Car-T細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程(共3頁)_第1頁
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文檔簡介

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上Car-T細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程1 目的:保證Car-T細(xì)胞制備和培養(yǎng)符合要求。2 范圍:適用于符合實驗的要求患者外周血制備和培養(yǎng)3 責(zé)任人:實驗員人、臨床相關(guān)人員。4 內(nèi)容4.1耗材:50ml離心管,10ml移液管,5ml移液管,75cm2培養(yǎng)瓶,150 cm2培養(yǎng)瓶,EP管,1.8ml凍存管4.2試劑:X-VIVO 15TM,PBS緩沖液,75%醫(yī)用酒精,人淋巴細(xì)胞分離液,CD3/CD28免疫磁珠,IL-2,注射用人血白蛋白。4.3環(huán)境:4.3.1外周血分離,培養(yǎng)應(yīng)在恒溫恒濕的萬級層流室內(nèi)進(jìn)行,開放操作必須在百級生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。4.3.2實驗人員應(yīng)提前對凈化室和生

2、物安全柜進(jìn)行殺菌消毒,紫外線照射時間不少于30min,消毒消毒后,凈化空調(diào)開啟時間不少于30min,生物安全柜運(yùn)行穩(wěn)定后方可操作。4.4操作:4.4.1采集接收外周血4.4.1.1患者符合治療方案,各項檢測符合要求,采集患者外周血60-80ml。4.4.1.2接收外周血并填寫外周血采集交接記錄,核對外周血患者相關(guān)信息,及相應(yīng)檢測報告,報告由醫(yī)院提供,至少包括:HBsAg,HCVAb,HIVAb,Anti-TP,ALT。4.4.2操作前準(zhǔn)備4.4.2.1凈化室,生物安全柜消毒完畢后,開啟凈化空調(diào)運(yùn)行30min,生物安全柜運(yùn)行穩(wěn)定。4.4.2.2從試劑間冰箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)基,恢復(fù)室溫。4.4.2.

3、3生物安全柜表面75%酒精消毒,外周血袋表面酒精消毒轉(zhuǎn)入安全柜內(nèi)。4.4.3  分離單個核細(xì)胞(PBMC):4.4.3.1使用滅菌消毒的剪刀剪斷血袋塑料管或者使用一次性注射器,把血袋內(nèi)外周血轉(zhuǎn)入50ml離心管中。4.4.3.2用PBS緩沖液按1:1稀釋外周血,混勻。4.4.3.3將稀釋好的血樣緩慢加入室溫的15ml人淋巴細(xì)胞分離液的離心管中。方法如下:用10ml移液管吸取血樣,伸至分離液液面上方0.5cm處,血樣自然滑落鋪至分離液面上,然后輕輕加入血樣,注意不要沖破液面。4.4.3.4配平離心1200g(2100r/min)離心20min,慢升慢降。4.4.3.5離心完成后,離心管出

4、現(xiàn)明顯分層由下至上:紅細(xì)胞層,粒細(xì)胞層,F(xiàn)icoll層,單個核細(xì)胞層和血漿層。吸取血漿層至距白膜層5mm左右處棄之。小心吸取紅細(xì)胞層以上的所有液體至離心管中,PBS稀釋,與細(xì)胞懸液體積比應(yīng)大于1:3,混勻。4.4.3.6離心600g(1600r/min)5min,PBS重懸細(xì)胞混勻,取少量細(xì)胞計數(shù)。4.4.3.7離心300g(1200r/min)5min,上清液送檢無菌檢測。4.4.4細(xì)胞培養(yǎng):4.4.4.1細(xì)胞培養(yǎng)條件:恒溫37,CO2濃度 5%,相對飽和濕度95%,細(xì)胞培養(yǎng)基PH值7.2-7.4。4.4.4.2根據(jù)細(xì)胞計數(shù)調(diào)密度2x106/ml加入培養(yǎng)瓶中(T150 200x106/100

5、ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml)?;靹蚍湃隒O2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時。4.4.4.3取出培養(yǎng)瓶,輕搖,使沉降于底部的懸浮細(xì)胞浮起,培養(yǎng)瓶傾斜30度角,移液管吸取培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入離心管中,少些培養(yǎng)基洗培養(yǎng)瓶將懸浮細(xì)胞全部收集,混勻計數(shù)。4.4.4.4根據(jù)細(xì)胞計數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度1.2x106/ml接種培養(yǎng)瓶中(100-120ml in a T150,50-60ml in a T75,15-29ml in a T25),加CD3/CD28磁珠,按細(xì)胞與磁珠比例為1:3(加之前磁珠用培養(yǎng)基洗滌3次,去除保存液),加入IL-2 100U/ml,混勻放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4

6、.4.4.5次日細(xì)胞培養(yǎng)1天,調(diào)整細(xì)胞密度至0.6x106/ml,加入病毒(MOI為1-5)混勻放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4.4.4.6細(xì)胞培養(yǎng)3天,細(xì)胞計數(shù)補(bǔ)加培養(yǎng)基,IL-2  100U/ml細(xì)胞密度調(diào)整至0.6x106/ml繼續(xù)培養(yǎng)。4.4.4.7細(xì)胞培養(yǎng)5天去磁珠,細(xì)胞混勻轉(zhuǎn)離心管中,在磁力架上去除磁珠,細(xì)胞計數(shù)補(bǔ)加培養(yǎng)基,IL-2  100U/ml細(xì)胞密度調(diào)整至0.6x106/ml繼續(xù)培養(yǎng)。4.4.4.8定期觀察細(xì)胞生長情況,主要觀察其形態(tài)的變化,數(shù)目及增值情況,細(xì)胞碎片及雜質(zhì)情況,每2-3天加液培養(yǎng)。4.4.4.9根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和臨床治療需要,培養(yǎng)9天時細(xì)胞數(shù)量達(dá)到要

7、求,各項檢測合格。包括:無菌檢測,內(nèi)毒素檢測,細(xì)胞活力,細(xì)胞表型等。4.4.5 Car-T細(xì)胞收集:4.4.5.1確認(rèn)細(xì)胞各項檢測己符合要求。4.4.5.2根據(jù)治療方案(一般一個療程分多次回輸,間隔時間為1天),取出相應(yīng)細(xì)胞懸液,剩余細(xì)胞補(bǔ)加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),供再次回輸。4.4.5.3細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中,300g離心5min。4.4.5.4除去上清培養(yǎng)液,加PBS緩沖液稀釋混勻,300g離心5min,棄上清,PBS緩沖液300g/min離心5min。4.4.5.5細(xì)胞裝袋(一般靜脈回輸,采用100ml雙閥鹽水袋),離心完成后取上清,做無菌檢測,20ml生理鹽水重懸細(xì)胞,100m細(xì)胞濾網(wǎng)過濾,取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量,細(xì)胞活率,革蘭氏檢測,內(nèi)毒素檢測。細(xì)胞過濾完成,轉(zhuǎn)入100ml鹽水袋中,加5%注射用人血白蛋白,貼上標(biāo)簽,并填寫相關(guān)記錄。4.5細(xì)胞運(yùn)輸與保存:4.5.1核對細(xì)胞標(biāo)簽內(nèi)容,填寫回輸發(fā)放記錄。4.5.2細(xì)胞鹽水袋放置于運(yùn)輸容器內(nèi)(一般

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