超濾法提取大蒜超氧化物歧化酶的工藝研究

1、超濾法提取大蒜超氧化物歧化酶的工藝研究王晶冰1,劉建國(guó)1,崔占峰2(1.中國(guó)石油大學(xué)生物工程與技術(shù)中心,山東青島266555;2.英國(guó)牛津大學(xué)組織工程與生物工程中心,牛津英國(guó)摘要:在熱處理除去部分雜蛋白的基礎(chǔ)上,利用相對(duì)分子質(zhì)量為5×104的聚醚砜膜對(duì)大蒜超氧化物歧化酶(S OD 進(jìn)行了分離和純化,考察了蛋白質(zhì)溶液性質(zhì)(pH 、離子強(qiáng)度和溶液流體力學(xué)性質(zhì)(流速、攪拌速率對(duì)S OD 透過(guò)率的影響。在最優(yōu)分離條件下,S OD 純度可高達(dá)9016%,比活性為712149U/mg 。關(guān)鍵詞:超濾;蛋白分離;超氧化物歧化酶;大蒜中圖分類號(hào):T Q028153文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0253-

2、4320(2009S1-0320-03Isolation and puri fication of superoxide dismutase from garlic with ultrafiltrationWANG Jing 2bing 1,LIU Jian 2guo 1,CUI Zhan 2feng 2(1.Center for Bioengineering and Biotechnology ,China University of Petroleum ,Qingdao 266555,China ;2.Department of Engineering Science ,Universit

3、y of Ox ford ,Ox ford OX 13P J ,UK Abstract :The separation and purification of superoxide dismutase (S OD from garlic is studied with ultrafiltration using 50kDa polyethersulfone membrane.The effects of s olution pH and ionic strength on the transmission of S OD and the im purity protein (closer m

4、olecular weight to S OD are quantified using the pulsed sam ple injection technique.Other effects including stirring speed and permeate flux on separation of S OD are als o studied using parameter scanning ultrafiltration.Under the optimized conditions ,the purity of S OD obtained can reach higher t

5、han 9016%with an activity of 712149U/mg.K ey w ords :ultrafiltration ;protein fractionation ;superoxide dismutase ;garlic收稿日期:2009-07-19作者簡(jiǎn)介:王晶冰(1981-,女,博士生;劉建國(guó)(1962-,男,博士,教授,主要研究領(lǐng)域?yàn)樯锛庸ぜ敖M織工程,通訊聯(lián)系人,0532-*,超氧化物歧化酶(S OD 是一種能夠催化超氧負(fù)離子發(fā)生歧化反應(yīng)的金屬酶1,也是生物體抵御活性氧毒害作用的第一道防線,具有抗輻射、抗衰老、消炎、抑制腫瘤和癌癥等功能,在保健品、醫(yī)藥、化妝品等行

6、業(yè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值2。目前所用的S OD 大部分都是從動(dòng)物血液中提取的,由于成本和動(dòng)物免疫等方面的原因,人們轉(zhuǎn)而研究如何從植物中提取S OD 。大蒜是目前已知的S OD 含量較高的植物之一,從中分離提取S OD 具有較高的研究?jī)r(jià)值。從大蒜中提取超氧化物歧化酶(S OD 多采用分步鹽析法3、有機(jī)溶劑沉淀法4等傳統(tǒng)分離技術(shù)。超濾作為一種新型生化分離技術(shù),具有操作條件溫和,無(wú)相變,無(wú)需添加化學(xué)試劑,且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制,節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn)5,已廣泛應(yīng)用于各種生物大分子的濃縮、分離和純化。本論文在熱處理的基礎(chǔ)上獲得大蒜S OD 粗酶液,利用載相超濾技術(shù)和參數(shù)掃描超濾技術(shù)系統(tǒng)考察了膜分離工藝參數(shù)對(duì)S O

7、D 透過(guò)率的影響,實(shí)現(xiàn)了超濾分離大蒜S OD 過(guò)程。1實(shí)驗(yàn)部分111粗酶液制備挑選無(wú)霉斑無(wú)黃褐斑點(diǎn)的去皮大蒜,稱重后加入2倍質(zhì)量的磷酸鹽緩沖溶液,利用組織搗碎機(jī)(IK A ,8010S 搗碎1min ,將溶液在60下恒溫加熱20min ,使熱不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)變性,以沉淀形式析出;將上述溶液在4、10000r/min 下離心15min ,棄去沉淀,上清液即為大蒜S OD 粗酶液。112超濾提取工藝優(yōu)化利用載相超濾技術(shù)和參數(shù)掃描超濾技術(shù)6,對(duì)大蒜S OD 膜分離過(guò)程的工藝參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)所用的超濾膜為Millipore 公司銷售的相對(duì)分子質(zhì)023Sep.2009現(xiàn)代化工第29卷增刊(1M od

8、ern Chemical Industry 2009年9月量為5×104的聚醚砜膜,實(shí)驗(yàn)裝置和實(shí)驗(yàn)過(guò)程參見(jiàn)文獻(xiàn)7。用作對(duì)比的傳統(tǒng)分離方法選用硫酸銨沉淀法3。113蛋白質(zhì)分析使用快速蛋白液相系統(tǒng)(FP LC對(duì)S OD粗酶液、膜分離過(guò)程的濾出液和截留液的組成進(jìn)行凝膠色譜分析(Superose610/300G L。采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定S OD活性8,1單位的S OD活性定義為抑制鄰苯三酚氧化速率到50%的酶的量;利用紫外光吸收法測(cè)定溶液總蛋白質(zhì)含量9;采用凝膠色譜法確定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量。2結(jié)果與討論211工藝優(yōu)化如圖1(a所示,粗酶液中主要含有6種蛋白質(zhì),通過(guò)硫酸銨沉淀法確定目標(biāo)蛋白質(zhì)為

9、截留體積為17171m L左右的峰,如圖1(b所示,記為S OD,選取相對(duì)分子質(zhì)量與S OD最接近、且含量對(duì)S OD純度影響大的雜蛋白(記為IPA作為參比對(duì)象,考察分離條件對(duì)S OD和IPA透過(guò)率的影響。透過(guò)率(S a定義為蛋白質(zhì)在濾出液中的濃度(C p和其在原料液中的濃度(C b之比,即S a=C p/C b。21111pH當(dāng)粗酶液pH高于815或者低于415時(shí)即產(chǎn)生沉淀,因此選擇pH=510810作為遴選范圍。每隔015個(gè)pH單位測(cè)定該條件下S OD和IPA的透過(guò)率 。(a 粗酶液(b鹽析法提取S OD樣品圖1凝膠色譜譜圖比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,緩沖溶液的pH對(duì)S OD的表觀透過(guò)率有較大影響。當(dāng)

10、pH由510增至810,S OD的表觀透過(guò)率先增大,在pH610時(shí)達(dá)到最大值,然后到pH 615的過(guò)程中降低,在pH710時(shí)出現(xiàn)第二個(gè)極大值。S OD的最大透過(guò)率出現(xiàn)在pH610附近(約6114%,最小透過(guò)率出現(xiàn)在pH715左右(約2190%。IPA 在pH510715的透過(guò)率與S OD趨勢(shì)相同,在pH 810處獲得最大值。因此這個(gè)過(guò)程的最大選擇性(=S a_S OD/S a_IPA發(fā)生在pH810。表1不同分離條件下SOD和IPA的透過(guò)率21112離子強(qiáng)度鹽濃度能改變蛋白質(zhì)分子間的靜電引力,是影響蛋白質(zhì)選擇性透過(guò)超濾膜的主要因素之一。分別在溶液中在存在0、50、100、150、200mm o

11、l/L NaCl條件下測(cè)定S OD和IPA的透過(guò)率。在鹽濃度達(dá)到200 mm ol/L之前,S OD的透過(guò)率隨鹽濃度的升高而增大。隨著NaCl濃度繼續(xù)增大,S OD透過(guò)率略有下降。當(dāng)NaCl濃度從0mm ol/L增加到50mm ol/L時(shí),IPA的透過(guò)率逐漸下降,這可能與IPA的結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。當(dāng)鹽濃度從50mm ol/L增至200mm ol/L時(shí), IPA透過(guò)率的變化趨勢(shì)與S OD相似。因此,不加Na2 Cl適合S OD的分離和提純。21113流速分別在1313、2615、3918、5311L/(m2h的載相流速下分離粗酶液,綜合透過(guò)率差異、分離效率和體系壓力帶來(lái)的膜污染等因素,當(dāng)流速?gòu)?31

12、31232009年9月王晶冰等:超濾法提取大蒜超氧化物歧化酶的工藝研究L/(m 2h 增至5311L/(m 2h 時(shí),S OD 和IPA 的透過(guò)率迅速降低。另外,跨膜壓隨流速增加而增強(qiáng),膜污染也更嚴(yán)重。因此,流速為2615L/(m 2h 時(shí)適合S OD 的分離和提純。21114攪拌速率超濾時(shí)攪拌速率對(duì)蛋白質(zhì)的分離有很大影響,因?yàn)樗苡绊懙鞍踪|(zhì)的濃差極化和質(zhì)量傳遞系數(shù)。分別在0、300、600、900、1000、1200r/min 轉(zhuǎn)速下分離粗酶液,當(dāng)攪拌速率從0r/min 增至1200r/min 時(shí),S OD 和IPA 的透過(guò)率都降低,在1500r/min 時(shí),S OD 的透過(guò)率比1200r/

13、min 時(shí)的大,而IPA 的透過(guò)率比1200r/min 時(shí)的小。綜合考慮各影響因素,在1200r/min 下具有較好的綜合分離效應(yīng)。212蛋白質(zhì)分析在最優(yōu)操作條件下超濾4h 獲得的大蒜S OD 的凝膠色譜譜圖如圖2所示,絕大多數(shù)IPA 已被去除。結(jié)合電泳染色結(jié)果,可確定該S OD 比市售的標(biāo)準(zhǔn)S OD (牛血清S OD 和山葵S OD ,Sigma 略小,亞基相對(duì)分子質(zhì)量為 1315×103,相對(duì)分子質(zhì)量為 27×103。圖2大蒜S OD 凝膠色譜譜圖:牛血清S OD ;:山葵S OD ;:大蒜S OD圖3電泳染色結(jié)果表2顯示了使用超濾法提取所獲的S OD 與硫酸銨沉淀法所

14、獲產(chǎn)品的性質(zhì)差異,超濾法提取的S OD 活性較傳統(tǒng)法略高,但S OD 的純度、回收率和純化倍數(shù)均較硫酸銨沉淀法提取的S OD 有很大提高。表2不同方法提取的SOD 性質(zhì)比較方法比活性/U mg -1純化倍數(shù)產(chǎn)品回收率/%純度/%71214910132891749016注:分離條件:相對(duì)分子質(zhì)量為5×104的聚醚砜膜,pH 810,無(wú)NaCl ,載相流速2615L/(m 2h ,攪拌速率1200r/m in 。3結(jié)語(yǔ)利用相對(duì)分子質(zhì)量為5×104的聚醚砜膜超濾分離大蒜S OD ,步驟簡(jiǎn)單,成本低廉,操作條件溫和,分離過(guò)程無(wú)化學(xué)添加,不產(chǎn)生化學(xué)污染,易于批量生產(chǎn),具有良好的應(yīng)用前

15、景。使用載相超濾分離大蒜S OD 的最佳條件為:pH 810,溶液中無(wú)NaCl ,載相流速2615L/(m 2h ,攪拌速率1200r/min 。在此條件下,S OD 純度可達(dá)9016%,活性為712149U/mg 。參考文獻(xiàn)1M cC ord J M ,Fridovich I.Superoxide dismutase :An enzymatic functionfor erythrocuprein (hem ocuprein J .J Biol Chem ,1969,244:6049-6055.2Reddi A R ,Jensen L T ,Naranuntarat A ,et al .Th

16、e overlapping roles ofmananese and Cu/Zn S OD in oxidative stress protection J .Free Rad Biol M ed ,2009,46:154-162.3孫永君.大蒜中S OD 的提取研究J .化學(xué)與生物工程,2005(10:23-25.4He N ,Li Q B ,Sun D H ,et al .Is olation ,purification and charactevizationof superoxide dismutase from garlic J .Biochem Eng J ,2008,38:33-38.5G hosh R.Protein bioseparation using ultrafiltrationC.Canada :Im perialC ollege Press ,2005:15-16.6G hosh R.Fractionation of biological macrom olecules using carrier phaseultrafiltrationJ .Biotechnol Bioen ,2001,74(1:1-11.7Liu J G,Lu J R ,Zhao X B ,et al .Separation of glucose