自體CIK細(xì)胞免疫療法治療中晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床研究

1、自體CIK細(xì)胞免疫療法治療中晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床研究作者：魏彪， 蔣文軍, 唐小蘭 作者單位：1.宜賓市第二人民醫(yī)院腫瘤科，四川 宜賓 644000; 2.四川省腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，成都 610041【摘要】 目的 觀察自體CIK細(xì)胞過(guò)繼性免疫療法對(duì)中晚期非小細(xì)胞肺癌患者的臨床療效。 方法 體外利用抗CD3單抗、IL2、IFN等細(xì)胞因子從患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中誘導(dǎo)擴(kuò)增CIK細(xì)胞,培養(yǎng)1114 d后，分3個(gè)療程回輸患者體內(nèi)，觀察患者臨床癥狀改善及生活質(zhì)量改善狀況，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)回輸前后患者T細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞變化。 結(jié)果 86例接受自體CIK細(xì)胞治療患者中,PR+MR為72例,總緩解

2、率為83.72%。治療前、后腫瘤患者臨床癥狀有明顯改善,有顯著性差異(P<0.01)。CIK細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)和CD3、CD56 T效應(yīng)細(xì)胞均獲得大量增殖,自體回輸免疫治療后,CD3、CD4 T細(xì)胞和NK細(xì)胞比例均顯著提高(P<0.01)。 結(jié)論 從中晚期非小細(xì)胞肺癌患者外周血PBMC中可高效擴(kuò)增CIK細(xì)胞，自體回輸能顯著提高患者免疫功能，改善臨床癥狀,提高生存質(zhì)量,延長(zhǎng)患者生存期?！娟P(guān)鍵詞】 CIK細(xì)胞; 過(guò)繼免疫治療; 非小細(xì)胞肺癌The Clinical Study on the Therapeutics of Cytokineinduced Killer Cells on

3、 the Patients with Advanced Nonsmallcell Lung CancerWEI Biao1, JIANG Wenjun2, TANG Xiaolan2(1.The Second Peoples Hospital of Yibin, Sichuan Yibin 644000; 2.Cancer Hospital of Sichuan Province, Chengdu 610041, China)【Abstract】 Objective To observe the therapy effect of cytokineinduced killer (CIK) in

4、 PBMC of patients with advanced nonsmallcell lung cancer. Methods CIK cells were induced and amplified from PBMC of 68 NSCLC patients by in vitro incubation with IL2，IFN，antiCD3 monoclonal antibody for 1114 days and then transfused back to patients. The changes of T cell and NK cell of patients befo

5、re and after CIK cell treatment with FCM were tested. Results After 1114 days culture, the total number of CIK cells and CD3+，CD56+ T cells expanded greatly. After being treated with CIK cells, the numbers of CD3，CD4 T cell and NK cells of patients increased significantly (P<0.01). The clinical s

6、ymptoms of 86 patients were improved clearly. Conclusion CIK cells may be expanded effectively from patients with advanced NSCLC. The adoptive immunotherapy of autoimmunity of CIK cells can significantly enhance cellular immune function and improve the clinical symptom of patients.【Key words】 cytoki

7、neinduced killer cells; adoptive immunotherapy; nonsmallcell lung cancerCIK細(xì)胞(cytokineinduced killer cell)是目前所知?dú)钚暂^強(qiáng)的腫瘤生物治療效應(yīng)細(xì)胞，其主要表達(dá)T細(xì)胞標(biāo)記的CD3細(xì)胞和表達(dá)NK標(biāo)記的CD56細(xì)胞。正常情況下，人體CD3、CD56表型的細(xì)胞僅占外周血細(xì)胞的1%5%，腫瘤患者其T細(xì)胞功能則更低。自體CIK細(xì)胞免疫療法就是從人體外周血中分離CD3、CD56以及CD4、CD8等細(xì)胞，在體外大量擴(kuò)增后再回輸?shù)襟w內(nèi)，以迅速提高機(jī)體T細(xì)胞免疫功能1。國(guó)內(nèi)外已有研究表明，大量輸注CIK細(xì)

8、胞的作用能提高乳腺癌等惡性腫瘤患者自身免疫細(xì)胞功能，清除手術(shù)、放、化療后體內(nèi)殘留的腫瘤細(xì)胞及微小轉(zhuǎn)移病灶，從而延緩或減少?gòu)?fù)發(fā)，提高腫瘤的治愈率和生存率。作者從2003年至2007年對(duì)86例中晚期非小細(xì)胞肺癌患者采用自體CIK細(xì)胞免疫療法進(jìn)行了過(guò)繼性免疫治療，并對(duì)其臨床療效進(jìn)行了觀察，現(xiàn)報(bào)告如下。1 對(duì)象與方法1.1 研究對(duì)象病例來(lái)源于宜賓市第二人民醫(yī)院、四川省腫瘤醫(yī)院、四川省人民醫(yī)院以及成都陸軍總醫(yī)院收治的晚期非小細(xì)胞肺癌患者共86例，均經(jīng)臨床及病理學(xué)檢測(cè)為中晚期惡性腫瘤，患者年齡最小37歲，最大74歲，平均年齡52.6歲。1.2 研究方法 CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增與檢測(cè) 患者常規(guī)治療結(jié)束或間隙期1

9、0 d左右,靜脈采血約50 ml，肝素抗凝,Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(11)分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),生理鹽水洗滌3次，用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%人AB 血清),調(diào)節(jié)密度為2×106/mL,第0 d加入2000 U/mL重組IFN約8萬(wàn)單位,36.5,5% CO2孵箱培養(yǎng)24 h, 第2 d，加入IL2(終濃度為1000 U/mL)以及5 g/mL抗CD3單抗。每3天離心換培養(yǎng)液一次(第4、7、10、13 d)，同時(shí)補(bǔ)加IL2 100 U/mL，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法記數(shù)PBMC,流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3、CD4、CD8、NK細(xì)胞中的CD16和CD57等免疫學(xué)指標(biāo)。 自體CIK細(xì)胞

10、過(guò)繼性免疫治療 于培養(yǎng)兩周左右時(shí)間開(kāi)始收集CIK細(xì)胞,生理鹽水洗滌3次,加入5%人血白蛋白、1 000 U/ml IL2,用生理鹽水配成250ml后靜脈回輸,隔天回輸1次,每次回輸約109個(gè)細(xì)胞，每療程3次, 回輸前均經(jīng)無(wú)菌檢測(cè)，達(dá)到質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)后方可回輸。 臨床相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) 治療前及治療2周后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者外周血CD3、CD4、CD8及CD16、CD56，治療前后檢測(cè)患者體溫、血壓、肝腎功能等指標(biāo)。 毒副反應(yīng)觀察 密切觀察患者接受免疫治療后是否出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹、失眠、乏力、食欲不振等毒副反應(yīng)，根據(jù)病情予以處理。 統(tǒng)計(jì)方法 所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)

11、采用t檢驗(yàn)。2 結(jié)果2.1 CIK細(xì)胞擴(kuò)增與表型檢測(cè)CIK細(xì)胞于培養(yǎng)第4 d開(kāi)始快速增殖,至13 d細(xì)胞增殖為1.0×1095.0×109，平均增殖100倍，CD3+、CD56+ T細(xì)胞比例由1.8%左右上升為約25%.2.2 治療前后的T細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞變化經(jīng)自體CIK細(xì)胞免疫治療13個(gè)療程的患者，其外周血中CD3、CD4 T細(xì)胞和NK細(xì)胞(CD16、CD56)均顯著上升(P<0.05),見(jiàn)表1.2.3 臨床觀察情況CIK細(xì)胞回輸后,部分患者的睡眠、食欲、體力均有所改善者, 按臨床癥狀積分值下降2/3為顯著改善,積分下降1/3為部分改善,積分下降<1/3為無(wú)

12、改善,結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)對(duì)患者行CT及B超等常規(guī)檢查，參照實(shí)體瘤療效標(biāo)準(zhǔn)，以完全緩解(CR)0，部分緩解(PR)27,輕度緩解(MR)45,穩(wěn)定(SD)12,進(jìn)展(PD)2進(jìn)行療效評(píng)定,總緩解率(CR+PR+MR)為83.72%.表1 患者接受CIK細(xì)胞免疫治療前后外周血免疫學(xué)指標(biāo)變化表2 86例患者CIK免疫治療前后患者臨床癥狀改善分析2.4 毒副反應(yīng)觀察極少數(shù)患者(4例)細(xì)胞回輸后出現(xiàn)體溫升高(38.239.5)，經(jīng)抗生素治療處理后癥狀消失，8例患者出現(xiàn)輕度皮疹、乏力等癥狀，原因未明，大多數(shù)患者無(wú)不良反應(yīng)。3 討論過(guò)繼性免疫治療是對(duì)腫瘤患者進(jìn)行輔助治療的重要手段,已在臨床上得到較多的應(yīng)用，如

13、TIL、CD3AK等細(xì)胞療法，但大都存在著體外增殖倍數(shù)不夠、毒副作用大等缺點(diǎn)，臨床應(yīng)用受到了限制 2。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK),是人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子刺激后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，與LAK和TIL、CD3AK等細(xì)胞相比，具有增殖速度快、殺瘤活性高、對(duì)正常骨髓造血毒性小等優(yōu)勢(shì)3，4。CIK細(xì)胞是Schmidt等于1991年率先發(fā)現(xiàn)的，該細(xì)胞共同表達(dá)了CD3和CD56兩種膜蛋白分子，是目前所知?dú)钚宰顝?qiáng)的一種腫瘤生物治療效應(yīng)細(xì)胞5，研究認(rèn)為CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用是通過(guò)釋放顆粒酶、穿孔素而裂解靶細(xì)胞，對(duì)靶細(xì)胞的裂解是CIK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的主要機(jī)制，也有學(xué)者認(rèn)為進(jìn)入體內(nèi)活化

14、的CIK細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子如干擾素、腫瘤壞死因子和白介素2等,不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接抑制作用，而且還可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)間接殺傷瘤細(xì)胞6，7。但腫瘤患者由于免疫功能受到極大損害，其外周血中CIK細(xì)胞極低(遠(yuǎn)低于正常人的1%5%)，必須通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)方法在體外大量擴(kuò)增，達(dá)到一定的數(shù)量級(jí)后方可回輸。常用的CIK細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增方法較多，其細(xì)胞增殖時(shí)間及倍數(shù)都有差異，我們采用的CD3單抗、IL2、IFN等細(xì)胞因子培養(yǎng)方法，經(jīng)過(guò)兩周左右的時(shí)間培養(yǎng)傳代，細(xì)胞數(shù)量基本能達(dá)到1×109以上。T細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞活性是反映腫瘤患者免疫功能的重要指標(biāo)，通過(guò)對(duì)比患者接受自體CIK細(xì)胞免疫治療前后，其T細(xì)

15、胞亞群和NK細(xì)胞比例的變化,能發(fā)現(xiàn)患者免疫功能改善8。我們對(duì)86例非小細(xì)胞肺癌患者，采用流式細(xì)胞儀方法檢測(cè)，結(jié)果顯示該療法可以明顯提高CD3T細(xì)胞和NK細(xì)胞(CD16、CD56)的比例(P<0.01)，緩解、提高CD4/CD8比率,增強(qiáng)患者的細(xì)胞免疫功能，這對(duì)于腫瘤患者及其低下的免疫功能具有具有重要意義。在改善患者臨床癥狀方面，86例 NSCLC患者經(jīng)13個(gè)療程的CIK細(xì)胞免疫治療后，總緩解率達(dá)83.72%(72/86)，見(jiàn)表2。多數(shù)患者臨床癥狀如倦怠乏力、失眠、食欲不振等均有明顯改善，見(jiàn)表3。在毒副反應(yīng)方面大多數(shù)患者無(wú)不良反應(yīng)，僅極少數(shù)(4例)出現(xiàn)不同程度的發(fā)熱，經(jīng)處理后癥狀都消失。作

16、者采用自體CIK細(xì)胞過(guò)繼性免疫療法治療86例中晚期非小細(xì)胞肺癌患者，結(jié)果表明大多數(shù)患者臨床療效較好，毒副反應(yīng)輕微，患者臨床癥狀得以改善，生活質(zhì)量明顯提高，可在一定程度上減緩NSCLC的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，但該療法的遠(yuǎn)期療效及其對(duì)腫瘤患者生存期的影響，仍需長(zhǎng)期跟蹤隨訪，進(jìn)一步深入研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1Marten A,Renoth S,Von Lilienfeld2toal M, et al. Enhanced Iytic Activity of Cytokineinduced Killer Cells Against Multiplemyeloma Cells after Coculture with

17、Idiotypepulsed Dendritic CellsJ. Haematologica, 2001,86(10):1 0291 037.2Hoffmant DM, Gitlitz BJ, Belldegrun A, et al. Adoptive Cellular TherapyJ. Semin Oncol,2000,27(2):221233.3Fu SW, Ming XL, Bing Z, et al. Antitumor Activities of Human Autologous Cytokineinduced Killer Cells Against Hepatocellular

18、 Carcinoma cells in Vitro and in VivoJ. World J Gastroenterol，2002,8(3):464468.4Maki G. Exvivo Purging of Stem Cell Autografts Using Cytotoxic CellsJ. Hematother Stem Cell Res，2001,10:545551.5SchmidtWolf IG, Lefterova P, Johnston V, et al. Sensitivity of Multidrugresistant Tumor Cell Iines to Immunologic Effector CellsJ. Cell Immunol，1996,169:8590.6Finke S, Trojaneck B, Lefterova P, et al. Increase of P