結(jié)核分支桿菌利福平藥物敏感性的直接快速檢測

1、    結(jié)核分支桿菌利福平藥物敏感性的直接快速檢測        【摘要】目的探討利用分子生物學方法直接快速檢測臨床標本結(jié)核分支桿菌利福平（RFP）藥物敏感性的可行性。方法自行設(shè)計針對rpoB基因特異擴增的引物（擴增產(chǎn)物為183 bp片段），運用聚合酶鏈反應-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）銀染色法，檢測45株結(jié)核分支桿菌臨床分離株，對其中部分菌株進行rpoB基因DNA序列分析；運用PCR-SSCP銀染色法對70份結(jié)核病患者痰標本進行直接快速檢測，并與藥敏試驗結(jié)果做對照分析

2、。結(jié)果45株臨床分離株中16株RFP敏感結(jié)核分支桿菌SSCP帶譜與結(jié)核分支桿菌標準株（H37Rv）相同，29株RFP耐藥株中有26株檢測到突變譜，陽性率為90。從具有SSCP特征性帶譜的菌株中篩選8株臨床分離株進行rpoB基因序列分析顯示：1株RFP敏感株無rpoB基因突變，7株耐藥株均發(fā)生堿基突變（符合率100）。堿基以單點突變?yōu)橹?，?31位堿基突變最為多見4株531位TCGTTG，SerLeu（57）；1株531位TCGCAG，SerGln（14）；2株526位CACTAC，HisTyr（29）。與BACTEC對照臨床痰標本直接快速檢測陽性率為64。結(jié)論結(jié)核分支桿菌耐RFP是其rpoB基

3、因突變所致。PCR-SSCP銀染色法可用于臨床標本中結(jié)核分支桿菌RFP藥物敏感性的直接快速檢測。rpoB基因序列分析不僅證實了rpoB基因突變以531位及526位密碼子的點突變?yōu)橹?，還進一步證實了PCR-SSCP銀染色法的準確性?！娟P(guān)鍵詞】分支桿菌，結(jié)核利福平藥物耐受性聚合酶鏈反應多態(tài)現(xiàn)象，單鏈構(gòu)象序列分析 Direct, rapid detection for rifampin susceptibility to M. tuberculosisYU Ying?, KANG Xixiong, JIN Ling, et al. ?Chang chun Worker's Medical C

4、ollege, Changchun 130051【Abstract】ObjectiveTo evaluate the use of molecular biotechnology for direct, rapid detection of rifampicin-resistance mutations in M.tuberculosis. Methods45 M.tuberculosis clinical isolates and 70 sputum samples were tested by polymerase chain reaction-single stranded confor

5、mation polymorphism （PCR-SSCP） technique. M.tuberculosis strain H37Rv was used as control and compared with the result of susceptibility test.DNA sequencing was also performed in some of the strains. ResultsAll tested susceptible isolates displayed identical SSCP patterns. Of 29 RFP resistance strai

6、ns, 26(90%) had distinct mobility shifts that can be discriminated from susceptible isolates. 9 sputum samples which were successfully evaluated by PCR-SSCP showed concordant result acquired from BACTEC 460 method.As the result of DNA sequencing,it was observed that seven RFP-resistance phenotype of

7、 M. tuberculosis strains had missense mutation,in which 5 isolates displayed TCGTTG or CAG mutations at codon 531,2 had CAC TAC mutation at codon 526. On the other hand, one strain which was susceptible to rifampin exhibited identical nucleotide alignment to the sequence of rpoB gene. ConclusionsPCR

8、-SSCP could be used as a method for simple,rapid,and reliable detection of rifampicin-resistance mutations in clinical samples of M.tuberculosis.【Key words】Mycobacterium tuberculosisRifampinDrug tolerencePolymerase chain reactionPolymorphism, single strand conformationSequence analysis結(jié)核分支桿菌對抗結(jié)核藥物產(chǎn)生

9、耐受性，給結(jié)核病的防治工作帶來威脅。對結(jié)核分支桿菌耐藥分子機制的研究及對結(jié)核分支桿菌藥物敏感性的早期快速診斷，是結(jié)核病防治工作的重要課題。近年來國內(nèi)外學者對結(jié)核分支桿菌耐利福平(RFP)的分子機制的研究1-6,10,11表明，結(jié)核分支桿菌耐RFP是由于RFP靶分子RNA多聚酶亞單位的編碼基因（rpoB）突變所致，且突變集中于rpoB基因508533位的76個氨基酸（78 bp）7組成的區(qū)域內(nèi)，以531位絲氨酸替代最為常見。我們采用聚合酶鏈反應-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)銀染色法對45株結(jié)核分支桿菌臨床分離株進行rpoB基因突變的檢測，并通過DNA測序法對其中部分菌株進行rpoB基因序列

10、分析，旨在證明PCR-SSCP銀染色法的準確性。同時采用PCR-SSCP銀染色法對70份結(jié)核病患者痰標本進行直接快速檢測，對PCR-SSCP銀染法的臨床應用進行評估。材料與方法一、材料結(jié)核分支桿菌標準株及45株結(jié)核分支桿菌臨床分離株獲自北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所。痰標本為1997年11月1998年4月間在長春市結(jié)核病院住院的70例肺結(jié)核患者痰標本。二、方法1.細菌DNA的制備：臨床分離菌株采用酚-氯仿提抽法提取DNA，置-20保存?zhèn)溆?。臨床痰標本的處理：40 g/L NaOH消化離心。沉渣經(jīng)PBS沖冼，加裂解液，混勻，55孵育1小時，965分鐘，16 000 rmin離心5分鐘，取上清備用。2

11、.PCR擴增：根據(jù)文獻8提供的序列資料，借助計算機輔助自行設(shè)計rpoB基因183bp片段（該片段包括了易發(fā)生耐藥突變的78bp）擴增引物。上引物：5-AAGGAGTTCTTCGGCACCAG-3，下引物：5-GGTTTCGATCGGGCACATCC-3。PCR反應體系50 l包括：每個引物2.0 l，10 mmolL Tris HCl（pH 8.0），2.5 mmolL MgCl2，體積分數(shù)為0.10的丙三醇，dNTPs各2.5 mmolL，模板DNA 2.0 l，1.0 U的Taq DNA聚合酶。擴增反應共30個循環(huán)。3.SSCP分析：取擴增產(chǎn)物10 l置于80 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠中

12、電泳。1 g/L硝酸銀染色，觀察結(jié)果并攝像。4.DNA序列檢測分析：在大連寶生物公司進行計算機識讀結(jié)果。結(jié)果一、臨床分離株P(guān)CR-SSCP結(jié)果45株臨床分離株均獲得183 bp擴增片段，說明擴增成功。以結(jié)核分支桿菌標準株H37Rv為對照，45株結(jié)核分支桿菌臨床分離株中16株RFP敏感株SSCP帶譜均與對照相同，29株RFP耐藥株中有3株帶譜與對照相同，另26株其SSCP帶譜與對照有不同程度的差異。與藥敏試驗結(jié)果對照陽性率90，特異性100。二、DNA測序結(jié)果在45株臨床分離株中選取8株，對其rpoB基因183 bp PCR擴增產(chǎn)物進行DNA序列測定分析，結(jié)果顯示：5株耐RFP菌株堿基531位存

13、在點突變；2株耐RFP菌株堿基526位有點突變；1株RFP敏感株堿基序列無改變。詳見表1。表18株結(jié)核分支桿菌臨床分離株rpoB基因測序分析結(jié)果菌株RFP耐藥表型PCR-DNA測序分析株數(shù)密碼子*突變位點堿基置換氨基酸置換敏感1耐藥531位TCGTTGSerLeu4TCGCAGSerGln1526位CACTACHisTyr2注：*號碼與大腸桿菌rpoB基因位點相符三、臨床痰標本PCR與BACTEC培養(yǎng)結(jié)果對70份臨床痰標本的rpoB基因進行PCR擴增，結(jié)果有11份臨床標本PCR擴增陽性。對該70份臨床標本進行BACTEC460培養(yǎng)，結(jié)果顯示14例呈陽性，PCR與BACTEC460對照結(jié)果詳見表

14、2。 表2臨床痰標本的rpoB基因PCR與BACTEC460培養(yǎng)結(jié)果BACTEC460培養(yǎng)PCR擴增合計+-+9514-25456合計115970四、臨床痰標本BACTEC460藥敏試驗與SSCP分析結(jié)果14份BACTEC460培養(yǎng)陽性的臨床痰標本，對其進行RFP藥物敏感性試驗結(jié)果顯示，其中10份標本對RFP敏感。4份標本耐RFP。對該14份臨床標本進行SSCP分析結(jié)果顯示：5份標本呈現(xiàn)敏感型帶 表3PCR-SSCP對14份BACTEC460培陽痰標本的評估PCR-SSCPBACTEC培陽合計RFP敏感RFP耐藥陽性敏感型帶譜505耐藥型帶譜044陰性505合計10414*注：*經(jīng)BACTEC

15、種鑒定程序初定為結(jié)核分支桿菌譜，4份標本獲得差異型帶譜，陽性檢出率64%。詳見表3。 討論抗結(jié)核藥物RFP作用機制是，與RNA聚合酶亞單位結(jié)合進而影響轉(zhuǎn)錄過程。關(guān)鍵位點氨基酸改變可以導致RNA聚合酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而失去與RFP結(jié)合的位點，導致結(jié)核分支桿菌耐RFP。目前對結(jié)核分支桿菌編碼RNA聚合酶亞單位基因rpoB的研究證實，RFP耐藥株rpoB基因發(fā)生特定位點突變或基因缺失，突變集中在編碼508533位的26個氨基酸（78 bp）區(qū)域內(nèi)，并以531位突變最為常見，突變頻率為51.5。其次是526位，突變頻率為281。國內(nèi)外對結(jié)核分支桿菌耐RFP基因突變檢測的研究中，以PCR-SSCP方法報道居

16、多，此方法具有技術(shù)條件較為成熟、簡單、快捷、準確及檢出率高的特點。Telenti等9將此法與測序相對照，結(jié)果符合率達100。我們應用PCR-SSCP銀染色法，對45株結(jié)核分支桿菌臨床分離株進行耐藥性評估，與藥敏試驗結(jié)果對照檢出陽性率達90，與文獻報道相符。我們對有PCR-SSCP特征性帶譜的臨床分離株進行rpoB基因測序分析，結(jié)果顯示7例具有SSCP耐藥型帶譜的rpoB基因均有堿基突變，而敏感株無基因突變（符合率100），由此進一步證明了PCR-SSCP方法用于rpoB基因突變鑒別的準確性。我們對7株耐RFP結(jié)核分支桿菌rpoB基因測序結(jié)果顯示突變高發(fā)位點是531位(71%)，與文獻報道相符。

17、堿基置換以單點突變?yōu)橹?，未見缺失與插入突變。其中4株531位CT,SerLeu（57），1株531位TCCA,SerGln（14），同一密碼子內(nèi)雙點突變（見表1），2株526位CT,HisTyr（29）。對70份臨床痰標本中14份具有BACTEC培養(yǎng)及藥敏試驗結(jié)果的痰標本進行PCR-SSCP，結(jié)果表明（見表3）PCR-SSCP銀染色法直接檢測臨床痰標本結(jié)核分支桿菌利福平藥物敏感性，檢出陽性率為64（914），如提高標本質(zhì)量，加大標本用量，相信會進一步提高陽性檢出率。70份痰標本中2份BACTEC460培陰PCR陽性痰標本，有待結(jié)合臨床其它資料進一步分析。常規(guī)結(jié)核分支桿菌藥敏試驗需12個月時間，

18、不能滿足臨床早期開展有效治療的需要。我們采用PCR-SSCP銀染色法使結(jié)核分支桿菌RFP藥敏試驗在2天內(nèi)即可完成，且經(jīng)rpoB基因序列測定證實了方法的準確性。雖然PCR-SSCP方法不能精確判定突變的部位、性質(zhì)和數(shù)目，卻具有簡便、快速、靈敏、準確地檢測多個樣本基因突變的優(yōu)點。且我們采用自行設(shè)計的一對引物進行一次性擴增，不僅可以避免二次擴增可能帶來的污染及錯配現(xiàn)象，還降低了成本投入，簡化了操作步驟，使檢出陽性率同樣達到90。故我們認為PCR-SSCP銀染色法可用于臨床標本結(jié)核分支桿菌RFP藥物敏感性的直接快速檢測，指導臨床用藥。志謝感謝北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所程紹基博士及潘毓萱研究員的熱誠幫助，

19、同時感謝長春市結(jié)核病醫(yī)院提供的臨床痰標本及其BACTEC460培養(yǎng)、藥敏試驗結(jié)果本課題為長春市科委攻關(guān)項目，受長春市衛(wèi)生局基金資助作者單位：130051 長春職工醫(yī)科大學(魚瑛、王淑華)；白求恩醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)院(康熙雄、金玲)；白求恩醫(yī)科大學微生物教研室(馬琳)參考文獻1Telenti A, Imboden P, Marchesi F, et al. Detection of rifampin-resistant mutations in Mycobacterium tuberculosis. Lancet,1993,341:647-650.2Kapur V, Li L, iordanes

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