PCR-LIS-SSCP快速分析非缺失型α-地中海貧血點突變

1、    PCR-LIS-SSCP快速分析非缺失型 -地中海貧血點突變        【摘要】目的建立一種簡便快速的篩查非缺失型-地中海貧血點突變的SSCP分析方法。方法在選擇性擴(kuò)增2珠蛋白基因的基礎(chǔ)上，巢式PCR擴(kuò)增突變熱點區(qū)域，低離子強(qiáng)度(LIS)條件下將PCR產(chǎn)物熱變性，用非變性膠電泳分析其SSCP。結(jié)果LIS條件下處理樣品，PCR產(chǎn)物變性效率明顯提高，電泳結(jié)果可檢出區(qū)別于野生型對照的3種含基因突變的電泳帶型，且電泳時間僅需3小時。結(jié)論P(yáng)CR-LIS-SSCP可

2、用于快速篩查非缺失型-地中海貧血點突變。【關(guān)鍵詞】單鏈構(gòu)象多態(tài)性低離子強(qiáng)度-地中海貧血-珠蛋白基因 Rapid detection of non-deletional -thalassemia mutations by PCR-LIS-SSCPZHAO Yongzhong, XU Xiangmin*,XU Qian.*Institute of Molecular Biology, The First Military Medical University,Guangzhou 510515 P.R. China E-mail:gzxuxm【Abstract】ObjectiveTo establi

3、sh a rapid and convenient single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis method for detecting the point mutation of non-deletional -thalassemia. MethodsThe 543bp DNA fragment spanning the hot spot region mainly responsible for non-deletional -thalassemia was nested amplified using the selec

4、tive amplification of 2 globin gene as a template and was denatured with low ionic strength(LIS) solution followed by SSCP analysis.ResultsLIS buffer was more efficient for ssDNA formation than formamide buffer was and the formation of ssDNA was very stable. In addition to a normal electrophoresis p

5、attern, at least three SSCP profiles can be detected by the present method when the DNA samples bearing non-deletional genes of Hb H disease were screened. Confirmed by DNA sequencing analysis, the DNAs represented these profiles have turned out to be the different three mutants, i.e., the CS mutati

6、on, the QS mutation and the Westmead mutation, respectively. Only 3 hours were needed to complete the electrophoresis procedure of this method. ConclusionPCR-LIS-SSCP can be used as a tool in rapid screening for the alterations in human -globin gene.【Key words】Single strand conformation polymorphism

7、Low ionic strength-thalassemia-globin gene除基因缺失外，部分-地中海貧血(-地貧)是由于基因點突變或小的缺失所致，此類-地貧稱為非缺失型-地貧1。我國地貧高發(fā)區(qū)該類-地貧的分子病理基礎(chǔ)有待進(jìn)一步的研究闡明。分析非缺失型-地貧突變主要涉及到點突變分析技術(shù)。單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism, SSCP)分析是常用的點突變分析技術(shù)2，Maruya等3采用低離子強(qiáng)度(low ionic strength, LIS)上樣緩沖液處理樣品來提高單鏈產(chǎn)率和分離效果的嘗試值得注意，該項被稱為LIS-SSCP的

8、技術(shù)在HLA分型的應(yīng)用中取得了良好的效果。我們參照該方法并用于中國人非缺失型-地中海貧血點突變分析，報告如下。1材料和方法1.1樣品血紅蛋白H(hemoglobin H, Hb H)病的診斷標(biāo)準(zhǔn)按文獻(xiàn)4。確診指標(biāo)為血紅蛋白電泳出現(xiàn)HbH區(qū)帶和或有家系資料。取患者新鮮全血1ml，用200l 0.5mol/L EDTA抗凝。樣品DNA的抽提按文獻(xiàn)5的方法。1.2PCR試劑寡核苷酸引物由中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所合成。用于擴(kuò)增珠蛋白基因的引物序列如下：P1：5-TGGAGGGTGGAGACGTCCTG-3(nt 64646483)；P3：5-CCATTGTTGGCACATTCC-GGGACA-3(n

9、t 75257548)；P4：5-GGCAAGAA-GGTGGCCGAC-3(nt 69977014); P5：5-GCAC-ATTCCGGGACAGAG-3(nt 75227539)。引物的位置數(shù)據(jù)來自Genbank文件HUMHBA4.SEQ。Taq酶及緩沖液為加拿大Genda Technology公司產(chǎn)品，dNTP購自Promega公司。1.3PCR擴(kuò)增P1+P3為選擇性擴(kuò)增2珠蛋白基因的外引物，P4+P5為巢式引物。外引物擴(kuò)增時，50l反應(yīng)總體積中含gDNA0.10.5g，50mmol/L Tris-HCl (pH9.2),16mmol/L (NH4)2SO4,2.25mmol/L Mg

10、Cl2，每種引物0.25mol/L, 0.2mmol/L dNTP, 10%DMSO和Taq酶2U。內(nèi)引物反應(yīng)體系與以上相同，除模板改用按11000稀釋的1 085bp片段(外引物產(chǎn)物，取1l)外。熱循環(huán)參數(shù)：P1+P3為9610分鐘，熱啟動，951分鐘，60 1分鐘，72 3分鐘，30個循環(huán)，最后一個循環(huán)72延伸5分鐘。P4+P5則為96 10分鐘，熱啟動95 1分鐘，551分鐘，721分鐘，30循環(huán)，最后一個循環(huán)72延伸5分鐘。1.4樣品處理SS-緩沖液(含0.05%溴酚藍(lán)，0.05%二甲苯青FF，1mmol/L EDTA和95%甲酰胺溶液)用于普通SSCP，LIS-緩沖液(含0.05%溴

11、酚藍(lán)，0.01二甲苯青FF和10%蔗糖溶液)用于LIS-SSCP。取5l PCR產(chǎn)物，加10l SS-緩沖液，混勻，98置5分鐘，立即冰浴，上樣。或取1l PCR產(chǎn)物，加20l LIS-緩沖液，98置5分鐘，取5l上樣。1.5電泳分離8%聚丙烯酰胺凝膠按N，N甲叉丙烯酰胺丙烯酰胺=119或149的比例配制，凝膠大小為10.5cm×12.5cm，厚度為1mm。電泳采用0.5×TBE緩沖液；溫度15，電壓300V，電流20mA，電泳時間3小時。結(jié)果檢測采用銀染法6。2結(jié)果2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果用P1+P3選擇性擴(kuò)增2-珠蛋白基因以區(qū)分非缺失型HbH病(T/-)和缺失型HbH病DN

12、A(-3.7/-SEA和-4.2/-SEA)。前者有2-珠蛋白基因特異性擴(kuò)增產(chǎn)物(1 085bp)出現(xiàn)，而后者則為PCR陰性反應(yīng)。將上述特異性2-珠蛋白基因產(chǎn)物稀釋1 000倍，取1l稀釋物作為50l PCR反應(yīng)體系的模板，用引物P4+P5進(jìn)行巢式PCR，擴(kuò)增突變熱點區(qū)域。結(jié)果可見大小與預(yù)期的543bp片段相符的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，該P(yáng)CR產(chǎn)物用于SSCP分析(PCR結(jié)果未顯示)。2.2點突變檢測結(jié)果1的結(jié)果顯示，LIS條件下，單鏈生成率明顯高于傳統(tǒng)方法，且重現(xiàn)性好。待檢HbH病樣品經(jīng)2次擴(kuò)增的PCR片段為2-珠蛋白基因的突變熱點區(qū)，該片段在8%聚丙烯酰胺凝膠中(甲叉丙烯酰胺與丙烯酰胺之比為119

13、)進(jìn)行LIS-SSCP分析，可清楚的檢測出至少3種與野生型不同的電泳帶型(2)。示異常帶型的樣品分別經(jīng)測序確認(rèn)為CS(2，142 TAACAA)終止密碼突變、QS(2，CTGCCG，125 LeuPro)突變和2,122CAGCAC(HisGln)錯義突變(測序結(jié)果未顯示)。1低離子強(qiáng)度條件下單鏈生成效率1：543bp雙鏈PCR產(chǎn)物對照；2：甲酰胺變性處理樣品；3、4：LIS溶液變性處理樣品2非缺失型-地貧突變熱點區(qū)域的PCR-LIS-SSCP分析譜1：野生型對照；2：QS突變；35：CS突變；6：2，122 CAGCAC (HisGln)錯義突變Fig 1The efficiency of

14、ssDNA formation under conditions of denaturing samples with LIS bufferLane 1:543bp dsDNA control; DNA samples containing the 543bp DNA fragment were denatured at 98 for 5 minutes with formamide loading buffer (lane 2) or with LIS loading buffer (lanes 3,4). Electrophoresis was run on 8% gel at 15 in

15、 0.5×TBE for 3 hours.Fig 2PCR-LIS-SSCP analysis of the 543bp fragments bearing the point mutations causing -thalassemiasLane l:Wild type control; lanes 2-6: The three SSCP profiles can be detected on the gel; Confirmed by DNA sequencing analysis, the DNAs represented these profiles have turned

16、out to be the different three mutants, i.e., the QS mutation(lane 2), the CS mutation(lanes 3-5) and the Westmead mutation(lane 6), respectively (data not shown). Electrophoresis was run under the same conditions as described above (see the legend in Fig 1)3討論單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析，是依據(jù)單鏈DNA或RNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠電

17、泳體系中以構(gòu)象為基礎(chǔ)的電泳行為來鑒定DNA序列改變的一項技術(shù)2。該技術(shù)因操作簡單和適用面廣而被廣泛采用，但此法也有影響因素多而致重復(fù)性差，及突變檢出率相對低(一般約為70%80%)的缺點7。Maruya等3首先建立的用于HLA分型的PCR-LIS-SSCP，是一項通過上樣前提高單鏈生成率來改進(jìn)分離效果的分析技術(shù)。LIS變性液提高單鏈生成率的基本原理是：溶液離子強(qiáng)度降低可使核酸分子的變性溫度和復(fù)性效率降低。同時由于較常規(guī)方法使用了更多的LIS變性液處理樣品，也使待分離的PCR產(chǎn)物更加稀釋而致復(fù)性效率下降。而在甲酰胺變性條件下，變性后的單鏈DNA較易復(fù)性，因此單鏈生成效率低。我們采用LIS-SSC

18、P分析2珠蛋白基因片段的結(jié)果，顯示出單鏈生成效率較甲酰胺變性法顯著增高(1)，且電泳時間較一般方法大為縮短(從需過夜減至3小時左右)，后者克服了因長時間電泳而帶來的帶型彌散的不足，因而有助于提高分離效果及增強(qiáng)實驗的可重復(fù)性。非缺失型-地貧突變熱點區(qū)域PCR-LIS-SSCP分析結(jié)果表明，在8%聚丙烯酰胺凝膠中(甲叉丙烯酰胺與丙烯酰胺之比為119)，可清楚地檢測出至少3種與野生型不同的電泳帶型(2)，甲叉丙烯酰胺與丙烯酰胺之比為149時，則僅見2種與野生型不同的電泳帶型(CS和QS突變)，因此我們的實驗選用了119的配方。在針對不同檢測片段時，凝膠中的這一比例需根據(jù)具體情況調(diào)整。另外值得一提的是

19、在LIS條件下熱變性，樣品毋需立即轉(zhuǎn)入冰浴中，一般在室溫條件下保存45小時亦不會影響分析結(jié)果。此外，我們還采用了簡單快速的銀染方法，提高了檢測靈敏度，且無需使用同位素，使該項技術(shù)更易普及。我們已將該方法用于臨床樣品的分子篩查，期望尋找到-地貧新的突變。本課題由國家自然科學(xué)基金(39770799)、廣東省自然科學(xué)基金(950572)和國家計生委科研項目基金資助*為課題負(fù)責(zé)人和通信聯(lián)系人作者單位：510515 廣州，第一軍醫(yī)大學(xué)分子生物學(xué)研究所參考文獻(xiàn)1Higgs DR, Vickers MA, Wilkie AOM, et al. A review of the molecular genetics of the human -globin gene cluster. Blood, 1989, 73(5)1081-1104.2Orita M, Lwahana H, Kanazawa H, et al. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphis