴我們在哪里把蛋白切掉比較合適，里面的結果也含有PSIpred的結果。i. 進查是否有發(fā)表的結構時，發(fā)現(xiàn)有很多沒有unreleased部分。這是否代表結構已經(jīng)解出，我要放棄這個蛋白 ？差不多可以這么說。不過還要看情況，如果別人解出的蛋白質(zhì)僅是部分序列，那如果做別的片段或者全長就

10、可以做。還是就是如果做復合物也還是可以做。2. 很多蛋白查出是做了某個 domain和DNA或肽段的復合物或者整個蛋白和別的蛋白某個domain的復合物，這種情況下還可以做這個蛋白的結構嗎?3. 有些蛋白在搜索結果是No exact matches found, so fuzzy search used，這是否代表沒有做出結構？差不多可以這么說。3. 尋找同源的結構：http:/www.ebi.ac.Uk/blast2/i ndex.html在 UniprotKnowledgebase 中選擇 Protein structure sequenee.再輸入序列即可運行.一般認為 最小的E（）大于

11、0.01（或同源性低于30%以上；有時e-20,有時也可以0.01）,就 認為沒有同源的結構被解岀.E（）越小，差異越小.設計引物我最常用的軟件的 generunner,下面是我按generunner的內(nèi)容來介紹如何設計引物1. 實驗室常用的載體：gstmt （載體模板是 pgex-4T-2, TEV，通過LIC方法連接，GST tag,氨芐抗性）32bmt （載體模板是 pet32b, TEV，通過LIC方法連接，His tag 和Trx tag,氨芐抗性） 32bsumomt （載體模板是 pet32b, TEV，通過LIC方法連接，sumo tag 和兩個 His tag, 氨芐抗性）2

12、.實驗室常用的菌種:克隆菌種：DH5 a表達菌種：BL21(DE3), Rosetta 2 (DE3), Rosetta gami B plys (DE3)更多的見另外一個表3.設計primer 一般是在上述的二級結構預測的基礎上進行的，有點常見的要求：a: 一般匹配的堿基18個左右，我主要是根據(jù)匹配堿基的溫度大于等于54度。溫度=A或T含量X 2 + G或C含量X 4b:把酶切位點加在匹配的堿基的5'端，注意不要錯位防止產(chǎn)生亂碼。c:如果不想通過 T載體連接，一般要求在酶切位點外加3- 4個保護堿基。d:要仔細查所設計的酶切位點，防止所表達的蛋白堿基也有設計的酶切位點 e:最好在設計

13、之后再仔細檢查所有的引物一遍。The protocol of express geneLIC Protocol1. 載體 （一定要用 kit 提質(zhì)粒 , 必須是從無甲基化菌種提的質(zhì)粒 , 無 dcm， dam 甲基化 ）用STU I單酶切（buffer M, takara）, PCR產(chǎn)物（PCR盡量少用Taq）分別用凝膠回收 （一定要回 收）后，載體（可以不用凝膠回收，直接乙醇沉淀即可）重溶 20-40ul, PCR 重溶 30-50ul.2. pfu 末端處理Fragment(PCR)7ulPfu( 一定是原液 2.6mg/ml)0.25dATP (10mM) takara0.5pfu Bu

14、ffer( x 10 無 Mgcl2)125mM Mgcl20.25H2O1Total10ul72 度反應 30minFragment(Vector)7ulPfu (一定是原液 2.6mg/ml )0.25uldTTP (10mM)0.5ulpfu Buffer( x 10 無 Mgcl2)125mM Mgcl20.25H2O 1Total10ul72 度反應 30min 72 度反應 30min3. 連接Fragment(PCR)10ulFragment( Vector)5ulT4 ligase0.5ulT4 ligase Buffer2ulH2O2.5ul不用調(diào) pH 直接連接有點， 不加

15、連接酶不行16度放置2-20小時，加入 感受態(tài)細胞 DH5alpha或top10,置于冰上30min, 42度熱激90s, 冰上放置 5min, 將菌液涂于相應抗性的 Amp 平板上。4. 把平板放置在 37度培養(yǎng)箱中 ,一般培養(yǎng) 12-20 小時.挑選克隆小 搖并進行驗證 .5. Transformed the right plasmid to expression cell (BL21(DE3), Rossetta(DE3), ER2566) and express the target.6. The express cell was added to LB buffer contain

16、the right resistance, and shake at 37 degree. When the OD600 reach at 0.6-0.8, add IPTG to the LB buffer makethe final concentration of IPTG is 0.1-1mM, and shake 3-5h at 37 degree or 25 degree overnight.7. Centrifuged the cell at 4000rpm 15 min, collect the precipitation.GST蛋白的純化方法所有的水必須是 Mill Q 的水

17、! 蛋白純化過程盡量減少泡 沫11/20-1/50 體積的緩沖液 (20mM Tris pH 7.3 and 500mM NaCl, 0.1-1mg/ml lysozyme , 1mM DTT 后加，0.1%-1% trit on X-100 (一般在最后用于長晶體的蛋白時不要) )攪起細胞 , 經(jīng)常要用研 磨器把大跎的菌體分散，一般加入 1mM PMSF, 4度放置 30分鐘， 再 4 度冰上超聲破碎細胞( 6min, 2 sec on, 4 sec off, 30%功率)。2. 4 度12000rpm離心1小時.如果蛋白是可溶的，收集上清。如 果不可溶，則收集沉淀，另外用別的方法處理包涵體

18、，有時要留 樣跑膠。3. 對上清合并，把 溶液調(diào)為Tris pH 7.3 ，可以上GST beads見后面 如何平衡的柱子 )4. 用恒流泵循環(huán)過 GST beads 3 次，每次流速約 2ml/min.5. 用 buffer(20mM Tris pH 7.3 and 500mM NaC，1mM DTT洗柱子 10個柱體積，把液體流盡。下面的方法選一個6a. 可用 1-2 柱體積的 buffer(20mM Tris pH 7.3and 150mM NaC，l這時pH值或鹽濃度可以改變，1mM DTT)再加1/100體積的TEV 蛋白酶 4度過夜切。第二天收集液體。柱子可以用 (0.1 M so

19、dium acetate + 0.5 M NaCl, pH 4.5) 的溶液洗，或下面的溶液洗。如果是第一次做，最好先保存，等 SDS-PAG結果出來后再說。6b.用含lOmMGSH還原型的谷胱甘肽)的buffer(20mM Tris , 150mMNaCI, 1mM DTT這時一定要調(diào)pH值，保證pH值要對，因為谷胱 甘肽很酸 ) 。如果保存的話 , 要加甘油至最終 10-15%的甘油并保存 在 -86 度。最后GST beads保存20%乙醇中，在4度的冰箱中保存。GST beads 的再生方法：washi ng the gel with 2-3 bed volumes of aItern

20、ating high pH (0.1 M Tris-HCI + 0.5 M NaCI, pH 8.5) and low pH (0.1 Msodium acetate + 0.5 MNaCl, pH 4.5) buffers. This cycle should be repeated 3 timesGST beads 的平衡方法：equilibration with 3-5 bed volumes of緩沖液(20mM Tris pH 7.3 and 500mM NaCl,1mM DTT)His 蛋白的純化方法所有的水必須是 Mill Q 的水! 蛋白純化過程盡量減少泡 沫11/20-1/5

21、0 體積的緩沖液 （20mM Tris pH 8.0 and 500mM NaCl,0.1-1mg/ml lysozyme, 5-20mM 咪唑，0.1%-1%triton X-100 （ 般在最后用于長晶體的蛋白時不要） ）攪起細胞 , 經(jīng)常要用研磨器 把大跎的菌體分散，一般加入 1mM PMSF, 4度放置 30分鐘，再 4 度冰上超聲破碎細胞（ 6min, 2 sec on, 4 sec off, 30% 功率）。2. 4 度12000rpm離心1小時.如果蛋白是可溶的，收集上清。如 果不可溶，則收集沉淀，另外用別的方法處理包涵體。3. 對上清合并，一般情況下不用調(diào) 溶液的 pH 值，可

22、以上已經(jīng)平衡好 的 His beads（ 見后面的平衡方法 ）4. 用恒流泵循環(huán)過 His beads 3 次，流速約 2 ml/min.5. 用 buffer（20mM Tris pH 8.0 and 500mM NaC, 20mM咪唑）洗柱 子 10 個柱體積，把液體流盡。這一步驟從實驗的結果來看還是要 的.6. 用 buffer（20mM Tris pH 8.0 and 500mM NaC，60mM咪唑這個濃 度可以改 ） 洗柱子 10 個柱體積，把液體流盡。有時這個步驟會洗 下目標蛋白。7. 用buffer（20mM Tris pH 8.0 ,（這時pH可以根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點改 變）,

23、150mM NaCl，250mM- 500m M咪唑）或者用不含咪唑的、低pH如 4的溶液或者EGTA或EDTA洗脫 洗脫柱子1-2個柱體積，收集保存。8. 最好通過濃縮的辦法把上述收集液體中的咪唑去掉 . 如果保存的 話 , 要加甘油至最終 10-15%的甘油并保存在 -86 度.最后 His beads 保存 20乙醇中，在 4 度的冰箱中保存。His beads 的再生方法： washing the gel with 2-3 bed volumes of50mM EDT溶液至beads完全變?yōu)榘咨?，接著?-3 bed volumes of 水洗，再加 2-3 bed volumes o

24、f 50mM NiCl2 溶液 beads 完全變?yōu)樘mHis beads 的平衡方法 ： equilibration with 3-5 bed volumes of 緩沖液 (20mM Tris pH 8.0 and 500mM NaCl,1mM DTT)破細胞溶液 : 20mM Tris pH 8, 0.5% triton, 10mM 咪唑 500mM NaCl, 沒有加 pmsf.用 60mm 咪唑,20mM Tris pH 8, 500mM NaCI 漂洗,最后用 20mM Tris pH 8, 250mM 咪唑,300mM NaCI洗脫；濃縮時一定加鹽所有的水必須是 MiII Q 的水

25、 !如果是TA克隆轉(zhuǎn)的T載體，平板不長菌，一般有幾種原因：1、感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率；2、操作的原因3、SOC培養(yǎng)基4、抗性是否正確你可以參考以上幾點找找原因。片段加A后需要進行純化，純化在與載體連接。4、取 10uI 連接產(chǎn)物（如果做電轉(zhuǎn)化，連接產(chǎn)物需要純化）加入至 100uI 化學轉(zhuǎn)化感受態(tài) 細胞（DH5a或JM109等感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化效率在 5X 106 cfu/ug pUC19 DNA 以上）中冰浴15 分鐘。5、42 度熱擊 70-90 秒（根據(jù)離心管厚薄調(diào)整時間）后，再在冰浴 15 分鐘。6、 加入890 ul SOC 培養(yǎng)基，37C振蕩（150rpm/min ） 培養(yǎng)1小時2、為什么

26、PCR 產(chǎn)物難以插入載體？A 確認PCR反應使用的Taq酶在PCR產(chǎn)物的3'端是否附加了“ A”。高保真Taq酶擴增 的PCR產(chǎn)物是平端，不能直接用于 TA克?。籔CR產(chǎn)物保存時間不要過長，長時間保存 的PCR產(chǎn)物會脫去末端的“ A”堿基。B、膠回收時 PCR 產(chǎn)物不要在紫外線下暴露時間太長。C、確認感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率，使用的感受態(tài)細胞 1ng pUC18 質(zhì)粒至少應得到 1000 個以 上的轉(zhuǎn)化子，如有問題，重新制備感受態(tài)細胞。D 確認抗生素使用是否正確， pBM-T載體為Amp抗性，工作濃度100ug/ml。E、最好使用新配制的平板培養(yǎng)基。F、 連接中使用了不恰當?shù)妮d體：插入片段

27、比例，對于極小的PCR產(chǎn)物進行克隆，很可能 因為 PCR 產(chǎn)物嚴重過量，導致無菌落或菌落極少存放：超級感受態(tài)細胞必須從干冰運送包裝箱取岀直接放入- 80°C冰箱的底部。一定不要用液氮來存感受態(tài)細胞。存放條件：超級感受態(tài)細胞對微小的溫度改變也極度敏感，因此必須存放 在-80°C冰箱的底部即使是將細胞從一個冰箱轉(zhuǎn)移到另一個冰箱也會導致轉(zhuǎn)化效率的損失。采用 BD Falcon 的 14ml 聚丙烯圓底試管：在轉(zhuǎn)化實驗中使用圓底 14-ml BD Falcon 聚丙烯試管 （貨號 #352059 ）也是關鍵之一。一般的試管容易被 b- 巰基乙醇降解。而極為重要的熱激步驟 的操作也是

28、根據(jù)這種型號的試管優(yōu)化的。分裝細胞： 分裝細胞時務必保持置于冰上 。將聚丙烯管放置在冰上等待細胞融化，分裝的細胞 裝入預冷的試管中。而且，每次轉(zhuǎn)化都用 100 ml 細胞也很重要，減少細胞體積必定減少轉(zhuǎn)化效率。使用 b- 巰基乙醇 (b-ME ): 已經(jīng)證明 b-ME 可以幫助提高轉(zhuǎn)化效率。 Stratagene 提供的 b-ME 已經(jīng) 過稀釋，可以直接使用。其它來源的b-ME 使用時請參考相關文獻。使用 NZY+ 肉湯： Stratagene 的超級、高級感受態(tài)細胞在熱激處理后用 NZY+ 培養(yǎng)基菌落生長最 好。用其它培養(yǎng)基替代往往會造成效率降低。I can't give a mec

29、hanism, but I can tell you that one major method of making high-efficiency competent cells-and one of which there many variants-uses DMSO and DTT to achieve maxiumum efficiency. A possible mechanism would be that _if_ there were any periplasmic DNases, which are likely to possess disulfide bonds, th

30、e DTT (or BME) will inactivate them. DTT facilitates the inactivation of extracellular RNases for this reason.Add 7 ul DTT solution/200 ul culture, swirl and leave on ice for 5 mins.1.42 M B -mercaptoethanolAdd 1.7 卩 l of B -mercaptoethanol provided with this kit or a fresh1:10 dilution (of a 14.2 M

31、 stock) of B-mercaptoethanol diluted indistilled water (dH20) to the 100(11 of compete nt cells, giv ing a finalconcentration of 25 mM.1. 細胞生長狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于4C的培養(yǎng)菌，最好從-70 C或-20 C甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入 對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制。DH5x菌株的OD600為0.5時，細胞密度在5X107個/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過 高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度：用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA應主要是超螺旋態(tài) DNA(cccDNA。轉(zhuǎn)化效 率與外源DNA勺濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當加入的外源DNA勺量過多或體積過大時, 轉(zhuǎn)化效率就會降低。 1ng 的 cccDNA 即可使 501 l 的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5%。3. 試劑的質(zhì)量：所用的試劑，如CaCI2等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水 配制 , 最好分裝保存于干燥的冷暗處。4. 防止雜菌和雜 DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管 , tip 頭