化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法～——

1、一、總那么General Principle1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了化裝品微生物學(xué)檢驗(yàn)總那么.本標(biāo)準(zhǔn)適用于化裝品樣品的采集、保存、供檢樣品制備.2儀器和設(shè)備2,1天平.2.2 高壓滅菌器.2.3 振蕩器.2.4 三角瓶.2.5 玻璃珠.2.6 玻璃棒.2.7 刻度吸管.2.9 均質(zhì)器.2.10 恒溫水浴箱.2.11 采樣用具：不銹鋼勺,剪刀,開(kāi)罐器等.3培養(yǎng)基和試劑3.1 生理鹽水成分：氯化鈉8.5g蒸儲(chǔ)水加至1000 mL溶解后,分裝到加玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi),每瓶 90mL 103.43kPa(15 lb)20min 高 壓滅菌.3.2 SCDLP液體培養(yǎng)基成分：酪蛋白月東17g大豆蛋白月東3g氯化鈉

2、5g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g卵磷脂1g吐溫807g蒸儲(chǔ)水1000mL制法：先將卵磷脂在少量蒸儲(chǔ)水中加溫溶解后,再與其它成分混合,加熱溶解, 調(diào)pH為7.27.3 ,分裝,103.43kPa(15lb)20min 高壓滅菌.注意振蕩,使沉淀于 底層的吐溫80充分混合,冷卻至25c左右使用.注：如無(wú)酪蛋白月東和大豆蛋白月東,也可用多月東代替.3.3 滅菌液體石蠟.3.4 滅菌吐溫80.4樣品的采集及本卷須知4.1 所采集的樣品,應(yīng)具有代表性,一般視每批化裝品數(shù)量大小,隨機(jī)抽取相應(yīng)數(shù) 量的包裝單位.檢驗(yàn)時(shí),應(yīng)分別從兩個(gè)包裝單位以上的樣品中共取10g或10mL包裝量小于20g的樣品,采樣量應(yīng)適

3、量增加,其總量應(yīng)大于16g.4.2 供檢驗(yàn)樣品,應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài),進(jìn)口產(chǎn)品應(yīng)為市售包裝.容器不應(yīng) 有破裂,在檢驗(yàn)前不得翻開(kāi),預(yù)防樣品被污染.4.3 接到樣品后,應(yīng)立即登記,編寫(xiě)檢驗(yàn)序號(hào),并按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn).如不能及 時(shí)檢驗(yàn),樣品應(yīng)放在室溫陰涼枯燥處,不要冷藏或冷凍.4.4 假設(shè)只有一份樣品而同時(shí)需做多種分析,如微生物、毒理、化學(xué)等,應(yīng)先做微生 物檢驗(yàn),再將剩余樣品做其它分析.4.5 在檢驗(yàn)過(guò)程中,從翻開(kāi)包裝到全部檢驗(yàn)操作結(jié)束,均須預(yù)防微生物的再污染和 擴(kuò)散,所用采樣用具、器皿及材料均應(yīng)事先滅菌,全部操作應(yīng)在無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行,或 在相應(yīng)條件下,按無(wú)菌操作規(guī)定進(jìn)行.5供檢樣品的制備5.1 液

4、體樣品5.1.1 水溶性的液體樣品,量取 10mL加到90mL滅菌生理鹽水中,混勻后,制成1:10檢液.5.1.2 油性液體樣品,取樣品10mL先加5mL滅菌液體石蠟混勻,再加 10mL滅菌 的吐溫80,在40 c44c水浴中振蕩混合 10min,參加滅菌的生理鹽水 75mL在 40C44c水浴中預(yù)溫,在40c44c水浴中乳化,制成1:10的懸液.5.2 膏、霜、乳劑半固體狀樣品5.2.1 親水性的樣品,稱(chēng)取10g,加到裝有玻璃珠及90mL滅菌生理鹽水的三角瓶中, 充分振蕩混勻,靜置15min.取其上清液作為1:10的檢液.5.2.2 疏水性樣品,稱(chēng)取10g,放到滅菌的研缽中,加10mL滅菌液

5、體石蠟,研磨 成粘稠狀,再參加10mL滅菌吐溫80,研磨待溶解后,加70mL滅菌生理鹽水,在40c 44c水浴中充分混合,制成1:10檢液.5.3 固體樣品,稱(chēng)取10g,加到90mL滅菌生理鹽水中,充分振蕩混勻,使其分散 混懸,靜置后,取上清液作為 1:10的檢液.如有均質(zhì)器,上述水溶性膏、霜、粉劑等,可稱(chēng) 10g樣品參加90mL滅菌生理鹽 水,土質(zhì)1min2min;疏水性膏、霜及眉筆、口紅等,稱(chēng) 10g樣品,力口 10mL滅菌 液體石蠟,10mL滅菌吐溫80, 70mL滅菌生理鹽水,均質(zhì) 3min5min.二、菌落總數(shù)Aerobic Bacterial Count1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了化裝品中菌

6、落總數(shù)的檢驗(yàn)方法.本標(biāo)準(zhǔn)適用于化裝品菌落總數(shù)的測(cè)定.2定義本標(biāo)準(zhǔn)采用以下定義菌落總數(shù)(aerobic bacterial count)是指化裝品檢樣經(jīng)過(guò)處理,在一定條件下 培養(yǎng)后(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、 pH值、需氧性質(zhì)等),1g(1mL)檢樣 中所含菌落的總數(shù).所得結(jié)果只包括一群本方法規(guī)定的條件下生長(zhǎng)的嗜中溫的需氧 性菌落總數(shù).測(cè)定菌落總數(shù)便于判明樣品被細(xì)菌污染的程度,是對(duì)樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)總評(píng)價(jià)的 綜合依據(jù).3儀器和設(shè)備3.1 三角瓶3.2 量筒.3.3 pH計(jì)或精密pH試紙.3.4 高壓滅茵器.3.5 試管.3.6 平皿：直徑9cm3.7 刻度吸管：10mL、2mL 1mL3.8

7、 酒精燈.3.9 恒溫培養(yǎng)箱.3.10 放大鏡.4培養(yǎng)基和試劑4.1 生理鹽水：見(jiàn)總那么中 3.1 04.2 卵磷脂、吐溫80一營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基3g4.2.1 成分： 蛋白陳20g牛肉膏5g氯化鈉瓊脂15g卵磷脂1g吐溫807g蒸儲(chǔ)水1000mL4.2.2 制法：先將卵磷脂加到少量蒸儲(chǔ)水中,加熱溶解,參加吐溫80,將其他成分(除瓊脂外)加到其余的蒸儲(chǔ)水中,溶解.參加已溶解的卵磷脂、吐溫80,混勻,調(diào)pH值為7.17.4 ,參加瓊脂,103.43kPa(15 lb)20min 高壓滅菌,儲(chǔ)存于冷暗 處備用.4.3 0.5% 氯化三苯四氮口坐(2,3,5-triphenyl terazolium c

8、hloride,TTC)成分：TTC0.5g蒸儲(chǔ)水100mL溶解后過(guò)濾,103.43kPa(15 lb)20min高壓滅菌,裝于棕色試劑瓶,置 4c冰箱 備用.5操作步驟5.1 用滅菌吸管吸取1:10稀釋的檢液2mL分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi),每皿1mL另取1mL注入到9mL滅菌生理鹽水試管中注意勿使吸管接觸液面,更換一支吸管, 并充分混勻,制成1:100檢液.吸取2mL分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi),每皿1mL如樣品含菌量高,還可再稀釋成1:1000, 1:10000,等,每種稀釋度應(yīng)換1支吸管.5.2 將融化并冷至45c50c的卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內(nèi),每 皿名勺15mL隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平

9、皿,使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻,待瓊脂凝固后,翻轉(zhuǎn)平 皿,置37c培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h0另取一個(gè)不加樣品的滅菌空平皿,參加約15mL卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,待瓊脂凝固后,翻轉(zhuǎn)平皿,置37c培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h,為空白對(duì)照.5.3 為便于區(qū)別化裝品中的顆粒與菌落,可在每100mL卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂中參加1mL0.5%勺TTC溶液,如有細(xì)菌存在,培養(yǎng)后菌落呈紅色,而化裝品的顆粒顏 色無(wú)變化.6菌落計(jì)數(shù)方法先用肉眼觀察,點(diǎn)數(shù)菌落數(shù),然后再用放大510倍的放大鏡檢查,以防遺漏.記下各平皿的菌落數(shù)后,求出同一稀釋度各平皿生長(zhǎng)的平均菌落數(shù).假設(shè)平皿中有連 成片狀的菌落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí),該平皿不

10、宜計(jì)數(shù).假設(shè)片狀菌落不到平皿中的一半,而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻,那么可將此半個(gè)平皿菌落計(jì)數(shù)后乘以2,以代表全皿菌落數(shù).7菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告方法7.1 首先選取平均菌落數(shù)在 30300個(gè)之間的平皿,作為菌落總數(shù)測(cè)定的范圍. 當(dāng) 只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí), 即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)見(jiàn)表 1中例1 07.2 假設(shè)有兩個(gè)稀釋度,其平均菌落數(shù)均在30300個(gè)之間,那么應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之 比值來(lái)決定,假設(shè)其比值小于或等于 2,應(yīng)報(bào)告其平均數(shù),假設(shè)大于 2那么報(bào)告其中稀釋 度較低的平皿的菌落數(shù)見(jiàn)表1中例2及例3 07.3 假設(shè)所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于以稀釋倍數(shù)報(bào)告之見(jiàn)表1中例4 o7

11、.4 假設(shè)所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于以稀釋倍數(shù)報(bào)告之見(jiàn)表1例5.7.5 假設(shè)所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在個(gè),而相鄰的另一稀釋度小于30個(gè)時(shí),倍數(shù)報(bào)告之見(jiàn)表1中例60300個(gè),那么應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘30個(gè),那么應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘30300個(gè)之間,其中一個(gè)稀釋度大于 300那么以接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋7.6 假設(shè)所有的稀釋度均無(wú)菌生長(zhǎng),報(bào)告數(shù)為每g或每mL小于10CFU7.7 菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告,菌落數(shù)在 10以?xún)?nèi)時(shí),按實(shí)有數(shù)值報(bào)告之,大于 100時(shí),采 用二位有效數(shù)字,在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值,應(yīng)以四舍五入法計(jì)算.為了縮短數(shù)字后面零的個(gè)數(shù),可用10的指數(shù)來(lái)表示見(jiàn)表

12、1報(bào)告方式欄.在報(bào)告菌落數(shù)為“不 可計(jì)時(shí),應(yīng)注明樣品的稀釋度.表1菌落計(jì)數(shù)結(jié)果及報(bào)告方式例不同稀釋度平均菌兩稀釋菌落總數(shù)報(bào)告方式次落數(shù)度CFU/mLCFU/mL或10-110一310-2菌數(shù)之比或CFU/gCFU/g113651641640016000 或 1.6 X20104227602951.63800038000 或 3.8 X46104328902712.22710027000 或 2.7 X601044不可計(jì)4650513000510000 或 5.1513X 10552711270270 或 2.7 X10256不可計(jì)3053050031000 或 3.1 X1210470001X

13、10V 10火CFU菌落形成單位三、糞大腸菌群Fecal Coliforms1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了化裝品中糞大腸菌群的檢驗(yàn)方法.本標(biāo)準(zhǔn)適用于化裝品中糞大腸菌群的檢驗(yàn).2定義本標(biāo)準(zhǔn)采用以下定義糞大腸菌群(Fecal coliforms)系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌,在44.5 C培養(yǎng)24h48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣.該菌來(lái)自人和溫血?jiǎng)游锛S便,是重要的衛(wèi)生指示菌.3儀器3.1 恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱：44 c 0.5 03.2 溫度計(jì).3.3 顯微鏡.3.4 載玻片3.5 接種環(huán).3.6 電爐.3.7 三角瓶.3.8 試管.3.9 小倒管.3.10 pH計(jì)或pH試紙.3.11 高壓滅茵器

14、.3.12 刻度吸管：10mL 2mL 1mL3.13 平皿.4 培養(yǎng)基和試劑4.1 雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基成分： 蛋白月東40g10g豬膽鹽乳糖10g0.4%漠甲酚紫水溶液5mL蒸儲(chǔ)水1000mL制法：將蛋白月東、膽鹽及乳糖溶解于蒸儲(chǔ)水中,調(diào) pH到7.4,參加0.4%漠甲酚 紫水溶液5mL混勻,分裝試管每支試管中加一個(gè)小倒管.68.95kPa 10 lb20min 滅菌.4.2 伊紅美蘭EMB瓊脂成分：蛋白月東10g乳糖10g磷酸氫二鉀2g瓊脂20g2%伊紅水溶液20mL0.5% 美藍(lán)水溶液13mL蒸儲(chǔ)水1000mL制法：先將瓊脂加到 900mL蒸儲(chǔ)水中,加熱溶解,然后參加磷酸氫二鉀、蛋白月東

15、,混勻,使之溶解.再以蒸儲(chǔ)水補(bǔ)足至1000mL校正pH值為7.27.4,分裝于三角瓶?jī)?nèi),103.43kPa15 lb15min高壓滅菌備用.臨用時(shí)參加乳糖并加熱融化瓊脂.冷至60 c左右無(wú)菌操作參加滅菌的伊紅美藍(lán)溶液,搖勻.傾注平皿備用.4.3 蛋白月東水作靛基質(zhì)試驗(yàn)用成分：蛋白月東或胰蛋白月東氯化鈉蒸儲(chǔ)水制法：將上述成分加熱融化, lb15min高壓滅菌.4.4 靛基質(zhì)試劑柯凡克試劑：將酸 25mL20g103.43kPa(1575mL戊醇中,然后緩慢參加濃鹽5g1000mL調(diào)pH值為7.07.2 ,分裝小試管,5g對(duì)二甲氨基苯甲醛溶解于試驗(yàn)方法：接種細(xì)菌于蛋白陳水中,于 440.5培養(yǎng)24

16、h0沿管壁加柯凡克 試劑0.30.5mL,輕搖試管.陽(yáng)性者于試劑層顯深玫瑰紅色.注：蛋白月東應(yīng)含有豐富的色氨酸,每批蛋白月東買(mǎi)來(lái)后,應(yīng)先用菌種鑒定后 方可使用.4.5 革蘭氏染色液:4.5.1 染液制備4.5.1.1 結(jié)晶紫染色液：結(jié)晶紫1g95% 乙醇20mL1%草酸鏤水溶液80mL將結(jié)晶紫溶于乙醇中,然后與草酸鏤溶液混合.4.5.1.2 革蘭氏碘液：碘1g碘化鉀2g蒸儲(chǔ)水加至300mL將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合,參加蒸儲(chǔ)水少許,充分振搖,待完全溶解后,再加 蒸儲(chǔ)水至300mL4.5.1.3 脫色液：95充醇.a.沙黃復(fù)染液:沙黃0.25g95% 乙醇10mL蒸儲(chǔ)水90mL將沙黃溶解于乙醇中,然

17、后用蒸儲(chǔ)水稀釋.b.稀石碳酸復(fù)紅液：稱(chēng)取堿性復(fù)紅10g,研細(xì),加95%TJ1 100mL放置過(guò)夜,濾紙過(guò)濾.取該液10mL加5%ff碳酸水溶液90mL混合,即為石碳酸復(fù)紅液.再取 此液10mL加水90mL即為稀石碳酸復(fù)紅液.4.5.2 染色法4.5.2.1 將涂片在火焰上固定,滴加結(jié)晶紫染色液,染1min,水洗.4.5.2.2 滴加革蘭氏碘液,作用1min,水洗.4.5.2.3 滴加95充醇脫色,約30s,或?qū)⒁掖嫉螡M整個(gè)涂片,立即傾去,再用乙 醇滴滿整個(gè)涂片,脫色10s,水洗.4.5.2.4 滴加復(fù)染液,復(fù)染1min,水洗,待干,鏡檢.革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色,革蘭氏陰性菌呈紅色注：如用1:10稀

18、釋石碳酸復(fù)紅染色液作復(fù)染,復(fù)染時(shí)間僅需10s.5操作步驟5.1 取10mL 1:10稀釋的檢液,加到10mL雙倍濃度的乳糖膽鹽培養(yǎng)基中,置 44C 0.5 C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h48h,如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣,那么報(bào)告為糞大腸菌群陰性.5.2 如產(chǎn)酸產(chǎn)氣,劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上,置37c培養(yǎng)18 h24 h.同時(shí)取該培養(yǎng)液12滴接種到蛋白月東水中,置 44 c 0.5 C培養(yǎng)24h.經(jīng)培養(yǎng)后,在上述平板上觀察有無(wú)典型菌落生長(zhǎng).糞大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂 培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色,圓形,邊緣整潔,外表光滑濕潤(rùn),常具有金屬光 澤.也有的呈紫黑色,不帶或略帶金屬光澤,或粉紫色,中央較深的菌落,亦常為

19、 糞大腸菌群,應(yīng)注意挑選.5.3 挑取上述可疑菌落,涂片作革蘭氏染色鏡檢.5.4 在蛋白月東水培養(yǎng)液中,參加靛基質(zhì)試劑約0.5mL,觀察靛基質(zhì)反響.陽(yáng)性者液面呈玫瑰紅色；陰性反響液面呈試劑本色.6檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告根據(jù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,平板上有典型菌落,并經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性短桿菌,靛基質(zhì)試驗(yàn)陽(yáng)性,那么可報(bào)告被檢樣品中檢出糞大腸菌群.四、綠膿桿菌Pseudomonas Aeruginosa1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了化裝品中綠膿桿菌的檢驗(yàn)方法.本標(biāo)準(zhǔn)適用于化裝品中綠膿桿菌的檢驗(yàn).2定義本標(biāo)準(zhǔn)采用以下定義.綠膿中f菌(Pseudomonas aeruginosa)屬于假單胞菌屬,為革蘭氏陰性桿菌,氧 化酶陽(yáng)性,能

20、產(chǎn)生綠膿菌素.此外還能液化明膠,復(fù)原硝酸鹽為亞硝酸鹽,在 42 C 條件下能生長(zhǎng).該菌對(duì)人有致病力,可使傷處化膿,引起敗血癥等.3儀器3.1 恒溫培養(yǎng)箱：37 、42 Co3.3 試管3.4 平皿.3.5 刻度吸管：10mL 2mL 1mL3.6 顯微鏡.3.7 載玻片.3.8 接種針、接種環(huán).3.9 電爐.3.10 高壓滅茵器.4 培養(yǎng)基和試劑4.1 SCDLP液體培養(yǎng)基見(jiàn)總那么中3.2.4.2 十六烷基三甲基漠化鏤培養(yǎng)基成分：牛肉膏3g5g氯化鈉十六烷基三甲基漠化鏤 0.3g瓊脂20g蒸儲(chǔ)水1000mL制法：除瓊脂外,將上述成分混合加熱溶解,調(diào) pH為7.47.6 ,參加瓊脂, 68.95

21、kPa (10 lb)20min滅菌后,制成平板備用.4.3 乙酰胺培養(yǎng)基成分： 乙酰胺10g氯化鈉5g無(wú)水磷酸氫二鉀1.39g無(wú)水磷酸二氫鉀0.73g硫酸鎂(MgSO 7HO)0.5g酚紅0.012g(1.2% 溶液 1mD蒸儲(chǔ)水1000mL制法：除瓊脂和酚紅外,將其它成分加到蒸儲(chǔ)水中,加熱溶解,調(diào)參加瓊脂、酚紅,103.43kPa(15 lb)20min 高壓滅菌后,制成平板備用4.4 綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基pH為 7.2 ,成分：蛋白月東20g氯化鎂1.4g硫酸鉀10g瓊脂18g甘油(化學(xué)純)10g蒸儲(chǔ)水1000mL制法：將蛋白月東、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸儲(chǔ)水中, 加溫使其溶解, 參加瓊脂和

22、甘油,加熱溶解,分裝于試管內(nèi),68.95kPa(10 lb)20min制成斜面?zhèn)溆?4.5 明膠培養(yǎng)基調(diào)pH至7.4 , 身壓火菌后,成分：牛肉膏3g5g蛋白陳明膠120g蒸儲(chǔ)水1000mL制法：取各成分加到蒸儲(chǔ)水中浸泡 20min,隨時(shí)攪拌加溫使之溶解,調(diào)pH至7.4 , 分裝于試管內(nèi),經(jīng) 68.95kPa(10 lb)20min 滅菌后,直立制成高層備用.4.6 硝酸鹽蛋白月東水培養(yǎng)基成分：蛋白月東10g酵母浸膏3g硝酸鉀2g亞硝酸鈉0.5g蒸儲(chǔ)水1000mL制法：將蛋白月東和酵母浸膏加到蒸儲(chǔ)水中,加熱使之溶解,調(diào) pH為7.2,煮沸 過(guò)濾后補(bǔ)足液量,力口入硝酸鉀和亞硝酸鈉,溶解混勻,分裝

23、到加有小倒管的試管中, 68.95kPa(10 lb)20min 滅菌后備用.10g成分：蛋白月東牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g蒸儲(chǔ)水1000mL制法：除瓊脂外,將其余成分溶解于蒸儲(chǔ)水中,調(diào) pH為7.27.4,參加瓊脂, 加熱溶解,分裝試管,103.43kPa(15 lb)20min 高壓滅菌后,制成斜面?zhèn)溆?5操作步驟5.1 增菌培養(yǎng)：取1:10樣品稀釋液10mL加到90mL SCDL敲體培養(yǎng)基中,置 37C 培養(yǎng)18h24h.如有綠膿桿菌生長(zhǎng),培養(yǎng)液外表多有一層薄菌膜,培養(yǎng)液常呈黃綠 色或藍(lán)綠色.5.2 別離培養(yǎng)：從培養(yǎng)液的薄膜處挑取培養(yǎng)物,劃線接種在十六烷基三甲基漠化鏤瓊脂平板上,置3

24、7c培養(yǎng)18h24h.凡綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上, 其菌落扁平無(wú)定型, 向周邊擴(kuò)散或略有蔓延,外表濕潤(rùn),菌落呈灰白色,菌落周?chē)囵B(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶 性色素,此培養(yǎng)基選擇性強(qiáng),大腸艾希氏菌不能生長(zhǎng),革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)較差.在缺乏十六烷基三甲基漠化鏤培養(yǎng)基時(shí)也可用乙酰胺培養(yǎng)基進(jìn)行別離,將菌液 劃線接種于平板上,放37c培養(yǎng)24h,綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,菌落扁平, 邊緣不整,菌落周?chē)囵B(yǎng)基略帶粉紅色,其它菌不生長(zhǎng).5.3 染色鏡檢：挑取可疑的菌落,涂片,革蘭氏染色,鏡檢為革蘭氏陰性者應(yīng)進(jìn)行 氧化酶試驗(yàn).5.4 氧化酶試驗(yàn)：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi),用無(wú)菌玻璃棒挑取綠膿桿菌可疑菌落涂在濾

25、紙片上,然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基對(duì)苯二胺試液,在15s30s之內(nèi),出現(xiàn)粉紅色或紫紅色時(shí),為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性；假設(shè)培養(yǎng)物不 變色,為氧化酶試驗(yàn)陰性.5.5 綠膿菌素試驗(yàn)：取可疑菌落 23個(gè),分別接種在綠膿菌素測(cè)定培養(yǎng)基上,置 37c培養(yǎng)24h,參加氯仿3m&5mL充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于氯仿液 內(nèi),待氯仿提取液呈藍(lán)色時(shí),用吸管將氯仿移到另一試管中并參加1mol/L的鹽酸1mL左右,振蕩后,靜置片刻.如上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時(shí)為陽(yáng)性,表 示被檢物中有綠膿菌素存在.5.6 硝酸鹽復(fù)原產(chǎn)氣試驗(yàn)：挑取可疑的綠膿桿菌純培養(yǎng)物,接種在硝酸鹽蛋白月東水 培養(yǎng)基中,置37c培養(yǎng)24h

26、,觀察結(jié)果.凡在硝酸鹽蛋白月東水培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中 有氣體者,即為陽(yáng)性,說(shuō)明該菌能復(fù)原硝酸鹽,并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)?5.7 明膠液化試驗(yàn),取綠膿桿菌可疑菌落的純培養(yǎng)物,穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi), 置37c培養(yǎng)24h,取出放冰箱10min30min,如仍呈溶解狀時(shí)即為明膠液化試驗(yàn)陽(yáng) 性；如凝固不溶者為陰性.5.8 42 C生長(zhǎng)試驗(yàn)：挑取可疑的綠膿桿菌純培養(yǎng)物, 接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上, 放在4142c培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24h48h,綠膿桿菌能生長(zhǎng),為陽(yáng)性,而近似的熒光 假單胞菌那么不能生長(zhǎng).被檢樣品經(jīng)增菌別離培養(yǎng)后,在別離平板上有典型或可疑菌落生長(zhǎng),經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌,氧化酶及綠膿菌素試驗(yàn)

27、皆為陽(yáng)性者,即可報(bào)告被檢樣品中檢出綠膿桿菌；如綠膿菌素試驗(yàn)陰性而液化明膠、硝酸鹽復(fù)原產(chǎn)氣和42 c生長(zhǎng)試驗(yàn)三者皆為陽(yáng)性時(shí),仍可報(bào)告被檢樣品中檢出綠膿桿菌.五、金黃色葡萄球菌Staphylococcus Aureus1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了化裝品中金黃金色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法.本標(biāo)準(zhǔn)適用于化裝品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn).2定義本標(biāo)準(zhǔn)采用以下定義金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 為革蘭氏陽(yáng)性球菌,呈葡萄狀排列, 無(wú)芽胞,無(wú)莢膜,能分解甘露醇,血漿凝固酶陽(yáng)性.該菌是葡萄球菌中對(duì)人類(lèi)致病力最強(qiáng)的一種,能引起人體局部化膿性病灶,嚴(yán) 重時(shí)可導(dǎo)致敗血癥.3儀器和設(shè)備3.1 顯微鏡.3.3

28、離心機(jī).3.4 刻度吸管：1mL、5mL 10mL3.5 試管.3.6 載玻片.3.7 酒精燈.4 培養(yǎng)基和試劑4.1 SCDLP 液體培養(yǎng)基見(jiàn)總那么中3.2.4.2 Baird Parker 氏培養(yǎng)基成分：胰蛋白月東10g牛肉膏5g酵母浸膏1g丙酮酸鈉10g氯化鋰(LiCl 6HO)5g瓊脂20g蒸儲(chǔ)水950mLpH 7.0 0.2增菌劑的配制：30%黃鹽水50mL與除菌過(guò)濾的1燉硫酸鉀溶液10mL混合, 保存于冰箱內(nèi).制法：將各成分加到蒸儲(chǔ)水中,加熱煮沸完全溶解,校正pH.分裝每瓶95mL103.43kPa高壓滅菌15min.臨用時(shí)加熱溶化瓊脂培養(yǎng)基,每 95mL參加預(yù)熱至50 C 的卵黃

29、亞硫酸鉀增菌劑 5mL搖勻后制成平板.培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的.使用前 在冰箱貯存不得超過(guò)48h.4.3 血瓊脂培養(yǎng)基成分：營(yíng)養(yǎng)瓊脂100mL脫纖維羊血或兔血 10mL制法：將營(yíng)養(yǎng)瓊脂加熱融化,待冷至50 c左右無(wú)菌操作參加脫纖維羊血,搖勻,制成平板,置冰箱內(nèi)備用.4.4 甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基成分：蛋白月東10g氯化鈉5g甘露醇10g牛肉膏5g0.2%麝香草酚藍(lán)溶液12mL蒸儲(chǔ)水1000mL制法：將蛋白月東、氯化鈉、牛肉膏加到蒸儲(chǔ)水中,加熱溶解,調(diào) pH7.4,參加 甘露醇和指示劑,混勻后分裝試管中,68.95kPa(10 lb) 20min滅菌備用.4.5 兔(人)血漿制備取3.8% 檸檬酸鈉溶液

30、,103.43kPa(15 lb) 30min高壓滅菌,1份加兔(人)全血4份,混勻靜置；2000rpm3000 rpm離心3min5min.血球下沉,取上面血漿.4.6 無(wú)菌液體石蠟.5操作步驟5.1 增菌：取1:10稀釋的樣品10mL接種到90mL SCDLP液體培養(yǎng)基中,置 37 C 培養(yǎng)箱,培養(yǎng)24ho5.2 別離：自上述增菌培養(yǎng)液中,取12接種環(huán),劃線接種在Baird Parker平板, 如無(wú)此培養(yǎng)基也可劃線接種到血瓊脂平板,置37c培養(yǎng)24h48h.在血瓊脂平板上菌落呈金黃色,大而突起,圓形,不透明,外表光滑,周?chē)腥苎?在Baird Parker 平板上為圓形,光滑,凸起,濕潤(rùn)

31、,直徑為2mnr 3mm顏色呈灰色到黑色,邊緣為淡色,周?chē)鸀橐换鞚釒?在其外層有一透明帶.用接種針接觸菌落似有奶油樹(shù)膠的 軟度.偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類(lèi)似菌落,但無(wú)混濁帶及透明帶.挑取單個(gè)菌落分 純?cè)谘傊桨迳?置 37c培養(yǎng)24h05.3 染色鏡檢：挑取分純菌落,涂片,進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢.金黃色葡萄球菌為 革蘭氏陽(yáng)性菌,排列成葡萄狀,無(wú)芽胞,無(wú)夾膜,致病性葡萄球菌,菌體較小,直徑 約為 0.5 d m 111mo5.4 甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：取上述分純菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)基液面上參加2mmr 3mm的滅菌液體石蠟,置 37 c培養(yǎng)24h,金黃色葡萄球菌應(yīng)能發(fā)酵甘 露醇產(chǎn)酸.5.5 血漿凝固酶試驗(yàn)：吸取1:4新鮮血漿0.5mL,放入滅菌小試管中,參加待檢菌 24h肉湯培養(yǎng)物0.5mL.混勻,放37c恒溫箱或恒溫水浴中,每半小時(shí)觀察一次, 6h之內(nèi)如呈現(xiàn)凝塊即為陽(yáng)性.同時(shí)以血漿凝固酶陽(yáng)性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物及 肉湯培養(yǎng)基各0.5mL,分別參加滅菌