基因工程的主要技術(shù)與原理

1、第四章第四章 基因工程的主要技術(shù)及原理基因工程的主要技術(shù)及原理 核酸的提取與純化核酸的提取與純化 核酸電泳核酸電泳 分子雜交分子雜交 PCRPCR技術(shù)技術(shù) DNADNA序列分析序列分析 大分子相互作用大分子相互作用分子雜交分子雜交 (molecular hybridization)：利用帶有標(biāo)記（放射性同位素(32P或125I)、生物素或熒光酶等）探針（DNA、RNA或蛋白質(zhì)）進(jìn)行相同或不同種類(lèi)分子間相互特異識(shí)別而發(fā)生結(jié)合的過(guò)程。 第三節(jié) 核酸和蛋白質(zhì)的分子雜交分子雜交固相雜交液相雜交濾膜雜交原位雜交印跡雜交斑點(diǎn)雜交Southern blotNorthern blotWestern blot支

2、持物不同分子雜交分類(lèi)分子雜交分類(lèi)分子雜交流程圖分子雜交流程圖樣樣品品制制備備電電泳泳雜雜交交轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜膜結(jié)結(jié)果果顯顯示示探針探針/ /抗體制備抗體制備按片斷長(zhǎng)短進(jìn)行分離 凝膠中的片段轉(zhuǎn)移到固相支持物DNA/DNADNA/RNA抗原/抗體提取DNA/RNA/蛋白放射自顯影熒光檢測(cè)顯色技術(shù) 一小段用放射性同位素、生物素或熒光染料進(jìn)行標(biāo)記的已知序列的核酸片段，即為探針（探針（probeprobe）探針可用于分子雜交，雜交后通過(guò)放射自顯影、熒光檢測(cè)或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來(lái)。根據(jù)標(biāo)記物不同根據(jù)標(biāo)記物不同可分為放射性探針和非放射性探針兩大類(lèi)；放射性標(biāo)記物（ -*N-dNTP ） 32p(14d)、35S

3、(87d)、3H(12y)和125I(60d)非放射性標(biāo)記物一、核酸探針?lè)欠派湫詷?biāo)記物的種類(lèi)半抗原：地高辛，利用半抗原的抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)。 配體：生物素，是一種抗生物素蛋白avidin和鏈親和素streptavidin的配體。熒光素：異硫氰酸熒光素和羅丹明，可被紫外線激發(fā)出熒光而被檢測(cè)到。光密度或電子密度標(biāo)記物： 金、銀根據(jù)探針的來(lái)源及核酸性質(zhì)不同根據(jù)探針的來(lái)源及核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，及寡核苷酸探針等幾類(lèi)。 寡核苷酸探針（寡核苷酸探針（oligonucleotid probe）：是人工合成且被適當(dāng)標(biāo)記的由短鏈核苷酸組成的大分子（即一段比較短的DNA或RNA

4、），能與被檢測(cè)長(zhǎng)鏈DNA或RNA進(jìn)行分子雜交，且雜交后可由該分了上的標(biāo)記顯示目的長(zhǎng)鏈DNA或RNA分子的存在。常用寡核苷酸探針的標(biāo)記物常用寡核苷酸探針的標(biāo)記物放射性同位素標(biāo)記： 32P、 33P、 35S非放射性標(biāo)記：生物素、地高辛生物素dUTP、生物素dATP、地高辛dUTP等（一）、探針的標(biāo)記物非放射性探針的標(biāo)記非放射性探針的標(biāo)記 生物素生物素標(biāo)記核酸標(biāo)記核酸 （光敏生物素、酶促生物素）（光敏生物素、酶促生物素） DNA DNA半抗原標(biāo)記半抗原標(biāo)記 熒光素?zé)晒馑貥?biāo)記標(biāo)記 以生物素化的脫氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio-7-dATP、Bio-11-dCTP）等代替相應(yīng)脫氧核苷三磷

5、酸，經(jīng)DNA聚合酶作用摻入新合成的DNA。可以采用缺口平移法和隨機(jī)引物延伸法進(jìn)行。 生物素標(biāo)記法生物素標(biāo)記法基本原理：生物素生物素-抗生物素蛋白抗生物素蛋白-酶酶(Avidin-Biotin-Enzyme-Complex)ABC熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記地高辛地高辛dUTPdUTP雜交探針的標(biāo)記雜交探針的標(biāo)記：DNADNA半抗原標(biāo)記半抗原標(biāo)記-地地高辛系統(tǒng)標(biāo)記高辛系統(tǒng)標(biāo)記地高辛（ Digoxigenin，DIG）是一種類(lèi)固醇半抗原，來(lái)源于植物(Digitalis purouren 和Digitalis lanta)的花和葉中，其他生物體中不含有地高辛抗體 DIG 可以與dUTP反應(yīng)形成DIG-dUTP，

6、通過(guò)酶促法插入到合成的DNA探針中。通過(guò)酶標(biāo)記的抗地高辛抗體來(lái)實(shí)施檢測(cè)。 原理原理：兩種地高辛兩種地高辛dUTPdUTP顯色系統(tǒng)顯色系統(tǒng) 非放射性核素探針的檢測(cè)非放射性核素探針的檢測(cè)p 偶聯(lián)反應(yīng)偶聯(lián)反應(yīng)l 半抗原:通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)與顯色體系偶聯(lián)。l 配體:親和法與顯色體系偶聯(lián)：生物素-抗生物素蛋白-酶（Avidin-Biotin-Enzyme-Complex ，ABC） p 顯顯色反應(yīng)色反應(yīng)通過(guò)連接在抗體或生物素蛋白的顯色物質(zhì)如酶、熒光素等進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測(cè)。 （二）、核酸探針的常用標(biāo)記方法 核酸探針的標(biāo)記幾乎核酸探針的標(biāo)記幾乎總是先將總是先將脫氧單核苷酸底脫氧單核苷酸底物標(biāo)記物標(biāo)記相應(yīng)的信

7、號(hào)，然后相應(yīng)的信號(hào)，然后利用核酸合成利用核酸合成的方法合成的方法合成具有具有標(biāo)記信號(hào)的核苷酸標(biāo)記信號(hào)的核苷酸鏈鏈p 放射性探針的標(biāo)記 缺口平移法（缺口平移法（nick translationnick translation） PCR PCR法法 DNA DNA快速末端標(biāo)記快速末端標(biāo)記 T4 T4多核苷酸激酶標(biāo)記多核苷酸激酶標(biāo)記DNA 5DNA 5末端末端 隨機(jī)引物延伸隨機(jī)引物延伸 由由DNase和大腸和大腸桿菌桿菌DNA聚合酶聚合酶共同完成。共同完成。DNase：在雙鏈在雙鏈DNA上隨機(jī)打開(kāi)若上隨機(jī)打開(kāi)若干個(gè)單鏈缺口，產(chǎn)干個(gè)單鏈缺口，產(chǎn)生生3-OH端端大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合聚合酶酶：53D

8、NA聚聚合酶活性；合酶活性； 53外切核酸酶活性外切核酸酶活性（1）缺口平移）缺口平移標(biāo)記法標(biāo)記法（nicktranslation）隨機(jī)引物：含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物。46 = 4096DNA聚合酶Klenow片段53DNA聚合酶活性 弱35外切核酸酶活性無(wú)53外切核酸酶活性（2 2）隨機(jī)引物法）隨機(jī)引物法（random primingrandom priming） 產(chǎn)物產(chǎn)物平均長(zhǎng)度平均長(zhǎng)度為為400-600400-600個(gè)核苷酸。個(gè)核苷酸。 KlenowKlenow片段沒(méi)有片段沒(méi)有5 5 33外切酶活性外切酶活性, , 反應(yīng)穩(wěn)定反應(yīng)穩(wěn)定, , 可以獲得大量的有效探針?？梢垣@

9、得大量的有效探針。 反應(yīng)時(shí)對(duì)反應(yīng)時(shí)對(duì)模板的要求不嚴(yán)格模板的要求不嚴(yán)格, , 用微量制備的質(zhì)粒用微量制備的質(zhì)粒DNADNA模板也可進(jìn)行反應(yīng)。模板也可進(jìn)行反應(yīng)。制備制備高比活性探針高比活性探針(10(101010 cpm/gDNA); cpm/gDNA);（3 3）末端標(biāo)記法）末端標(biāo)記法 T4 DNAT4 DNA聚合酶聚合酶53聚合酶活性，1500 nt/min, 為pol I的兩倍 35外切酶活性，可作用于ssDNA和dsDNA, 其切除速度分別為40和 4000nt/min適用于合成寡核苷酸探針的標(biāo)記，用末端標(biāo)記制備的探針一般攜帶的標(biāo)記分子較少。補(bǔ)平或標(biāo)記DNA分子由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3凹端對(duì)帶

10、有3黏性末端或平末端的DNA片段進(jìn)行標(biāo)記，制備探針二、Southern 雜交 (Southern blotting )基本原理 將待檢測(cè)的DNA樣品固定在固相載體上，與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號(hào)。通過(guò)Southern雜交可以判斷被檢測(cè)的DNA樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的長(zhǎng)度。目標(biāo)目標(biāo) DNA DNA 經(jīng)經(jīng)過(guò)限制性酶切過(guò)限制性酶切并通過(guò)瓊脂糖并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳凝膠電泳0.4N NaOH 0.4N NaOH 變性變性1.5M NaCl/1M Tris1.5M NaCl/1M Tris（pH7.4pH7.4） 中和中和使使 DNA DN

11、A 仍保持單鏈狀態(tài)仍保持單鏈狀態(tài)將凝膠上的將凝膠上的 DNA DNA 轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上通過(guò)通過(guò) 80 80 處理或紫外線處理或紫外線照射將照射將 DNA DNA 固定在濾膜上固定在濾膜上將結(jié)合了將結(jié)合了 DNA DNA 分子的濾膜先與分子的濾膜先與特定的預(yù)雜液進(jìn)行特定的預(yù)雜液進(jìn)行預(yù)雜交預(yù)雜交，將濾膜的空白處用魚(yú)精將濾膜的空白處用魚(yú)精 DNA DNA 或或牛奶蛋白封閉起來(lái)，防止在雜交過(guò)牛奶蛋白封閉起來(lái)，防止在雜交過(guò)程中濾膜本身對(duì)探針的吸附程中濾膜本身對(duì)探針的吸附雜交雜交：在一定的溶液條件在一定的溶液條件和溫度下，將標(biāo)記的核酸和溫度下，將標(biāo)記的核酸探針與

12、濾膜混合，如果濾探針與濾膜混合，如果濾膜上的膜上的 DNA DNA 分子存在與探分子存在與探針同源的序列，那么探針針同源的序列，那么探針將與該分子形成雜合雙鏈，將與該分子形成雜合雙鏈，從而吸附在濾膜上從而吸附在濾膜上 洗膜洗膜：經(jīng)過(guò)：經(jīng)過(guò)一定的洗滌程一定的洗滌程序?qū)⒂坞x的探序?qū)⒂坞x的探針?lè)肿映メ樂(lè)肿映z測(cè)：檢測(cè)：放射性標(biāo)記、檢測(cè)放射性標(biāo)記、檢測(cè)非放射性標(biāo)記、檢測(cè)非放射性標(biāo)記、檢測(cè) 分子雜交爐分子雜交爐 紫外交聯(lián)儀紫外交聯(lián)儀 三、Northern 雜交(Northern blotting )基本原理p Northern blot是在變性條件下將待檢RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同So

13、uthern Blot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測(cè)。定性分析mRNA的常用方法p 用于分析基因轉(zhuǎn)錄與否以及轉(zhuǎn)錄水平的變化，比較兩個(gè)或以上不同組織或細(xì)胞某一已知基因轉(zhuǎn)錄水平的差異三、Northern 雜交(Northern blotting )1、基本原理和基本過(guò)程與Southern blot基本相同2、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性;不能用堿變性，防止水解。用甲基氫氧化銀、乙二醇或甲醛變性。3、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理，Southern印跡時(shí)，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理4、靶核酸為RNA5、探針可用DN

14、A或RNA片段 mRNA mRNA提取提取甲醛變性電泳甲醛變性電泳 印跡轉(zhuǎn)移印跡轉(zhuǎn)移預(yù)雜交預(yù)雜交 雜交（變性探針）雜交（變性探針）洗膜洗膜放射自顯影或化學(xué)發(fā)光放射自顯影或化學(xué)發(fā)光甲醛變性電泳：甲醛變性電泳： RNA變性，消除RNA中的二級(jí)結(jié)構(gòu)，保證RNA完全按照分子的大小分離。 DEPC水處理電泳槽，去除RNA酶 在通風(fēng)櫥中加入甲醛，放置一段時(shí)間以減少甲醛蒸汽。 四、Western 雜交(Western blotting )n 檢測(cè)蛋白質(zhì)，即將電泳分離的非標(biāo)記蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上，用特異的抗體對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及定量的方法n 免疫印跡（immunoblotting）n Western blot

15、是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。n 可用于分析蛋白質(zhì)水平的變化四、Western 雜交(Western blotting )經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（如NC膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。 采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗基本原理基本原理主要步驟： 蛋白質(zhì)樣品的制備 SDS-聚丙烯酰

16、胺凝膠(PAGE)電泳 蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移：NC膜 靶蛋白的免疫學(xué)檢測(cè) 靶蛋白于第一抗體（一抗）反應(yīng) 與標(biāo)記的第二抗體（酶標(biāo)，二抗）反應(yīng) 顯色反應(yīng)：酶促反應(yīng)四、Western 雜交(Western blotting )三種分子雜交技術(shù)的比較三種分子雜交技術(shù)的比較SouthernNorthernWestern五、原位雜交(in situ hybridization)將標(biāo)記的核酸探針與將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱(chēng)為原位雜交。核酸進(jìn)行雜交，稱(chēng)為原位雜交。特點(diǎn)特點(diǎn)能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，對(duì)含量

17、極低的靶序列靈敏度高不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，對(duì)含量極低的靶序列靈敏度高能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)細(xì)胞細(xì)胞或組織的固定后置于載玻片上或組織的固定后置于載玻片上組織細(xì)胞組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理雜交前的預(yù)處理用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì)用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì)探針探針的選擇和標(biāo)記的選擇和標(biāo)記雜交雜交雜交雜交結(jié)果檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)基本步驟基本步驟菌落或噬菌斑雜交，將生長(zhǎng)在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑按照其原來(lái)的位置不變地轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用基本程序是：將被篩選的大腸桿菌菌落或噬菌斑，從其生長(zhǎng)的瓊脂平板中轉(zhuǎn)移到硝

18、酸纖維素濾膜上，進(jìn)行適當(dāng)?shù)臏赜?，保存原?lái)的菌落平板作為參照，以便從中挑取陽(yáng)性克隆。復(fù)制平板和膜復(fù)制平板和膜轉(zhuǎn)印時(shí)應(yīng)在平轉(zhuǎn)印時(shí)應(yīng)在平板和膜上的一板和膜上的一側(cè)做三個(gè)對(duì)應(yīng)側(cè)做三個(gè)對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽的標(biāo)簽0.5MNaOH0.5MNaOH裂解細(xì)菌裂解細(xì)菌酸中和酸中和蛋白酶處理蛋白酶處理漂洗細(xì)胞碎片漂洗細(xì)胞碎片8080烘烤烘烤與與3232P-P-標(biāo)標(biāo)記的探記的探針雜交針雜交放射性放射性自顯影自顯影在參照平板上挑在參照平板上挑取目標(biāo)陽(yáng)性克隆取目標(biāo)陽(yáng)性克?。?yáng)性菌落）擴(kuò)（陽(yáng)性菌落）擴(kuò)大培養(yǎng)大培養(yǎng)菌菌落落原原位位雜雜交交一、PCR技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)是80年

19、代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，利用單鏈寡核苷酸引物對(duì)特異DNA片段進(jìn)行體外擴(kuò)增的一種方法Applied Applied Biosystems Biosystems GeneAmp PCR 9700 GeneAmp PCR 9700 Thermocycler Thermocycler 第四節(jié) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)二、PCR技術(shù)基本原理和操作 類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物基本反應(yīng)步驟變性退火延伸變性1.PCR技術(shù)基本原理模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加 熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物

20、結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備模板DNA與引 物的退火(復(fù)性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸DNA模板-引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈 預(yù)變性預(yù)變性模板模板DNA dNTP 引物引物BufferTaqDNA聚合酶聚合酶94oC5min模板模板DNA dNTP 引物引物BufferTaq 酶酶模板模板DNA dNTP 引物引物Buffer94 30s55 1min72 2.5minTaq 酶酶模板模板DNA dNTP

21、 引物引物Buffer72 710 min第二輪擴(kuò)增第二輪擴(kuò)增第三輪擴(kuò)增第三輪擴(kuò)增第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物目的基因目的基因目的基因目的基因瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用下面的公式計(jì)算。Y(1X)nY：代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)X：表示平均每次的擴(kuò)增效率n：代表循環(huán)次數(shù)平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值每完成一個(gè)循環(huán)需 24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨

22、著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn) 入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱(chēng)平臺(tái)效應(yīng) 2. PCR 的特點(diǎn) 操作簡(jiǎn)單省時(shí)：1-2 hr靈敏度高：pg特異性強(qiáng)對(duì)原始材料質(zhì) 量要求低有一定程度的單核苷酸錯(cuò)誤摻入三、PCR技術(shù)的反應(yīng)體系、條件和過(guò)程引物、酶(熱穩(wěn)定性DNA聚合酶)、dNTP、模板和二價(jià)陽(yáng)離子（Mg2+）、一價(jià)陽(yáng)離子（K+）、緩沖液 PCR反應(yīng)的基本成分10擴(kuò)增緩沖液KCl 500mmol.L-1Tris-HCl 100mmol.L-1(pH8.3-8.8)MgCl 15mmol.L-1明膠 0.1%在延伸溫度（72 ）下，pH 值接近 7.2，

23、二價(jià)陽(yáng)離子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 1.5mM Mg2+ ，有時(shí)使用 Mn2+。dNTP都能結(jié)合Mg2+ ，因此Mg2+ 的濃度要大于dNTP， KCl對(duì)擴(kuò)增大于500bp長(zhǎng)度和改善DNA片段產(chǎn)物是有益的標(biāo)準(zhǔn)的 PCR 反應(yīng)體系中含有等摩爾濃度的 4 種 dNTP ，即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP （終濃度：250 mol/L）dNTP酶及其濃度Selection for DNA polymeraseKlenow酶，早期采用，該酶不耐熱，缺點(diǎn)有溫度要求低(37)，受熱即失活；產(chǎn)物特異性不高；積累大量的失活殘酶，使反應(yīng)產(chǎn)物純度大大降低；擴(kuò)增的最長(zhǎng)序列約400

24、bp（Taq酶則能擴(kuò)增10kb）thermostable DNA polymerasesTaq DNA polymeraseTth DNA polymerasefrom T.thermophilusVENT DNA polymerasefrom T.litoralisSac polymerasepfu polymeraseTaq DNA聚合酶分離:1969年，美國(guó)黃石國(guó)家公園溫泉分子量:94KDa活性：在幾種水生棲熱菌中活性最高，200 000U/mg如何選擇最合適的如何選擇最合適的DNADNA聚合酶聚合酶 PCR PCR 實(shí)驗(yàn)的不同需求實(shí)驗(yàn)的不同需求特特 異異 性性：基因組擴(kuò)增、RT-PCR

25、保保 真真 性性：基因篩選、測(cè)序、 TA克隆長(zhǎng)片段擴(kuò)增長(zhǎng)片段擴(kuò)增：構(gòu)建基因圖譜、測(cè)序、分子遺傳學(xué)擴(kuò)增擴(kuò)增效率效率：復(fù)雜模板擴(kuò)增（GC含量高、二級(jí)結(jié)構(gòu)）PCRPCR試劑盒試劑盒：復(fù)雜模板擴(kuò)增、大規(guī)?；驒z測(cè)特點(diǎn)：特點(diǎn)： 3535核酸外切酶活性，降低堿基錯(cuò)配率核酸外切酶活性，降低堿基錯(cuò)配率用途：用途：表達(dá)基因的克隆基因的定點(diǎn)突變細(xì)胞內(nèi)基因點(diǎn)突變分析（SNP）高保真酶高保真酶混合酶熱啟動(dòng)耐熱聚合酶 35核酸外切酶用途超長(zhǎng)片段擴(kuò)增、測(cè)序構(gòu)建基因圖譜復(fù)雜模板擴(kuò)增： GC含量高、 二級(jí)結(jié)構(gòu)引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。引物設(shè)計(jì)引物的原則引物長(zhǎng)度： 16

26、-30bp，常用為20-24bp左右引物的有效長(zhǎng)度不能大于 38bp，否則最適延伸溫度會(huì)超過(guò)Taq DNA聚合酶的最適溫度（72），不能保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性引物擴(kuò)增跨度：以500bp為宜特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段引物堿基：G+C含量以40-60%為宜G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)避免兩條引物間互補(bǔ)， 特別是 3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增條帶 引物 3端的堿基要求嚴(yán)格配對(duì) 特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗 引物中有或能

27、加上合適的酶切位點(diǎn)被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性引物量：每條引物的濃度0.11umol或10100 pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)引物的解鏈溫度兩個(gè)引物之間的 Tm 值差異最好在 2-5 Tm值的定義，是兩段互補(bǔ)的堿基序列解鏈50%時(shí)的溫度設(shè)計(jì)引物的方法設(shè)計(jì)引物的操作流程同源性比較序列下載引物設(shè)計(jì)篩選根據(jù)所需要檢測(cè)的基因在/pubmed 查詢有關(guān)序列利用primer

28、premier 5.0等軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)和篩選PCR反應(yīng)條件的選擇 溫度與時(shí)間的設(shè)置 三溫度點(diǎn)法 雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至40 60，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸 (標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)) 二溫度點(diǎn)法 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94變性，65左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。 較短靶基因(長(zhǎng)度為100300bp)時(shí)變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，9394 1min足以使模板DNA變性，若低于93則 需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的

29、活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。 變性溫度與時(shí)間 退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至4060，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。 由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。 退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng) 度。對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。 退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值-(510)在Tm值允許范圍

30、內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 延伸溫度與時(shí)間： PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075之間，常用溫度為72，過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。 PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠 的。34kb的靶序列需34min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選

31、在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。 循環(huán)次數(shù)RT-PCR （reverse transcription PCR）RT-PCR是以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA、再以cDNA為模板進(jìn)行特異性擴(kuò)增，進(jìn)行RNA定性或定量分析的一種方法原理p通過(guò)合適的引物，將細(xì)胞內(nèi)的RNA（一般為mRNA)逆轉(zhuǎn)錄成cDNAp然后，通過(guò)PCR技術(shù)，將痕量的cDNA擴(kuò)增成大量的雙鏈DNA。p獲得的dsDNA可通過(guò)測(cè)序獲得目的基因，也可用于基因操作。熒光實(shí)時(shí)定量PCR(fluorescence Quantified real time PCR)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applie

32、d Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。原理：所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。PCRPCR實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程PCRPCR產(chǎn)物純化產(chǎn)物純化PCRPCR產(chǎn)物純化試劑盒產(chǎn)物純化試劑盒PCR產(chǎn)物電泳PCRPCR常見(jiàn)問(wèn)題常見(jiàn)問(wèn)題正對(duì)照有條帶，而樣品則無(wú)原因：該Buffer對(duì)樣品不合適引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解模板:含有抑制物，含量低反應(yīng)條件：

33、退火溫度太高，延伸時(shí)間太短優(yōu)化純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA更換Buffer或調(diào)整濃度重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶原因：1.引物特異性差2.酶純度不高3.Mg2+濃度偏高4.退火溫度偏低5.Buffer不合適6.循環(huán)次數(shù)過(guò)多解決：1.重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR2.換用高純度的酶3.降低鎂離子濃度4.適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法5.更換Buffer6.減少循環(huán)次數(shù) 拖尾拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)原因：1

34、.酶量過(guò)多2.模板不純3.循環(huán)次數(shù)過(guò)多4.dNTP、Mg2+濃度偏高5.退火溫度偏低6.Buffer不合適解決：1.適量用酶2.純化模板3.減少循環(huán)次數(shù)4.適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度5.適當(dāng)提高退火溫度6.更換Buffer假陽(yáng)性假陽(yáng)性現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染對(duì)策：1.操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外2.除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。3.各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。 第五節(jié) DNA序列的測(cè)定 DNA測(cè)序技術(shù)主要

35、有兩種方法，都是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)明的。 A. 雙脫氧鏈終止法(Sanger dideoxy procedure ) 是通過(guò)合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈來(lái)讀取待測(cè)DNA分子的順序。 B. 化學(xué)降解法（ Maxam-Gilbert procedure ），是將雙鏈DNA分子用化學(xué)試劑處理，產(chǎn)生切口，用同位素標(biāo)記進(jìn)行測(cè)序。Frederick Sanger一、雙脫氧法測(cè)序 (Sanger dideoxy procedure )雙脫氧法測(cè)序原理利用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止物測(cè)定DNA核苷酸順序的方法，是由英國(guó)劍橋分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的生物化學(xué)家F. Sanger等人于1977年發(fā)明的?；驹恚?聚丙烯酰胺凝膠電泳可以區(qū)分長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸的DNA分子； 利用DNA聚合酶不能夠區(qū)分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP參入到寡核苷酸鏈的3-末端。因?yàn)閐dNTP 3不是-OH，不能與下一個(gè)核苷酸聚合延伸，從而終止DNA鏈的增長(zhǎng)。具體操作： 測(cè)序時(shí)分成四個(gè)反應(yīng), 每個(gè)反應(yīng)除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的A, C, G, T核苷三磷酸（稱(chēng)為ddATP, ddCTP,ddGT