基因工程的主要技術與原理

1、第四章第四章 基因工程的主要技術及原理基因工程的主要技術及原理 核酸的提取與純化核酸的提取與純化 核酸電泳核酸電泳 分子雜交分子雜交 PCRPCR技術技術 DNADNA序列分析序列分析 大分子相互作用大分子相互作用分子雜交分子雜交 (molecular hybridization)：利用帶有標記（放射性同位素(32P或125I)、生物素或熒光酶等）探針（DNA、RNA或蛋白質）進行相同或不同種類分子間相互特異識別而發(fā)生結合的過程。 第三節(jié) 核酸和蛋白質的分子雜交分子雜交固相雜交液相雜交濾膜雜交原位雜交印跡雜交斑點雜交Southern blotNorthern blotWestern blot支

2、持物不同分子雜交分類分子雜交分類分子雜交流程圖分子雜交流程圖樣樣品品制制備備電電泳泳雜雜交交轉轉膜膜結結果果顯顯示示探針探針/ /抗體制備抗體制備按片斷長短進行分離 凝膠中的片段轉移到固相支持物DNA/DNADNA/RNA抗原/抗體提取DNA/RNA/蛋白放射自顯影熒光檢測顯色技術 一小段用放射性同位素、生物素或熒光染料進行標記的已知序列的核酸片段，即為探針（探針（probeprobe）探針可用于分子雜交，雜交后通過放射自顯影、熒光檢測或顯色技術，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來。根據(jù)標記物不同根據(jù)標記物不同可分為放射性探針和非放射性探針兩大類；放射性標記物（ -*N-dNTP ） 32p(14d)、35S

3、(87d)、3H(12y)和125I(60d)非放射性標記物一、核酸探針非放射性標記物的種類半抗原：地高辛，利用半抗原的抗體進行免疫學檢測。 配體：生物素，是一種抗生物素蛋白avidin和鏈親和素streptavidin的配體。熒光素：異硫氰酸熒光素和羅丹明，可被紫外線激發(fā)出熒光而被檢測到。光密度或電子密度標記物： 金、銀根據(jù)探針的來源及核酸性質不同根據(jù)探針的來源及核酸性質不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，及寡核苷酸探針等幾類。 寡核苷酸探針（寡核苷酸探針（oligonucleotid probe）：是人工合成且被適當標記的由短鏈核苷酸組成的大分子（即一段比較短的DNA或RNA

4、），能與被檢測長鏈DNA或RNA進行分子雜交，且雜交后可由該分了上的標記顯示目的長鏈DNA或RNA分子的存在。常用寡核苷酸探針的標記物常用寡核苷酸探針的標記物放射性同位素標記： 32P、 33P、 35S非放射性標記：生物素、地高辛生物素dUTP、生物素dATP、地高辛dUTP等（一）、探針的標記物非放射性探針的標記非放射性探針的標記 生物素生物素標記核酸標記核酸 （光敏生物素、酶促生物素）（光敏生物素、酶促生物素） DNA DNA半抗原標記半抗原標記 熒光素熒光素標記標記 以生物素化的脫氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio-7-dATP、Bio-11-dCTP）等代替相應脫氧核苷三磷

5、酸，經(jīng)DNA聚合酶作用摻入新合成的DNA?？梢圆捎萌笨谄揭品ê碗S機引物延伸法進行。 生物素標記法生物素標記法基本原理：生物素生物素-抗生物素蛋白抗生物素蛋白-酶酶(Avidin-Biotin-Enzyme-Complex)ABC熒光標記熒光標記地高辛地高辛dUTPdUTP雜交探針的標記雜交探針的標記：DNADNA半抗原標記半抗原標記-地地高辛系統(tǒng)標記高辛系統(tǒng)標記地高辛（ Digoxigenin，DIG）是一種類固醇半抗原，來源于植物(Digitalis purouren 和Digitalis lanta)的花和葉中，其他生物體中不含有地高辛抗體 DIG 可以與dUTP反應形成DIG-dUTP，

6、通過酶促法插入到合成的DNA探針中。通過酶標記的抗地高辛抗體來實施檢測。 原理原理：兩種地高辛兩種地高辛dUTPdUTP顯色系統(tǒng)顯色系統(tǒng) 非放射性核素探針的檢測非放射性核素探針的檢測p 偶聯(lián)反應偶聯(lián)反應l 半抗原:通過抗原-抗體反應與顯色體系偶聯(lián)。l 配體:親和法與顯色體系偶聯(lián)：生物素-抗生物素蛋白-酶（Avidin-Biotin-Enzyme-Complex ，ABC） p 顯顯色反應色反應通過連接在抗體或生物素蛋白的顯色物質如酶、熒光素等進行雜交信號的檢測。 （二）、核酸探針的常用標記方法 核酸探針的標記幾乎核酸探針的標記幾乎總是先將總是先將脫氧單核苷酸底脫氧單核苷酸底物標記物標記相應的信

7、號，然后相應的信號，然后利用核酸合成利用核酸合成的方法合成的方法合成具有具有標記信號的核苷酸標記信號的核苷酸鏈鏈p 放射性探針的標記 缺口平移法（缺口平移法（nick translationnick translation） PCR PCR法法 DNA DNA快速末端標記快速末端標記 T4 T4多核苷酸激酶標記多核苷酸激酶標記DNA 5DNA 5末端末端 隨機引物延伸隨機引物延伸 由由DNase和大腸和大腸桿菌桿菌DNA聚合酶聚合酶共同完成。共同完成。DNase：在雙鏈在雙鏈DNA上隨機打開若上隨機打開若干個單鏈缺口，產(chǎn)干個單鏈缺口，產(chǎn)生生3-OH端端大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合聚合酶酶：53D

8、NA聚聚合酶活性；合酶活性； 53外切核酸酶活性外切核酸酶活性（1）缺口平移）缺口平移標記法標記法（nicktranslation）隨機引物：含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物。46 = 4096DNA聚合酶Klenow片段53DNA聚合酶活性 弱35外切核酸酶活性無53外切核酸酶活性（2 2）隨機引物法）隨機引物法（random primingrandom priming） 產(chǎn)物產(chǎn)物平均長度平均長度為為400-600400-600個核苷酸。個核苷酸。 KlenowKlenow片段沒有片段沒有5 5 33外切酶活性外切酶活性, , 反應穩(wěn)定反應穩(wěn)定, , 可以獲得大量的有效探針?？梢垣@

9、得大量的有效探針。 反應時對反應時對模板的要求不嚴格模板的要求不嚴格, , 用微量制備的質粒用微量制備的質粒DNADNA模板也可進行反應。模板也可進行反應。制備制備高比活性探針高比活性探針(10(101010 cpm/gDNA); cpm/gDNA);（3 3）末端標記法）末端標記法 T4 DNAT4 DNA聚合酶聚合酶53聚合酶活性，1500 nt/min, 為pol I的兩倍 35外切酶活性，可作用于ssDNA和dsDNA, 其切除速度分別為40和 4000nt/min適用于合成寡核苷酸探針的標記，用末端標記制備的探針一般攜帶的標記分子較少。補平或標記DNA分子由核酸內切酶產(chǎn)生的3凹端對帶

10、有3黏性末端或平末端的DNA片段進行標記，制備探針二、Southern 雜交 (Southern blotting )基本原理 將待檢測的DNA樣品固定在固相載體上，與標記的核酸探針進行雜交，在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號。通過Southern雜交可以判斷被檢測的DNA樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的長度。目標目標 DNA DNA 經(jīng)經(jīng)過限制性酶切過限制性酶切并通過瓊脂糖并通過瓊脂糖凝膠電泳凝膠電泳0.4N NaOH 0.4N NaOH 變性變性1.5M NaCl/1M Tris1.5M NaCl/1M Tris（pH7.4pH7.4） 中和中和使使 DNA DN

11、A 仍保持單鏈狀態(tài)仍保持單鏈狀態(tài)將凝膠上的將凝膠上的 DNA DNA 轉移到轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上通過通過 80 80 處理或紫外線處理或紫外線照射將照射將 DNA DNA 固定在濾膜上固定在濾膜上將結合了將結合了 DNA DNA 分子的濾膜先與分子的濾膜先與特定的預雜液進行特定的預雜液進行預雜交預雜交，將濾膜的空白處用魚精將濾膜的空白處用魚精 DNA DNA 或或牛奶蛋白封閉起來，防止在雜交過牛奶蛋白封閉起來，防止在雜交過程中濾膜本身對探針的吸附程中濾膜本身對探針的吸附雜交雜交：在一定的溶液條件在一定的溶液條件和溫度下，將標記的核酸和溫度下，將標記的核酸探針與

12、濾膜混合，如果濾探針與濾膜混合，如果濾膜上的膜上的 DNA DNA 分子存在與探分子存在與探針同源的序列，那么探針針同源的序列，那么探針將與該分子形成雜合雙鏈，將與該分子形成雜合雙鏈，從而吸附在濾膜上從而吸附在濾膜上 洗膜洗膜：經(jīng)過：經(jīng)過一定的洗滌程一定的洗滌程序將游離的探序將游離的探針分子除去針分子除去檢測：檢測：放射性標記、檢測放射性標記、檢測非放射性標記、檢測非放射性標記、檢測 分子雜交爐分子雜交爐 紫外交聯(lián)儀紫外交聯(lián)儀 三、Northern 雜交(Northern blotting )基本原理p Northern blot是在變性條件下將待檢RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同So

13、uthern Blot相同的原理進行轉膜和用探針進行雜交檢測。定性分析mRNA的常用方法p 用于分析基因轉錄與否以及轉錄水平的變化，比較兩個或以上不同組織或細胞某一已知基因轉錄水平的差異三、Northern 雜交(Northern blotting )1、基本原理和基本過程與Southern blot基本相同2、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性;不能用堿變性，防止水解。用甲基氫氧化銀、乙二醇或甲醛變性。3、轉膜：RNA轉膜前不需變性和中和處理，Southern印跡時，DNA轉膜前需進行堿變性及中和處理4、靶核酸為RNA5、探針可用DN

14、A或RNA片段 mRNA mRNA提取提取甲醛變性電泳甲醛變性電泳 印跡轉移印跡轉移預雜交預雜交 雜交（變性探針）雜交（變性探針）洗膜洗膜放射自顯影或化學發(fā)光放射自顯影或化學發(fā)光甲醛變性電泳：甲醛變性電泳： RNA變性，消除RNA中的二級結構，保證RNA完全按照分子的大小分離。 DEPC水處理電泳槽，去除RNA酶 在通風櫥中加入甲醛，放置一段時間以減少甲醛蒸汽。 四、Western 雜交(Western blotting )n 檢測蛋白質，即將電泳分離的非標記蛋白質轉移到固相載體上，用特異的抗體對蛋白質進行鑒定及定量的方法n 免疫印跡（immunoblotting）n Western blot

15、是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。n 可用于分析蛋白質水平的變化四、Western 雜交(Western blotting )經(jīng)過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（如NC膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。 采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗基本原理基本原理主要步驟： 蛋白質樣品的制備 SDS-聚丙烯酰

16、胺凝膠(PAGE)電泳 蛋白質的電轉移：NC膜 靶蛋白的免疫學檢測 靶蛋白于第一抗體（一抗）反應 與標記的第二抗體（酶標，二抗）反應 顯色反應：酶促反應四、Western 雜交(Western blotting )三種分子雜交技術的比較三種分子雜交技術的比較SouthernNorthernWestern五、原位雜交(in situ hybridization)將標記的核酸探針與將標記的核酸探針與細胞或組織中的細胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交。核酸進行雜交，稱為原位雜交。特點特點能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究不需從組織或細胞中提取核酸，對含量

17、極低的靶序列靈敏度高不需從組織或細胞中提取核酸，對含量極低的靶序列靈敏度高能準確反映組織細胞的相互關系及功能狀態(tài)能準確反映組織細胞的相互關系及功能狀態(tài)細胞細胞或組織的固定后置于載玻片上或組織的固定后置于載玻片上組織細胞組織細胞雜交前的預處理雜交前的預處理用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質探針探針的選擇和標記的選擇和標記雜交雜交雜交雜交結果檢測結果檢測基本步驟基本步驟菌落或噬菌斑雜交，將生長在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑按照其原來的位置不變地轉移到濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用基本程序是：將被篩選的大腸桿菌菌落或噬菌斑，從其生長的瓊脂平板中轉移到硝

18、酸纖維素濾膜上，進行適當?shù)臏赜?，保存原來的菌落平板作為參照，以便從中挑取陽性克隆。復制平板和膜復制平板和膜轉印時應在平轉印時應在平板和膜上的一板和膜上的一側做三個對應側做三個對應的標簽的標簽0.5MNaOH0.5MNaOH裂解細菌裂解細菌酸中和酸中和蛋白酶處理蛋白酶處理漂洗細胞碎片漂洗細胞碎片8080烘烤烘烤與與3232P-P-標標記的探記的探針雜交針雜交放射性放射性自顯影自顯影在參照平板上挑在參照平板上挑取目標陽性克隆取目標陽性克?。栃跃洌U（陽性菌落）擴大培養(yǎng)大培養(yǎng)菌菌落落原原位位雜雜交交一、PCR技術聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)是80年

19、代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術，利用單鏈寡核苷酸引物對特異DNA片段進行體外擴增的一種方法Applied Applied Biosystems Biosystems GeneAmp PCR 9700 GeneAmp PCR 9700 Thermocycler Thermocycler 第四節(jié) 聚合酶鏈式反應技術二、PCR技術基本原理和操作 類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物基本反應步驟變性退火延伸變性1.PCR技術基本原理模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加 熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物

20、結合，為下輪反應作準備模板DNA與引 物的退火(復性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物的延伸DNA模板-引物結合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈 預變性預變性模板模板DNA dNTP 引物引物BufferTaqDNA聚合酶聚合酶94oC5min模板模板DNA dNTP 引物引物BufferTaq 酶酶模板模板DNA dNTP 引物引物Buffer94 30s55 1min72 2.5minTaq 酶酶模板模板DNA dNTP

21、 引物引物Buffer72 710 min第二輪擴增第二輪擴增第三輪擴增第三輪擴增第一輪擴增產(chǎn)物第一輪擴增產(chǎn)物目的基因目的基因目的基因目的基因瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。反應最終的DNA 擴增量可用下面的公式計算。Y(1X)nY：代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)X：表示平均每次的擴增效率n：代表循環(huán)次數(shù)平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值每完成一個循環(huán)需 24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨

22、著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進 入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應”，這種效應稱平臺效應 2. PCR 的特點 操作簡單省時：1-2 hr靈敏度高：pg特異性強對原始材料質 量要求低有一定程度的單核苷酸錯誤摻入三、PCR技術的反應體系、條件和過程引物、酶(熱穩(wěn)定性DNA聚合酶)、dNTP、模板和二價陽離子（Mg2+）、一價陽離子（K+）、緩沖液 PCR反應的基本成分10擴增緩沖液KCl 500mmol.L-1Tris-HCl 100mmol.L-1(pH8.3-8.8)MgCl 15mmol.L-1明膠 0.1%在延伸溫度（72 ）下，pH 值接近 7.2，

23、二價陽離子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 1.5mM Mg2+ ，有時使用 Mn2+。dNTP都能結合Mg2+ ，因此Mg2+ 的濃度要大于dNTP， KCl對擴增大于500bp長度和改善DNA片段產(chǎn)物是有益的標準的 PCR 反應體系中含有等摩爾濃度的 4 種 dNTP ，即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP （終濃度：250 mol/L）dNTP酶及其濃度Selection for DNA polymeraseKlenow酶，早期采用，該酶不耐熱，缺點有溫度要求低(37)，受熱即失活；產(chǎn)物特異性不高；積累大量的失活殘酶，使反應產(chǎn)物純度大大降低；擴增的最長序列約400

24、bp（Taq酶則能擴增10kb）thermostable DNA polymerasesTaq DNA polymeraseTth DNA polymerasefrom T.thermophilusVENT DNA polymerasefrom T.litoralisSac polymerasepfu polymeraseTaq DNA聚合酶分離:1969年，美國黃石國家公園溫泉分子量:94KDa活性：在幾種水生棲熱菌中活性最高，200 000U/mg如何選擇最合適的如何選擇最合適的DNADNA聚合酶聚合酶 PCR PCR 實驗的不同需求實驗的不同需求特特 異異 性性：基因組擴增、RT-PCR

25、保保 真真 性性：基因篩選、測序、 TA克隆長片段擴增長片段擴增：構建基因圖譜、測序、分子遺傳學擴增擴增效率效率：復雜模板擴增（GC含量高、二級結構）PCRPCR試劑盒試劑盒：復雜模板擴增、大規(guī)?；驒z測特點：特點： 3535核酸外切酶活性，降低堿基錯配率核酸外切酶活性，降低堿基錯配率用途：用途：表達基因的克隆基因的定點突變細胞內基因點突變分析（SNP）高保真酶高保真酶混合酶熱啟動耐熱聚合酶 35核酸外切酶用途超長片段擴增、測序構建基因圖譜復雜模板擴增： GC含量高、 二級結構引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。引物設計引物的原則引物長度： 16

26、-30bp，常用為20-24bp左右引物的有效長度不能大于 38bp，否則最適延伸溫度會超過Taq DNA聚合酶的最適溫度（72），不能保證PCR擴增產(chǎn)物的特異性引物擴增跨度：以500bp為宜特定條件下可擴增長至10kb的片段引物堿基：G+C含量以40-60%為宜G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列避免引物內部出現(xiàn)二級結構避免兩條引物間互補， 特別是 3端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴增條帶 引物 3端的堿基要求嚴格配對 特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗 引物中有或能

27、加上合適的酶切位點被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處 引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性引物量：每條引物的濃度0.11umol或10100 pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結果為好引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會引物的解鏈溫度兩個引物之間的 Tm 值差異最好在 2-5 Tm值的定義，是兩段互補的堿基序列解鏈50%時的溫度設計引物的方法設計引物的操作流程同源性比較序列下載引物設計篩選根據(jù)所需要檢測的基因在/pubmed 查詢有關序列利用primer

28、premier 5.0等軟件進行設計和篩選PCR反應條件的選擇 溫度與時間的設置 三溫度點法 雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至40 60，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸 (標準反應) 二溫度點法 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94變性，65左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。 較短靶基因(長度為100300bp)時變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，9394 1min足以使模板DNA變性，若低于93則 需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的

29、活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導致PCR失敗。 變性溫度與時間 退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至4060，可使引物和模板發(fā)生結合。 由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。 退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長 度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點較為理想。 退火(復性)溫度與時間：引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T)復性溫度=Tm值-(510)在Tm值允許范圍

30、內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結合。 延伸溫度與時間： PCR反應的延伸溫度一般選擇在7075之間，常用溫度為72，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。 PCR延伸反應的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。34kb的靶序列需34min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選

31、在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。 循環(huán)次數(shù)RT-PCR （reverse transcription PCR）RT-PCR是以mRNA為模板反轉錄合成cDNA、再以cDNA為模板進行特異性擴增，進行RNA定性或定量分析的一種方法原理p通過合適的引物，將細胞內的RNA（一般為mRNA)逆轉錄成cDNAp然后，通過PCR技術，將痕量的cDNA擴增成大量的雙鏈DNA。p獲得的dsDNA可通過測序獲得目的基因，也可用于基因操作。熒光實時定量PCR(fluorescence Quantified real time PCR)實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applie

32、d Biosystems公司推出，由于該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。原理：所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。PCRPCR實驗操作過程實驗操作過程PCRPCR產(chǎn)物純化產(chǎn)物純化PCRPCR產(chǎn)物純化試劑盒產(chǎn)物純化試劑盒PCR產(chǎn)物電泳PCRPCR常見問題常見問題正對照有條帶，而樣品則無原因：該Buffer對樣品不合適引物設計不當或者發(fā)生降解模板:含有抑制物，含量低反應條件：

33、退火溫度太高，延伸時間太短優(yōu)化純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA更換Buffer或調整濃度重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內二級結構）或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時間非特異性擴增現(xiàn)象：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶原因：1.引物特異性差2.酶純度不高3.Mg2+濃度偏高4.退火溫度偏低5.Buffer不合適6.循環(huán)次數(shù)過多解決：1.重新設計引物或者使用巢式PCR2.換用高純度的酶3.降低鎂離子濃度4.適當提高退火溫度或使用二階段溫度法5.更換Buffer6.減少循環(huán)次數(shù) 拖尾拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)原因：1

34、.酶量過多2.模板不純3.循環(huán)次數(shù)過多4.dNTP、Mg2+濃度偏高5.退火溫度偏低6.Buffer不合適解決：1.適量用酶2.純化模板3.減少循環(huán)次數(shù)4.適當降低dNTP和鎂離子的濃度5.適當提高退火溫度6.更換Buffer假陽性假陽性現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物原因：靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染對策：1.操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外2.除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。3.各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。 第五節(jié) DNA序列的測定 DNA測序技術主要

35、有兩種方法，都是在20世紀70年代中期發(fā)明的。 A. 雙脫氧鏈終止法(Sanger dideoxy procedure ) 是通過合成與單鏈DNA互補的多核苷酸鏈來讀取待測DNA分子的順序。 B. 化學降解法（ Maxam-Gilbert procedure ），是將雙鏈DNA分子用化學試劑處理，產(chǎn)生切口，用同位素標記進行測序。Frederick Sanger一、雙脫氧法測序 (Sanger dideoxy procedure )雙脫氧法測序原理利用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止物測定DNA核苷酸順序的方法，是由英國劍橋分子生物學實驗室的生物化學家F. Sanger等人于1977年發(fā)明的?；驹恚?聚丙烯酰胺凝膠電泳可以區(qū)分長度只差一個核苷酸的DNA分子； 利用DNA聚合酶不能夠區(qū)分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP參入到寡核苷酸鏈的3-末端。因為ddNTP 3不是-OH，不能與下一個核苷酸聚合延伸，從而終止DNA鏈的增長。具體操作： 測序時分成四個反應, 每個反應除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的A, C, G, T核苷三磷酸（稱為ddATP, ddCTP,ddGT