異育銀鯽病原溫和氣單胞菌表型及分子鑒定與溶血素基因檢測(cè)

1、異育銀鯽病原溫和氣單胞菌表型及分子鑒定與溶血素基因檢測(cè)*張曉君1，閻斌倫1，邴旭文2，秦蕾1，秦國(guó)民1(1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，連云港 222005；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水魚(yú)類遺傳育種和養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214081)摘要：2008年10月江蘇鹽城大豐精養(yǎng)異育銀鯽（Carassius auratus gibelio) 發(fā)生嚴(yán)重疾病，從病魚(yú)肝臟、血液及腹水中分離到優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的細(xì)菌。對(duì)分離做純培養(yǎng)的4株菌(JY081016-1至JY081016-4)進(jìn)行形態(tài)特征、理化特性等表型生物學(xué)性狀檢驗(yàn)；測(cè)定了菌株（JY081016-1

2、）的16S rRNA和gyrB基因序列，分析了16S rRNA和gyrB兩種基因序列的同源性，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。結(jié)果表明分離菌對(duì)供試健康異育銀鯽有強(qiáng)致病性，菌株（JY081016-1）所擴(kuò)增的16S rRNA基因序列長(zhǎng)度為1448bp（GenBank 登錄號(hào)：GQ232759），所擴(kuò)增的gyrB基因序列長(zhǎng)度為1177bp（GenBank 登錄號(hào)：GQ232760），其16S rRNA和gyrB基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中維氏氣單胞菌和維氏氣單胞菌溫和生物型的16S rRNA和gyrB基因序列相似性均在97%以上；根據(jù)分離菌的表型及分子特征，判定分離鑒定的4株菌為溫和氣單胞菌（Aeromo

3、nas sobria）。胞外酶及溶血活性檢測(cè)表明分離菌均能產(chǎn)生蛋白酶、卵磷脂酶、脂酶，在含7%家兔脫纖血液營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上呈型溶血；設(shè)計(jì)的特異性引物可擴(kuò)增出溶血素基因。關(guān)鍵詞：異育銀鯽；溫和氣單胞菌；16S rRNA基因；gyrB基因；溶血素基因中圖分類號(hào)： 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: 文章編號(hào)：Detection of hemolysin gene and phenotypic and molecular identification of pathogenic Aeromonas sobria from gibel carp (Carassius auratus gibelio) ZHANG Xiao-

4、jun1, YAN Bin-lun1, BING Xu-wen2, QIN Lei1, QIN Guo-min1(1. College of Ocean, Key Laboratory of Oceanic Biotechnology of Jiangsu, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang, Jiangsu 222005; 2. Key Laboratory of Genetic Breeding and Aquaculture Biology of Freshwater Fishes, Ministry of Agriculture,

5、 Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Science, Wuxi, Jiangsu 214081 )ABSTRACT In October 2008, high mortalities of cultured gibel carp occurred in some farms of Yancheng city of Jiangsu province, dominant bacteria were isolated from liver, kidney, bleed and ascitic fluid.

6、 The phenotypic characteristics of four strains (JY081016-1 to JY081016-4) were examined, including morphological characteristics, physiological and biochemical characteristics, the 16S rRNA and gyrB were amplified by PCR and compared with sequences deposited in databases, molecular phylogenetic tre

7、es were constructed. The results showed the isolates have strong pathogenicity to healthy gibel carp by artificial challenge; the amplified 16S rRNA gene of strain JY081016-1 (GenBank accession No. GQ232759) was 1448bp in length, the amplified gyrB gene (GenBank accession No. GQ232760) was 1177bp in

8、 length, and two genes all exhibited high similarity (over 97%) with the 16S rRNA and gyrB gene of Aeromonas veronii and A.veronii bv.sobria from GenBank database; the isolates were identified as Aeromonas sobria based on their phenotypic and molecular characteristics. Detection of the activity of e

9、xtracellulase and hemolysin showed that the isolate could produced proteinase, lipase, lecithinase, and with-haemolysis in containing 7% defibrinated rabbit blood agar plates, and hemolysin gene could be amplified by PCR using specific primer.KEY WORDS Gibel carp (Carassius auratus gibelio); Aeromon

10、as sobria; 16S rRNA gene; gyrB gene; hemolysin gene *農(nóng)業(yè)部淡水魚(yú)類遺傳育種和養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金資助（BZ2009-03）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK2009163）作者簡(jiǎn)介：張曉君（1969），女，博士，教授，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物病害及病原微生物學(xué)研究.E-mail：.溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria Popoff and Véron 1981）亦被稱為寡源氣單胞菌，也有的將其記作蘇伯利氣單胞菌，分類于氣單胞菌科（Aeromonadaceae Colwell MacDonell and Deley 198

11、6）氣單胞菌屬（Aeromonas Kluyver and van Niel 1936）。該菌為條件致病菌，可以引起多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的感染發(fā)病，可單獨(dú)引發(fā)感染或與嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌及其他病原菌混合感染，有報(bào)道該菌可導(dǎo)致鰻鱺、羅非魚(yú)、河鱸、暗紋東方鲀、牛蛙、中華鱉、大鯢等感染發(fā)病1-7，近年也有在冷血?jiǎng)游?、水禽等引起感染發(fā)病的報(bào)道8-9，另外，該菌可導(dǎo)致人類的食物中毒、腹瀉、宮頸糜爛等疾病10，屬于人獸共染的病原細(xì)菌。2008年10月江蘇省鹽城市大豐幾家養(yǎng)殖場(chǎng)所精養(yǎng)的異育銀鯽發(fā)生疾病，病情嚴(yán)重，病魚(yú)死亡慘重，所養(yǎng)異育銀鯽500畝左右，異育銀鯽魚(yú)種重3040克，投喂商品顆粒飼料。對(duì)送檢的3

12、0尾（來(lái)自5家養(yǎng)殖戶）瀕死或新鮮死亡異育銀鯽進(jìn)行了檢驗(yàn)，病魚(yú)表現(xiàn)為眼球突出，部分病魚(yú)鰓框有血絲，鰭條中央變白，鱗片疏松，腹部膨脹，剖開(kāi)魚(yú)腹，可見(jiàn)腹腔積有大量黃色腹水，肝臟顏色變白，腎臟輕微腫大，個(gè)別病魚(yú)內(nèi)臟外有一層淡黃色膠凍狀物。取被檢魚(yú)的肝臟、腎臟、腹水及血液做細(xì)菌學(xué)及致病性檢驗(yàn)，結(jié)果表明其病原為氣單胞菌屬（Aeromonas Kluyver and van Niel 1936）的溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）。為豐富該菌在生物學(xué)性狀、宿主范圍及分子生物學(xué)等方面的內(nèi)容，對(duì)其進(jìn)行了致病性、形態(tài)特征、理化特性、16S rRNA基因和gyrB基因序列及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、對(duì)抗菌類藥物的敏

13、感性及胞外酶及溶血素等毒力因子檢測(cè)，旨在能為對(duì)該菌的有效檢驗(yàn)及深入研究等提供一定的參考。1 材料與方法1.1 病原菌的分離取病死異育銀鯽肝臟、血液及腹水，抹片后革蘭氏染色鏡檢；劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，取優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的4個(gè)菌落（編號(hào)為：JY081016-14）移接于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面（28培養(yǎng)24h）進(jìn)行純培養(yǎng)供鑒定。1.2 致病性試驗(yàn) 試驗(yàn)用異育銀鯽購(gòu)自水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，暫養(yǎng)1周經(jīng)檢驗(yàn)健康后進(jìn)行試驗(yàn)。將供試菌株JY081016-1接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯，28過(guò)夜培養(yǎng)后作為供試菌液（調(diào)至106CFU/ml、107CFU/ml、108CFU/ml），分別經(jīng)腹腔及肌肉注射感染健康異育銀鯽，每種濃度接種

14、6尾，每尾接種0.2ml；同時(shí)設(shè)立接種同劑量、同批無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯做對(duì)照；均隔離養(yǎng)殖于試驗(yàn)水族箱中，每天觀察試驗(yàn)魚(yú)感染后的發(fā)病與死亡情況，以引起試驗(yàn)魚(yú)發(fā)病死亡并能重新分離回收到原感染菌作為分離菌致病性的判定指標(biāo)。1.3 病原菌表型特征檢驗(yàn) 取純培養(yǎng)菌涂片，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢細(xì)菌形態(tài)；純培養(yǎng)菌接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂及硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂（TCBS）培養(yǎng)基，置28培養(yǎng)24h，檢查生長(zhǎng)情況。理化特性測(cè)定主要參照常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)11及人及動(dòng)物病原細(xì)菌學(xué)12進(jìn)行。1.4 病原菌胞外產(chǎn)物檢測(cè)分離菌的胞外蛋白酶活性、卵磷脂酶活性、脂酶活性、淀粉酶活性、尿素酶活性采用平板檢驗(yàn)方法，明

15、膠酶活性采用試管液化方法。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4株供試菌株分別點(diǎn)種于含有脫脂牛奶（10%）、蛋黃液（10%）、吐溫80（1.0%）、淀粉（1%）的平板中，將供試菌穿刺接種于含明膠（8%）的培養(yǎng)基試管，于28恒溫培養(yǎng)24h后觀察。含脫脂牛奶、蛋黃液及吐溫80的平板可以直接觀察水解圈；含淀粉的平板則在觀察之前加入顯色劑碘液。透明的水解圈區(qū)域顯示有酶活。含明膠的培養(yǎng)基試管于28恒溫培養(yǎng)24h后，置于4冰箱中過(guò)夜后觀察。分離菌的溶血活性采用將菌株接種至血液瓊脂（含7家兔脫纖血的營(yíng)養(yǎng)瓊脂）培養(yǎng)基平板的方法，將接種后的血液瓊脂培養(yǎng)基平板置28恒溫培養(yǎng)24h后觀察菌株周圍是否出現(xiàn)溶血圈。若出現(xiàn)溶血圈則為陽(yáng)性，

16、表明該菌能分泌溶血毒素。1.5 16S rRNA 和gyrB基因序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析CR 模板DNA的制備 取純培養(yǎng)菌分別接種于LB肉湯中28培養(yǎng)16h，按小量細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司產(chǎn)）所述方法提取DNA作為PCR模板DNA。 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增的兩個(gè)引物分別為：27F（正向引物）：5'-AGA GTT TGA TC(C/A) TGG CTC AG-3'，1492R（反向引物）：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3' 13。在20l反應(yīng)體系中含有：無(wú)菌蒸餾水14.4l，10×PCR

17、緩沖液2l，1.5m mol/L MgCl2 1.6l，4×dNTP混合物 0.4l，引物各0.2l，2.5U/l 的Taq DNA聚合酶0.2l，模板DNA 1l。PCR反應(yīng)條件為：95預(yù)變性3min、接94變性1min、55復(fù)性1min、72延伸2min，30個(gè)循環(huán)后72溫育6min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生物工程技術(shù)公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。 gyrB 基因序列的PCR擴(kuò)增與測(cè)序 gyrB基因PCR擴(kuò)增的兩個(gè)引物分別為：UP1（正向引物）：5'-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CAY GCN GGN GGN AAR TTY GA-3'，UP2r

18、（反向引物）：5'-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CCR TCN ACR TCN GCR TCN GTCAT-3' 14。在20l反應(yīng)體系中含有：無(wú)菌蒸餾水14.4l，10×PCR緩沖液2l，1.5m mol/L MgCl2 1.6l, 4×dNTP混合物 0.4l，引物各0.2l，2.5U/l 的Taq DNA聚合酶0.2l，模板DNA 1l。PCR反應(yīng)條件為：94預(yù)變性5min，接94變性1min、57復(fù)性1min、72延伸2min、30個(gè)循環(huán)，然后72溫育7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生物工程技術(shù)公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。和gyr

19、B 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 對(duì)分離菌的16S rRNA基因和gyrB采用MEGA3(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，MEGA)軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，采用鄰接法（neighbor joining method）建樹(shù)方法，并通過(guò) Bootstrap 法（1000次重復(fù)）檢驗(yàn)。1.6 菌種分類位置確定根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、培養(yǎng)及理化特性測(cè)定的結(jié)果，主要依據(jù)Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed15、Bergeys Manual of Systematic Bacteriology16及

20、有關(guān)資料，并結(jié)合細(xì)菌發(fā)育學(xué)分析的結(jié)果，進(jìn)行分離菌的種屬分類位置判定。1.7 溶血素基因的檢測(cè)根據(jù)Fujii等17報(bào)道的溫和氣單胞菌溶血素基因序列設(shè)計(jì)引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用于溶血素基因序列的擴(kuò)增。P1序列為5'GGA TCC ATG ATG AAT AGA ATA 3'，P2序列為5'AAG CTT TTA TTG AAC CGG AAC 3'。PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)參數(shù)及模板DNA的制備按前述方法進(jìn)行，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。2 結(jié)果 2.1 病原細(xì)菌檢驗(yàn)與分離在被檢異育銀鯽的肝臟、血液和腹水中，均存在大量革蘭氏陰性、散在或成

21、雙排列、兩端鈍圓、無(wú)芽孢、大小多在0.51.0µm×1.02.0µm的桿菌（個(gè)別菌體稍彎曲）。自被檢異育銀鯽的肝臟、血液和腹水中均分離到了大量同種細(xì)菌。培養(yǎng)24h檢查其菌落特征為圓形光滑、不透明、隆起、乳白色、有光澤、邊緣整齊、直徑多在1mm左右，48h的菌落直徑多在1.5mm左右，生長(zhǎng)良好。2.2 分離菌的致病性供試菌株（JY081016-1）腹腔及肌肉注射感染異育銀鯽后，供試魚(yú)于感染后34天陸續(xù)死亡并出現(xiàn)明顯的體表出血、鱗片疏松、脫落等病變。對(duì)照組異育銀鯽在14d觀察期內(nèi)均正常；取感染死亡魚(yú)進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，結(jié)果均檢驗(yàn)并分離到大量純一的同供試菌株（JY08101

22、6-1）在形態(tài)及菌落特征上相似的菌落。試驗(yàn)證明分離菌為本次引起異育銀鯽大量死亡的病原菌。2.3 形態(tài)與生長(zhǎng)特性4株分離菌的形態(tài)一致，均為革蘭氏染色陰性、桿狀、散在或成雙排列、無(wú)芽孢、大小多在0.40.8m×1.22.0m的細(xì)菌。4株分離菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的菌落特征，與從病魚(yú)腎臟和腹水中直接分離的一致，生長(zhǎng)良好；在TCBS培養(yǎng)基上易生長(zhǎng)，形成黃色菌落；在普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（管）中，28培養(yǎng)24h檢查呈均勻混濁生長(zhǎng)，管底有點(diǎn)狀菌體沉淀。2.4 生理生化特性 分離菌所測(cè)主要理化特性的反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表1。表1 分離菌與4種嗜溫有動(dòng)力氣單胞菌理化特性比較表Table 1 Physiological

23、 and biochemical characteristics of isolates and 4 mesophilic motile aeromonads特性Character分離菌Isolates嗜水氣單胞菌aA.hydrophila溫和氣單胞菌aA.sobria豚鼠氣單胞菌aA.caviae維氏氣單胞菌aA.veronii37生長(zhǎng) Growth at 37+氧化酶 Oxidase+接觸酶 Catalase+O-F試驗(yàn) O-F testFFFFF動(dòng)力 Motility+葡萄糖: 產(chǎn)酸 Glucose,acid production+產(chǎn)氣 gas production +-+乳糖 Lact

24、ose-d-d-麥芽糖 Maltose+甘露醇 Mannitol+甘露糖 Mannose+d+蔗糖 Sucrose+d+阿拉伯糖 Arabinose-+-+-阿拉伯醇Arabitol-木糖 Xylose-半乳糖 Galactose+山梨醇 Sorbitol-d-山梨糖 Sorbose-····衛(wèi)茅醇 Dulcitol-赤鮮醇Erythritol-苦杏仁苷Amygdatin-····鼠李糖 L-Rhamnose-糊精 Oextrin+····肌醇 Inositol-側(cè)金盞花醇A

25、donitol-····水楊苷 Salicin-+-+膽汁七葉苷Esculin-+-+-半乳糖苷酶 ONPG+-+丙二酸鹽利用 Malonate -枸櫞酸鹽利用Citrate +d-d+醋酸鹽利用Acetate +ddd+酒石酸鹽利用Tartrate -+黏液酸鹽利用Mucate -苯丙氨酸脫氨酶 Phenylalanine deaminase-+-+蕈糖 Trehalose+d+棉子糖 Raffinose+-果糖 Fructose+····蜜二糖 Melibiose+-纖維二糖Cellobiose-+/-+/-+

26、甲基紅 MR test+-+V-P試驗(yàn) V-P test+d+葡萄糖銨Glucosamine+····尿素酶 Urease -H2S產(chǎn)生 H2S production-+-乙酰胺酶Acetamidase-····硝酸鹽還原Nitrate reduction-+-甲基-D-葡糖苷 -methyl-D-glucoside+dd-+吲哚 Indole-+NaCl中生長(zhǎng) Growth at NaCl 0+1+3%+····6-···-O/129敏感性 s

27、ensitivity : 10g-150g-注：“”示陽(yáng)性，“”示陰性，“F”示發(fā)酵型，“d”示11%89%的菌株為陽(yáng)性“·”示在原文中無(wú)記載。上角標(biāo)a指表中數(shù)據(jù)取自Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed（1994）。Notes: “”, positive; “”, negative; “F”, fermentative; “d”, 11%89% positive ,“·”, not described in primary article. “a”，the data come fromBergey

28、's Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed.2.5 16S rRNA和gyrB基因序列與系統(tǒng)發(fā)育學(xué) 分離菌（JY081016-1）所擴(kuò)增的16S rRNA基因序列長(zhǎng)度為1448bp（GenBank 登錄號(hào)：GQ232759）；所擴(kuò)增的gyrB基因序列長(zhǎng)度為1177bp（GenBank 登錄號(hào)：GQ232760）。將兩種基因序列在NCBI上通過(guò)Blast進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果分離菌的16S rRNA基因序列與氣單胞菌屬細(xì)菌的16S rRNA基因序列自然聚類，在檢索出的序列中，主要包括維氏氣單胞菌（A.veronii）、維氏氣單胞菌溫和生物

29、型(A.veronii bv.sobria)、嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）、Aeromonas culicicola、維氏氣單胞菌維氏生物型（A.veronii bv. veronii）、簡(jiǎn)氏氣單胞菌（A.jandaei）、豚鼠氣單胞菌（A.caviae）等，JY081016-1株與這些氣單胞菌的相似性均在99%，選取了檢索出的部分氣單胞菌和1株鰻利斯頓氏菌（登錄號(hào)AY662304）作為外圍菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖1所示。分離菌（JY081016-1）的gyrB基因序列與氣單胞菌屬細(xì)菌的gyrB基因序列自然聚類，在檢索出的序列中，主要包括維氏氣單胞菌和維氏氣單胞菌溫和

30、生物型（相似性均在97%98%）、嗜水氣單胞菌（相似性在92%96%）、簡(jiǎn)氏氣單胞菌（相似性在93%）及中間氣單胞菌（相似性在93%），以鰻利斯頓氏菌（登錄號(hào)AM235736）作為外圍菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2所示。圖1 LY081016-1株16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) (圖中EF631963至AY662304為菌株在NCBI的登錄號(hào), 數(shù)字為自舉值)Fig.1 Phylogenetic tree based on LY081016-116S rRNA gene sequences (EF631963AY662304 were database accession num

31、bers in NCBI, numbers above branches in tree are bootstrap values)圖2 LY081016-1株gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) (圖中EU595707至AM235736為菌株在NCBI的登錄號(hào), 數(shù)字為自舉值)Fig.2 Phylogenetic tree based on LY081016-1 gyrB gene sequences (EU595707AM235736 were database accession numbers in NCBI, numbers above branches in tree are bootstr

32、ap values)2.6 胞外酶活性及溶血活性酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌（JY081016-1）的胞外產(chǎn)物具有蛋白酶、卵磷脂酶、脂酶活性，但不具有淀粉酶、明膠酶活性。供試菌在含7%家兔脫纖血液營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，呈型溶血現(xiàn)象。2.7 菌種分類位置 結(jié)合形態(tài)觀察、普通的生理生化特征、16S rRNA與gyrB基因的分子鑒定結(jié)果，判定分離菌為氣單胞菌屬（Aeromonas Kluyver and van Niel 1936）的溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria Popoff and Véron 1981）。2.8 溶血素基因檢測(cè) 用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行菌體PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖

33、凝膠電泳，2株供試菌均可擴(kuò)增出溶血素基因，見(jiàn)圖3。圖 3 溫和氣單胞菌溶血素基因的擴(kuò)增(M: 2000bp marker; 1, 2: 2株分離菌溶血素基因片段)Fig 3 Amplification of the hemolysin gene of A.sobria (M:2000bp marker; 1,2: hemolysin gene segment of 2 isolates)3 討 論異育銀鯽（Carassius auratus gibelio Bloch) 全名為“異精雌核發(fā)育銀鯽”，是以黑龍江方正縣的銀鯽作母本，江西省興國(guó)縣的紅鯉作父本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交所獲得的優(yōu)良品種。該品種不僅肉

34、質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，而且食性廣，生長(zhǎng)快，平均生長(zhǎng)速度為銀鯽的1.4倍,為普通鯽魚(yú)的二倍以上，易于養(yǎng)殖，目前是我國(guó)淡水養(yǎng)殖魚(yú)類的主要魚(yú)種之一，隨著其養(yǎng)殖規(guī)模及養(yǎng)殖密度的不斷擴(kuò)大，病害多有發(fā)生，尤其是由細(xì)菌引起的疾病常呈暴發(fā)流行，已成為制約其養(yǎng)殖發(fā)展的明顯障礙。孫其煥等報(bào)道溫和氣單胞菌和嗜水氣單胞菌可引起異育銀鯽發(fā)生溶血性腹水病，病鯽體表及眼睛充血（腹部、鰭基、下頜、口腔尤為嚴(yán)重），肝臟腫大呈花肝、貧血，部分病鯽腸道充血、肛門紅腫、有的有腹水，少數(shù)有突眼、豎鱗癥狀19；此外，嗜水氣單胞菌常引起鯽魚(yú)發(fā)生出血病20-21；本次所檢江蘇鹽城市大豐漁業(yè)精養(yǎng)異育銀鯽病魚(yú)，表現(xiàn)為眼球突出，鰭條中央變白，鱗片疏松

35、，腹部膨脹，腹腔積有大量黃色腹水，肝臟貧血，腎臟輕微腫大，個(gè)別病魚(yú)內(nèi)臟外有一層淡黃色膠凍狀物等病變，自病死魚(yú)肝臟、腎臟、血液及腹水有規(guī)律地分離到優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的細(xì)菌并經(jīng)鑒定表明為溫和氣單胞菌，對(duì)健康異育銀鯽具有較強(qiáng)致病性。該項(xiàng)研究證明了溫和氣單胞菌在本次引起異育銀鯽疾病的原發(fā)病原學(xué)意義，進(jìn)一步表明了該菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中的廣泛致病作用。本次對(duì)于分離菌的鑒定，在進(jìn)行常規(guī)的形態(tài)特征、理化特性等生物學(xué)性狀檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用PCR方法同時(shí)擴(kuò)增了其16S rRNA和gyrB基因，通過(guò)基因序列的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析比較了兩種基因?qū)睾蜌鈫伟蔫b別能力。16S rRNA基因序列在氣單胞菌屬內(nèi)具有高度保守性，分離菌（JY0

36、81016-1株）的16S rRNA基因序列與這些氣單胞菌的相似性均在99%，且系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)也難以將分離菌與其所屬種聚為一類，可見(jiàn)在氣單胞菌分子鑒定中，使用16S rRNA基因進(jìn)行屬內(nèi)親緣關(guān)系很近的種間鑒定存在一定的局限性；而編碼DNA解旋酶B亞單位的基因（gyrB基因）普遍存在于各種細(xì)菌中，其序列具有保守性和變異性，其顯著優(yōu)點(diǎn)是基因進(jìn)化率較快，堿基替換頻率較高，在以核苷酸序列為基礎(chǔ)的細(xì)菌分類及鑒別研究中，可作為靶分子22。本次擴(kuò)增分離菌的gyrB基因序列并在NCBI中進(jìn)行比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析表明，分離菌（JY081016-1株）的gyrB基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的維氏氣單胞菌和維氏氣單胞菌溫和生物型

37、相似性均在97%98%，而與其他氣單胞菌相似性在97%以下，gyrB基因作為靶分子在氣單胞菌屬種間鑒別中能達(dá)到要求，且系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)能將JY081016-1株與維氏氣單胞菌溫和生物型(A.veronii bv.sobria)即溫和氣單胞菌聚為一類，本次研究進(jìn)一步表明在相似細(xì)菌的檢測(cè)和鑒別方面gyrB基因比16S rRNA基因更具優(yōu)越性。溫和氣單胞菌溶血素(hemolysin)被認(rèn)為是該菌重要的毒力因子，絕大多數(shù)人源溫和氣單胞菌有溶血素(hly)的編碼基因，目前國(guó)內(nèi)外已有關(guān)于人致病性溫和氣單胞菌溶血素基因的報(bào)道23,而引起水產(chǎn)動(dòng)物的病原溫和氣單胞菌尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，本項(xiàng)研究用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行菌體PC

38、R擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，分離菌可擴(kuò)增出大小約1470bp的特異性擴(kuò)增條帶，為病原溫和氣單胞菌毒力因子的深入研究提供基礎(chǔ)研究資料。參考文獻(xiàn): 1 李槿年，余為一，祖國(guó)掌.四株產(chǎn)色素溫和氣單胞菌的鑒定及其特性J.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2001，25(5):428-431.2 蔡完其，孫佩芳.羅非魚(yú)溫和氣單胞菌病的病原研究和藥敏試驗(yàn)J.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2002，9 (3)：223-246.3 Wahli T, Burr S E, Pugovkin D, Mueller O, Frey J. Aeromonas sobria, a causative agent of disease in farmed perc

39、h, Perca fluviatilis L. Journal of Fish Diseases, 2005,28,141-150.4 李槿年，魏梅芳，于道平.暗紋東方鲀“脫黏病”病原菌的分離鑒定J.水利漁業(yè)，2001，21(5):42-43.5 葉雪平,顧金華,楊廣智,等.牛蛙溫和氣單胞菌病病原及防治J.上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 9(1):78-80.6 孫佩芳，蔡完其.中華鱉溫和氣單胞菌病的病原研究J.淡水漁業(yè)，1998，28(4):3-5.7 王 玉，敖弟書(shū)，吳中明.大鯢感染溫和氣單胞菌的實(shí)驗(yàn)研究J.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，31（1）：6-10.8 潘秀文，桂劍峰，張瓊.野鴨溫和氣單胞菌及產(chǎn)堿假單胞菌的分離與鑒定J.中國(guó)家禽，2001，23(11): 11-12.9 孔繁德，黃印堯，吳文忠，等.兩株氣單胞菌的分離與鑒定J.中國(guó)獸醫(yī)科技，1997，27(2):23-24.10