結(jié)核分支桿菌利福平藥物敏感性的直接快速檢測(cè)

1、    結(jié)核分支桿菌利福平藥物敏感性的直接快速檢測(cè)        【摘要】目的探討利用分子生物學(xué)方法直接快速檢測(cè)臨床標(biāo)本結(jié)核分支桿菌利福平（RFP）藥物敏感性的可行性。方法自行設(shè)計(jì)針對(duì)rpoB基因特異擴(kuò)增的引物（擴(kuò)增產(chǎn)物為183 bp片段），運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）銀染色法，檢測(cè)45株結(jié)核分支桿菌臨床分離株，對(duì)其中部分菌株進(jìn)行rpoB基因DNA序列分析；運(yùn)用PCR-SSCP銀染色法對(duì)70份結(jié)核病患者痰標(biāo)本進(jìn)行直接快速檢測(cè)，并與藥敏試驗(yàn)結(jié)果做對(duì)照分析

2、。結(jié)果45株臨床分離株中16株RFP敏感結(jié)核分支桿菌SSCP帶譜與結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（H37Rv）相同，29株RFP耐藥株中有26株檢測(cè)到突變譜，陽(yáng)性率為90。從具有SSCP特征性帶譜的菌株中篩選8株臨床分離株進(jìn)行rpoB基因序列分析顯示：1株RFP敏感株無(wú)rpoB基因突變，7株耐藥株均發(fā)生堿基突變（符合率100）。堿基以單點(diǎn)突變?yōu)橹?，?31位堿基突變最為多見(jiàn)4株531位TCGTTG，SerLeu（57）；1株531位TCGCAG，SerGln（14）；2株526位CACTAC，HisTyr（29）。與BACTEC對(duì)照臨床痰標(biāo)本直接快速檢測(cè)陽(yáng)性率為64。結(jié)論結(jié)核分支桿菌耐RFP是其rpoB基

3、因突變所致。PCR-SSCP銀染色法可用于臨床標(biāo)本中結(jié)核分支桿菌RFP藥物敏感性的直接快速檢測(cè)。rpoB基因序列分析不僅證實(shí)了rpoB基因突變以531位及526位密碼子的點(diǎn)突變?yōu)橹鳎€進(jìn)一步證實(shí)了PCR-SSCP銀染色法的準(zhǔn)確性。【關(guān)鍵詞】分支桿菌，結(jié)核利福平藥物耐受性聚合酶鏈反應(yīng)多態(tài)現(xiàn)象，單鏈構(gòu)象序列分析 Direct, rapid detection for rifampin susceptibility to M. tuberculosisYU Ying?, KANG Xixiong, JIN Ling, et al. ?Chang chun Worker's Medical C

4、ollege, Changchun 130051【Abstract】ObjectiveTo evaluate the use of molecular biotechnology for direct, rapid detection of rifampicin-resistance mutations in M.tuberculosis. Methods45 M.tuberculosis clinical isolates and 70 sputum samples were tested by polymerase chain reaction-single stranded confor

5、mation polymorphism （PCR-SSCP） technique. M.tuberculosis strain H37Rv was used as control and compared with the result of susceptibility test.DNA sequencing was also performed in some of the strains. ResultsAll tested susceptible isolates displayed identical SSCP patterns. Of 29 RFP resistance strai

6、ns, 26(90%) had distinct mobility shifts that can be discriminated from susceptible isolates. 9 sputum samples which were successfully evaluated by PCR-SSCP showed concordant result acquired from BACTEC 460 method.As the result of DNA sequencing,it was observed that seven RFP-resistance phenotype of

7、 M. tuberculosis strains had missense mutation,in which 5 isolates displayed TCGTTG or CAG mutations at codon 531,2 had CAC TAC mutation at codon 526. On the other hand, one strain which was susceptible to rifampin exhibited identical nucleotide alignment to the sequence of rpoB gene. ConclusionsPCR

8、-SSCP could be used as a method for simple,rapid,and reliable detection of rifampicin-resistance mutations in clinical samples of M.tuberculosis.【Key words】Mycobacterium tuberculosisRifampinDrug tolerencePolymerase chain reactionPolymorphism, single strand conformationSequence analysis結(jié)核分支桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物產(chǎn)生

9、耐受性，給結(jié)核病的防治工作帶來(lái)威脅。對(duì)結(jié)核分支桿菌耐藥分子機(jī)制的研究及對(duì)結(jié)核分支桿菌藥物敏感性的早期快速診斷，是結(jié)核病防治工作的重要課題。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)結(jié)核分支桿菌耐利福平(RFP)的分子機(jī)制的研究1-6,10,11表明，結(jié)核分支桿菌耐RFP是由于RFP靶分子RNA多聚酶亞單位的編碼基因（rpoB）突變所致，且突變集中于rpoB基因508533位的76個(gè)氨基酸（78 bp）7組成的區(qū)域內(nèi)，以531位絲氨酸替代最為常見(jiàn)。我們采用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)銀染色法對(duì)45株結(jié)核分支桿菌臨床分離株進(jìn)行rpoB基因突變的檢測(cè)，并通過(guò)DNA測(cè)序法對(duì)其中部分菌株進(jìn)行rpoB基因序列

10、分析，旨在證明PCR-SSCP銀染色法的準(zhǔn)確性。同時(shí)采用PCR-SSCP銀染色法對(duì)70份結(jié)核病患者痰標(biāo)本進(jìn)行直接快速檢測(cè)，對(duì)PCR-SSCP銀染法的臨床應(yīng)用進(jìn)行評(píng)估。材料與方法一、材料結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)株及45株結(jié)核分支桿菌臨床分離株獲自北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所。痰標(biāo)本為1997年11月1998年4月間在長(zhǎng)春市結(jié)核病院住院的70例肺結(jié)核患者痰標(biāo)本。二、方法1.細(xì)菌DNA的制備：臨床分離菌株采用酚-氯仿提抽法提取DNA，置-20保存?zhèn)溆谩ＥR床痰標(biāo)本的處理：40 g/L NaOH消化離心。沉渣經(jīng)PBS沖冼，加裂解液，混勻，55孵育1小時(shí)，965分鐘，16 000 rmin離心5分鐘，取上清備用。2

11、.PCR擴(kuò)增：根據(jù)文獻(xiàn)8提供的序列資料，借助計(jì)算機(jī)輔助自行設(shè)計(jì)rpoB基因183bp片段（該片段包括了易發(fā)生耐藥突變的78bp）擴(kuò)增引物。上引物：5-AAGGAGTTCTTCGGCACCAG-3，下引物：5-GGTTTCGATCGGGCACATCC-3。PCR反應(yīng)體系50 l包括：每個(gè)引物2.0 l，10 mmolL Tris HCl（pH 8.0），2.5 mmolL MgCl2，體積分?jǐn)?shù)為0.10的丙三醇，dNTPs各2.5 mmolL，模板DNA 2.0 l，1.0 U的Taq DNA聚合酶。擴(kuò)增反應(yīng)共30個(gè)循環(huán)。3.SSCP分析：取擴(kuò)增產(chǎn)物10 l置于80 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠中

12、電泳。1 g/L硝酸銀染色，觀察結(jié)果并攝像。4.DNA序列檢測(cè)分析：在大連寶生物公司進(jìn)行計(jì)算機(jī)識(shí)讀結(jié)果。結(jié)果一、臨床分離株P(guān)CR-SSCP結(jié)果45株臨床分離株均獲得183 bp擴(kuò)增片段，說(shuō)明擴(kuò)增成功。以結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv為對(duì)照，45株結(jié)核分支桿菌臨床分離株中16株RFP敏感株SSCP帶譜均與對(duì)照相同，29株RFP耐藥株中有3株帶譜與對(duì)照相同，另26株其SSCP帶譜與對(duì)照有不同程度的差異。與藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)照陽(yáng)性率90，特異性100。二、DNA測(cè)序結(jié)果在45株臨床分離株中選取8株，對(duì)其rpoB基因183 bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定分析，結(jié)果顯示：5株耐RFP菌株堿基531位存

13、在點(diǎn)突變；2株耐RFP菌株堿基526位有點(diǎn)突變；1株RFP敏感株堿基序列無(wú)改變。詳見(jiàn)表1。表18株結(jié)核分支桿菌臨床分離株rpoB基因測(cè)序分析結(jié)果菌株RFP耐藥表型PCR-DNA測(cè)序分析株數(shù)密碼子*突變位點(diǎn)堿基置換氨基酸置換敏感1耐藥531位TCGTTGSerLeu4TCGCAGSerGln1526位CACTACHisTyr2注：*號(hào)碼與大腸桿菌rpoB基因位點(diǎn)相符三、臨床痰標(biāo)本PCR與BACTEC培養(yǎng)結(jié)果對(duì)70份臨床痰標(biāo)本的rpoB基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果有11份臨床標(biāo)本PCR擴(kuò)增陽(yáng)性。對(duì)該70份臨床標(biāo)本進(jìn)行BACTEC460培養(yǎng)，結(jié)果顯示14例呈陽(yáng)性，PCR與BACTEC460對(duì)照結(jié)果詳見(jiàn)表

14、2。 表2臨床痰標(biāo)本的rpoB基因PCR與BACTEC460培養(yǎng)結(jié)果BACTEC460培養(yǎng)PCR擴(kuò)增合計(jì)+-+9514-25456合計(jì)115970四、臨床痰標(biāo)本BACTEC460藥敏試驗(yàn)與SSCP分析結(jié)果14份BACTEC460培養(yǎng)陽(yáng)性的臨床痰標(biāo)本，對(duì)其進(jìn)行RFP藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，其中10份標(biāo)本對(duì)RFP敏感。4份標(biāo)本耐RFP。對(duì)該14份臨床標(biāo)本進(jìn)行SSCP分析結(jié)果顯示：5份標(biāo)本呈現(xiàn)敏感型帶 表3PCR-SSCP對(duì)14份BACTEC460培陽(yáng)痰標(biāo)本的評(píng)估PCR-SSCPBACTEC培陽(yáng)合計(jì)RFP敏感RFP耐藥陽(yáng)性敏感型帶譜505耐藥型帶譜044陰性505合計(jì)10414*注：*經(jīng)BACTEC

15、種鑒定程序初定為結(jié)核分支桿菌譜，4份標(biāo)本獲得差異型帶譜，陽(yáng)性檢出率64%。詳見(jiàn)表3。 討論抗結(jié)核藥物RFP作用機(jī)制是，與RNA聚合酶亞單位結(jié)合進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄過(guò)程。關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸改變可以導(dǎo)致RNA聚合酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而失去與RFP結(jié)合的位點(diǎn)，導(dǎo)致結(jié)核分支桿菌耐RFP。目前對(duì)結(jié)核分支桿菌編碼RNA聚合酶亞單位基因rpoB的研究證實(shí)，RFP耐藥株rpoB基因發(fā)生特定位點(diǎn)突變或基因缺失，突變集中在編碼508533位的26個(gè)氨基酸（78 bp）區(qū)域內(nèi)，并以531位突變最為常見(jiàn)，突變頻率為51.5。其次是526位，突變頻率為281。國(guó)內(nèi)外對(duì)結(jié)核分支桿菌耐RFP基因突變檢測(cè)的研究中，以PCR-SSCP方法報(bào)道居

16、多，此方法具有技術(shù)條件較為成熟、簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確及檢出率高的特點(diǎn)。Telenti等9將此法與測(cè)序相對(duì)照，結(jié)果符合率達(dá)100。我們應(yīng)用PCR-SSCP銀染色法，對(duì)45株結(jié)核分支桿菌臨床分離株進(jìn)行耐藥性評(píng)估，與藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)照檢出陽(yáng)性率達(dá)90，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。我們對(duì)有PCR-SSCP特征性帶譜的臨床分離株進(jìn)行rpoB基因測(cè)序分析，結(jié)果顯示7例具有SSCP耐藥型帶譜的rpoB基因均有堿基突變，而敏感株無(wú)基因突變（符合率100），由此進(jìn)一步證明了PCR-SSCP方法用于rpoB基因突變鑒別的準(zhǔn)確性。我們對(duì)7株耐RFP結(jié)核分支桿菌rpoB基因測(cè)序結(jié)果顯示突變高發(fā)位點(diǎn)是531位(71%)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

17、堿基置換以單點(diǎn)突變?yōu)橹?，未?jiàn)缺失與插入突變。其中4株531位CT,SerLeu（57），1株531位TCCA,SerGln（14），同一密碼子內(nèi)雙點(diǎn)突變（見(jiàn)表1），2株526位CT,HisTyr（29）。對(duì)70份臨床痰標(biāo)本中14份具有BACTEC培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果的痰標(biāo)本進(jìn)行PCR-SSCP，結(jié)果表明（見(jiàn)表3）PCR-SSCP銀染色法直接檢測(cè)臨床痰標(biāo)本結(jié)核分支桿菌利福平藥物敏感性，檢出陽(yáng)性率為64（914），如提高標(biāo)本質(zhì)量，加大標(biāo)本用量，相信會(huì)進(jìn)一步提高陽(yáng)性檢出率。70份痰標(biāo)本中2份BACTEC460培陰PCR陽(yáng)性痰標(biāo)本，有待結(jié)合臨床其它資料進(jìn)一步分析。常規(guī)結(jié)核分支桿菌藥敏試驗(yàn)需12個(gè)月時(shí)間，

18、不能滿足臨床早期開(kāi)展有效治療的需要。我們采用PCR-SSCP銀染色法使結(jié)核分支桿菌RFP藥敏試驗(yàn)在2天內(nèi)即可完成，且經(jīng)rpoB基因序列測(cè)定證實(shí)了方法的準(zhǔn)確性。雖然PCR-SSCP方法不能精確判定突變的部位、性質(zhì)和數(shù)目，卻具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)多個(gè)樣本基因突變的優(yōu)點(diǎn)。且我們采用自行設(shè)計(jì)的一對(duì)引物進(jìn)行一次性擴(kuò)增，不僅可以避免二次擴(kuò)增可能帶來(lái)的污染及錯(cuò)配現(xiàn)象，還降低了成本投入，簡(jiǎn)化了操作步驟，使檢出陽(yáng)性率同樣達(dá)到90。故我們認(rèn)為PCR-SSCP銀染色法可用于臨床標(biāo)本結(jié)核分支桿菌RFP藥物敏感性的直接快速檢測(cè)，指導(dǎo)臨床用藥。志謝感謝北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所程紹基博士及潘毓萱研究員的熱誠(chéng)幫助，

19、同時(shí)感謝長(zhǎng)春市結(jié)核病醫(yī)院提供的臨床痰標(biāo)本及其BACTEC460培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)結(jié)果本課題為長(zhǎng)春市科委攻關(guān)項(xiàng)目，受長(zhǎng)春市衛(wèi)生局基金資助作者單位：130051 長(zhǎng)春職工醫(yī)科大學(xué)(魚(yú)瑛、王淑華)；白求恩醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)院(康熙雄、金玲)；白求恩醫(yī)科大學(xué)微生物教研室(馬琳)參考文獻(xiàn)1Telenti A, Imboden P, Marchesi F, et al. Detection of rifampin-resistant mutations in Mycobacterium tuberculosis. Lancet,1993,341:647-650.2Kapur V, Li L, iordanes

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