基于胸腺嘧啶汞離子胸腺嘧啶結(jié)構(gòu)和納米金放大傳感器檢測(cè)汞離子

1、基于胸腺嘧啶汞離子胸腺嘧啶結(jié)構(gòu)和納米金放大傳感器檢測(cè)汞離子    He that runs fastest gets the ring.                         作者：莫志宏 楊琳玲 楊小超 陳自鋒【摘要】  利用Hg2+與DNA中胸腺嘧啶(T)結(jié)合的高度

2、特異性和納米金在石英晶體微天平(QCM)上的信號(hào)放大作用，設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)便靈敏的Hg2+檢測(cè)方法。納米金采用檸檬酸鈉還原法制備，其表面用末端帶巰基的寡核苷酸探針進(jìn)行自組裝修飾，并用6巰基己1醇(MCH)部分取代表面探針，以減少雜交空間位阻。結(jié)果表明，寡核苷酸鏈長(zhǎng)為9bp、T個(gè)數(shù)為7的序列具有較高靈敏度；線性范圍為5.0100 nmol/L；檢出限為2.0 nmol/L；Ca2+、Mg2+等其它金屬離子無(wú)明顯干擾。用于環(huán)境水樣中Hg2+的測(cè)定, RSD<2.9%；加標(biāo)回收率為97.3%101.2%()。 You never know what you

3、can do till you.  【關(guān)鍵詞】  汞離子，寡核苷酸，納米金，石英晶體微天平  Abstract  A simple and sensitive method was developed for the detection of mercury ions with quartz crystal microbalance(QCM), based 

4、on the specific thymine(T)Hg2+T structure and gold nanoparticles. The gold nanoparticles were prepared by the citrate reduction method. In a selfassembled way, the particle surface

5、 was modified with the probe oligonucleotides which were partially replaced by 6Mercaptohexan1ol to reduce the steric hindrance of hybridization. The sensitivity was optimized by&#

6、160;the oligonucleotide with a strand length of 9bp and a T number of 7. The linear range was 5.0100 nmol/L with a detection limit of 2.0 nmol/L. And Ca2+, 

7、;Mg2+ and other metal ions had no significant interferences. This method was successfully applied for the detection of Hg2+in environmental water samples, with RSD less than&#

8、160;2.9% and recoveries of 97.3%101.2%.Nightingales will not sing in a cage.  Keywords  Mercury ion, oligonucleotide, gold nanoparticle, quartz crystal microbalance1  引 言Deeds are fruits; words are but leaves. 

9、     汞對(duì)人體健康危害嚴(yán)重1,2，是水環(huán)境監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)。環(huán)境水樣中Hg2+的測(cè)定主要采用等離子體原子發(fā)射光譜法和質(zhì)譜法2,3、熒光法4,5和電化學(xué)法6,7等。目前,這些方法或需要昂貴的儀器，不適合現(xiàn)場(chǎng)分析；或靈敏度和選擇性不能滿足環(huán)境監(jiān)測(cè)要求，需要進(jìn)行分離富集，操作繁瑣費(fèi)時(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，Hg2+能介導(dǎo)胸腺嘧啶(T)配對(duì)，形成穩(wěn)定的THg2+T特異性結(jié)構(gòu)8；并由此研究了具有良好選擇性的Hg2+檢測(cè)方法，包括熒光猝滅9、納米金凝聚比色1013等。但上述方法的靈敏度還有待進(jìn)一步提高。石英晶體微天平（QCM）是一種基于壓電效應(yīng)的高靈敏質(zhì)量傳感器（靈敏度可達(dá)n

10、g級(jí)），裝置簡(jiǎn)單，使用方便，已廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)傳感檢測(cè)14。文獻(xiàn)報(bào)道采用聚噻吩15和黑色素16修飾QCM金電極來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的檢測(cè)，靈敏度高，但特異性較差(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 )。本研究利用Hg2+與T結(jié)合的高度特異性和納米金在QCM上的信號(hào)放大作用，如圖1所示，設(shè)計(jì)出富含T的寡核苷酸序列A與B，分別修飾在QCM金電極和納米金表面；只有當(dāng)溶液中存在Hg2+時(shí)，A與B才能通過(guò)Hg2+的介導(dǎo)配對(duì)雜交；此時(shí)QCM電極表面質(zhì)量發(fā)生明顯變化，從而建立了靈敏、特異的檢測(cè)Hg2+的方法。Knowledge will not be aquired without pain and application

11、.  2 實(shí)驗(yàn)部分The peacock has fair feathers, but foul.  2.1 儀器與試劑      UV2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司)；TECRAI20型透射式電子顯微鏡(荷蘭Philips公司)；PSC2UD01壓電芯片與EXCE100壓電傳感實(shí)時(shí)分析儀(重慶大學(xué)微系統(tǒng)研究中心)；AA2610 型原子吸收分光光度計(jì)(北京華洋光學(xué)儀器開(kāi)發(fā)公司) 汞空心陰極燈(北京真空儀表廠) 。First try, and then

12、trust.      1.00 mmol/L Hg(NO3)2標(biāo)準(zhǔn)溶液；緩沖液為10 mmol/L NaH2PO4Na2HPO4+0.10 mol/L NaNO3（pH 7.4，記為PBN）；Piranha溶液：V（70% H2SO4）V（30% H2O2）=31；設(shè)計(jì)DNA序列（如圖3a所示，上海生物工程有限公司）；氯金酸和檸檬酸鈉（Amresco公司）；所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。2.2 納米金的制備  &

13、#160; 用檸檬酸鈉還原法1制備納米金（NG），將9.72×104 mol/L氯金酸水溶液加熱至沸騰，加入檸檬酸鈉，使其在反應(yīng)體系中的濃度為4.36×103 mol/L，恒溫加熱攪拌10 min，停止加熱繼續(xù)攪拌至室溫。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描所制備納米金的吸收光譜，最大吸收峰為517.5 nm；用掃描電鏡觀測(cè)納米金粒徑約為（10±1.8）nm，納米金粒子濃度為32 nmol/L。論文既是探討問(wèn)題進(jìn)行科學(xué)研究的一種手段，又是描述科研成果進(jìn)行學(xué)術(shù)交流的一種工具.  2.3 QCM金電極

14、表面的寡核苷酸修飾The sea refuses no river.      鍍金石英晶片在使用前用Piranha溶液清洗5 min，用N2吹干，加入1 mol/L巰基修飾的寡核苷酸A溶液在室溫下自組裝12 h，然后用PBN緩沖液清洗。為避免DNA在金電極上自組裝時(shí)出現(xiàn)相互纏繞或DNA磷酸骨架與金電極的非特異性吸附，采用寡核苷酸A與6巰基己1醇(MCH)摩爾比為110的混合液在QCM金電極表面自組裝。2.4 納米金表面的寡核苷酸修飾    取10 nm的

15、納米金溶液（濃度為32 nmol/L）100 L，加入與納米金摩爾比為200:1的巰基修飾的寡核苷酸B溶液，室溫反應(yīng)24 h后，在PBN中室溫靜置老化48 h，以16000 r/min離心30 min，除去上清液清洗兩次后，分散到PBN中；再加入20 L 0.10 mmol/LMCH溶液，混勻，放置30 min后加入等體積的乙酸乙酯1，使反應(yīng)終止，離心方法同上，最后分散到100 L PBN中，納米金濃度保持在32 nmol/L。MCH起到封閉納米金表面上的非特異性結(jié)

16、合位點(diǎn)和部分取代表面寡核苷酸的作用，以降低納米金表面寡核苷酸密度、減少空間位阻、提高雜交效率。  2.5 Hg2+的檢測(cè)    在QCM檢測(cè)池中加入380 L PBN，啟動(dòng)QCM檢測(cè)平臺(tái)，開(kāi)始記錄頻率，頻率（f0）穩(wěn)定后，分別加入10 L寡核苷酸修飾納米金(BNG)和待測(cè)Hg2+溶液，觀測(cè)QCM頻率變化（f=ff0），頻率穩(wěn)定后，加入與Hg2+形成更穩(wěn)定螯合物的半胱氨酸溶液(1 mmol/L)1，進(jìn)行傳感器的再生。f與電極表面質(zhì)量變化成正比，而質(zhì)量變化取決于QCM電極表面結(jié)合的納米金；據(jù)此，f與

17、溶液中Hg2+濃度成正比，用于Hg2+的定量檢測(cè)。檢測(cè)在室溫下進(jìn)行。    結(jié)果與討論Know thyself.  3.1 Hg2+介導(dǎo)TT配對(duì)的QCM頻率響應(yīng)特性    加入Hg2+溶液，QCM頻率變化時(shí)間關(guān)系如圖2曲線a所示。曲線b為不含任何金屬離子的空白實(shí)驗(yàn)。由圖2可見(jiàn)，加入BNG后頻率幾乎沒(méi)有變化，說(shuō)明不存在Hg2+時(shí)，B沒(méi)有與A雜交形成雙鏈，并且還沒(méi)有吸附；加入Hg2+之后，頻率下降并最終達(dá)到平衡，說(shuō)明通過(guò)堿基T和Hg2+的配位作用，在金電極表面形成了納米復(fù)合物，導(dǎo)致頻率大幅下降。頻率穩(wěn)定后，加

18、入半胱氨酸溶液，頻率迅速回升，并最終與未加Hg2+時(shí)的頻率基本重合。這是由于半胱氨酸能與Hg2+形成更穩(wěn)定的螯合物，從而奪取THg2+T結(jié)構(gòu)中的Hg2+19，使納米復(fù)合物分解，將BNG從金電極表面上釋放出來(lái)，實(shí)現(xiàn)了傳感器再生。3.2 寡核苷酸鏈長(zhǎng)度與T個(gè)數(shù)的影響    寡核苷酸的鏈長(zhǎng)和T個(gè)數(shù)對(duì)Hg2+檢測(cè)靈敏度有較大影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了5組寡核苷酸序列（見(jiàn)圖3a），以考察鏈長(zhǎng)和T個(gè)數(shù)對(duì)Hg2+檢測(cè)的影響，結(jié)果如圖3b所示。由圖3b可見(jiàn)，對(duì)應(yīng)QCM頻率下降程度從大到小的序列依次為23415。其原因可能是當(dāng)DNA鏈中不含堿基T或所含堿基T過(guò)少時(shí)（序列1

19、和5），納米復(fù)合物難以形成或不穩(wěn)定；而含堿基T過(guò)多時(shí)（序列3）與含堿基T少時(shí)（序列2）相比，每個(gè)寡核苷酸可結(jié)合更多的Hg2+，使靈敏度降低；而全部為堿基T時(shí)（序列4），除了納米金與QCM金電極表面的寡核苷酸配對(duì)外，不同納米金表面的寡核苷酸之間也可能配對(duì)，只有部分Hg2+在電極表面形成納米復(fù)合結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致靈敏度降低。本實(shí)驗(yàn)選擇鏈長(zhǎng)為9 bp、含7個(gè)T的序列2用于Hg2+檢測(cè)。論文分為專題型、論辯型、綜述型和綜合型四大類(lèi)      對(duì)5.0×1032.0 mol/L濃度范圍內(nèi)的Hg2+溶液進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4。隨著Hg2+濃度增加，頻率下降程度明顯增大；但當(dāng)Hg2+濃度 > 1.0 mol/L時(shí)，濃度對(duì)頻率影響不大，說(shuō)明QCM電極表面納米復(fù)合物基本達(dá)到飽和。在5100 nmol/L范圍內(nèi)，頻