呫噸酮類化合物的合成

1、呫噸酮類化合物的合成及其與生物大分子的相互作用鄒 蘭 馬 林 汪 波*基金項目 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院第三屆創(chuàng)新化學(xué)實驗基金項目（批準號：02024）資助第一作者 鄒蘭（1980年出生），女，中山大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院應(yīng)用化學(xué)專業(yè)99級指導(dǎo)老師 汪波 Email：ceswb 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，有機化學(xué)研究所 廣州 510275摘要 合成了四個羥基呫噸酮類化合物，并通過紫外-可見光譜法初步研究了它們與-葡萄糖苷酶、酪氨酸酶、DNA三種生物大分子的相互作用。發(fā)現(xiàn)1,3-二羥基呫噸酮對-葡萄糖苷酶有顯著的抑制作用， 1-羥基-3-（2-（1-哌啶）乙氧基）呫噸酮則在2.5×10-

2、5mol/L濃度下對-葡萄糖苷酶略有激活作用，并且能與DNA能產(chǎn)生相互作用。四個化合物均對酪氨酸酶有一定的的抑制作用，有關(guān)作用的機制和動力學(xué)研究有待進一步進行。關(guān)鍵詞 呫噸酮類衍生物 -葡萄糖苷酶 酪氨酸酶 DNA 1 前言呫噸酮又叫二苯并-吡喃酮，它的衍生物廣泛存在于自然界中，是藥用植物的有效成分之一。由于呫噸酮類衍生物在其線形排列的三個環(huán)上具有酚性官能團，大多具有豐富的生物活性和藥用價值，如抗菌活性、抗炎活性、抗氧化活性和抗腫瘤活性等1?；衔锏纳锘钚砸话愫退鼈兣c生物大分子的相互作用如對某些酶活性的抑制作用或DNA的相互作用等密切相關(guān)的。因此，我們合成了四個有代表性結(jié)構(gòu)的呫噸酮類化合物并

3、初步研究了它們對-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶兩種酶的抑制作用以及與DNA的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1,3-二羥基呫噸酮5b對-葡萄糖苷酶有顯著的抑制作用， 1-羥基-3-（2-（1-哌啶）乙氧基）呫噸酮6b則在2.5×10-5mol/L濃度下對-葡萄糖苷酶略有激活作用，并且能與DNA能產(chǎn)生相互作用。四個化合物均對酪氨酸酶表現(xiàn)出一定的的抑制作用，有關(guān)作用的機制和動力學(xué)研究有待進一步進行。2 實驗2.1 材料和儀器a-葡萄糖苷酶、酪氨酸酶、小牛胸腺DNA、對硝基苯酚-a-葡萄糖苷、L-多巴購自Sigma公司；水楊酸、間苯二酚、間苯三酚、硫酸二甲酯、碳酸鉀、PPA等均為市售分析純試劑；N-氯乙基哌啶為

4、本實驗室制備。化合物結(jié)構(gòu)通過VARIAN UNITY INOVA-500核磁共振儀，VG ZAB-HS質(zhì)譜儀，Bruker公司Equinox FT-IR 55紅外光譜儀表征，熔點測定用毛細管法，溫度計未校正。2.2 方法羥基呫噸酮的合成：1-羥基呫噸酮（5a）：在50mL的圓底燒瓶中加入1.38g（0.01mol）水楊酸和1.11 g（0.01mol）間苯二酚，再加入15mLPPA，加熱攪拌，在油溫為180下反應(yīng)4h。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)體系倒入正在攪拌的冰水混合物中，形成混濁溶液。過濾，并用乙酸乙酯萃取濾液，濃縮濾液，與濾渣合并，使用體積比為35mL:4d石油醚-乙酸乙酯為洗脫劑進行柱層析分離

5、，得到淺黃綠色產(chǎn)物。熔點：140；文獻值2：149；MS（FAB）m/z：213（M+H）；IR（KBr）max（cm-1）: 3424, 3083, 2923, 2853, 1648, 1611, 1478, 1460, 1376, 1285, 1234, 1047, 814, 768；1H NMR（CDCl3）：12.64 (1H, s, 1-OH ), 8.28 (1H, dd, J = 2.0, 7.0 Hz, Ar-H ), 7.76 (1H, m, Ar-H ), 7.60 (1H, dd, J = 8.0, 8.5Hz, Ar-H ), 7.47 (1H, d, J = 8.0

6、Hz, Ar-H ), 7.40 (1H, m, Ar-H ), 6.93 (1H, d, J = 8.5 Hz, Ar-H ), 6.80 ( 1H, dd, J = 1.0, 8.0 Hz, Ar-H )。1，3-二羥基呫噸酮（5b）的合成： 稱取1.38 g（0.01mol）水楊酸和1.28g（0.01mol）間苯三酚，反應(yīng)及分離純化步驟同5a，柱層析洗脫劑為體積比為10:1的石油醚-乙酸乙酯。得到產(chǎn)物 0.46 g，淺黃綠色，產(chǎn)率23；熔點：251-252 ；文獻值3：256-258；MS（FAB）m/z：229（M+H）；IR（KBr）max（cm-1）:3330, 3078, 16

7、55, 1611, 1568, 1492, 1349, 1286, 1220, 1160, 826, 760；1H NMR（CD3COCD3）：12.92 (1H, s, 1-OH ), 9.89 (1H, br, 3-OH ), 8.21 (1H, m, Ar-H ), 7.85 (1H, m, Ar-H ), 7.55 (1H, m, Ar-H ), 7.47 (1H, m , Ar-H ), 6.45 (1H, d, J = 2.5 Hz, Ar-H ), 6.28 (1H, J = 2.5 Hz, Ar-H )。 羥基呫噸酮衍生物的合成： 1-羥基-3-甲氧基呫噸酮（6a）的合成：在2

8、5mL的圓底燒瓶中加入45.6 mg（0.2 mmol）化合物5a和40.0 mg（0.3 mmol）硫酸二甲酯，用丙酮完全溶解，再過量少許，加入K2CO3粉末276.0 mg。加熱攪拌，在油溫70下回流4h，反應(yīng)結(jié)束。過濾，濃縮濾液，使用體積比為35:1石油醚-乙酸乙酯進行柱層析分離，得到淺黃綠色產(chǎn)物。產(chǎn)率61.4；熔點：135；MS（FAB）m/z：243（M+H） IR（KBr）max（cm-1）: 3450, 3067, 3001, 2923, 2851, 1659, 1604, 1569, 1466, 1318, 1294, 1158, 1076, 823, 793, 757；1H

9、NMR（CD3OD）：8.20 (1H, d, J = 1.5, 8.0 Hz, Ar-H ), 7.80 (1H, m, Ar-H ), 7.51 (1H, dd, J = 0.5, 8.5 Hz, Ar- H ), 7.42 (1H, m, Ar-H ), 6.54 (1H, d, J = 2.0 Hz, Ar-H ), 6.34 (1H, d, J = 2.0 Hz, Ar-H )。1-羥基-3-（2-（1-哌啶）乙氧基）呫噸酮（6b）：稱取45.6mg（0.2 mmol）化合物5a和30.0 mg（0.2 mmol）N-氯乙基哌啶，按化合物6a步驟進行反應(yīng)和分離純化，使用體積比為10m

10、L:2mL:2mL:6d的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-氨水進行柱層析，得到黃色產(chǎn)物。產(chǎn)率58.4；熔點：114-116；MS（FAB）m/z：340（M+H） IR（KBr）max（cm-1）:3450, 3092, 3064, 2930, 1659, 1605, 1569, 1466, 1317, 1291, 1173, 1076, 1038, 830, 785, 759 ；1H NMR（CD3OD）：8.21 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, Ar-H ), 7.80 (1H, m, Ar-H ), 7.52 (1H, d, J = 8.5 Hz, Ar-H ), 7.43

11、(1H, m, Ar- H ), 6.58 (1H, d, J = 2.5 Hz, Ar-H ), 6.38 (1H, d, J = 2.5 Hz, Ar-H ), 4.27 ( 2H, t, J = 5.5 Hz, -OCH2 ), 2.88 (2H, t, J = 5.5 Hz, -CH2N=), 2.64 (4H, br, 哌啶2-H-) , 1.67 (4H, m, 哌啶3-H ), 1.52 (2H, m, 哌啶4-H ) 。呫噸酮類衍生物對-葡萄糖苷酶的抑制作用測定： 配制10mol/L的化合物5a、5b、6a和6b 溶液1mL。在1mL比色皿中加入30L濃度為0.6mg/mL的-

12、葡萄糖苷酶溶液和50L濃度為2 mmol/L的底物（對硝基糖苷）溶液，然后加入900L pH=6.8的磷酸鹽緩沖溶液，再分別取20L濃度為10 mol/L化合物5a、5b、6a和6b溶液，總體積為1 mL，搖勻，在400nm下測其光吸收值，參比液用pH=6.8的磷酸鹽緩沖溶液。比較同一條件下這四種化合物對-葡萄糖苷酶的抑制作用。 呫噸酮類衍生物對酪氨酸酶的抑制作用測定：配制5 mol/L的化合物5a、5b、6a和6b 溶液1 mL。在1 mL比色皿中加入20L 濃度為0.5 mg/mL的酪氨酸酶溶液和100L濃度為 20 mmol/L的底物（L-多巴）溶液，然后加入830L pH=6.8的磷酸

13、鹽緩沖溶液，再分別取50L濃度為5 mol/L的化合物5a、5b、6a和6b溶液，總體積為1 mL，搖勻，在475nm下測其光吸收值，參比液用pH=6.8的磷酸鹽緩沖溶液。比較同一條件下這四種化合物對酪氨酸酶的抑制作用。呫噸酮類衍生物與DNA的相互作用測定：在1 mL比色皿中加入5L、5mmol/L的6b溶液，然后分別加入0，50，150，300L的濃度為9.47×10-4mol/L的小牛胸腺DNA的pH=7.0的tris-HCl緩沖溶液。再加入相應(yīng)體積的pH=7.0的tris-HCl緩沖溶液補齊至1mL。搖勻，在230-550nm下測其吸收曲線。同樣依次測定5a、5b和6a與DNA

14、的相互作用。參比液用含有相應(yīng)DNA濃度的pH=7.0的tris-HCl緩沖溶液。3 結(jié)果與討論3.1 羥基呫噸酮的合成呫噸酮類化合物由于具有良好的生理活性，其合成受到廣泛關(guān)注。2002年胡利紅、覃章蘭對經(jīng)典的呫噸酮類化合物的合成方法進行了綜述1，主要分為兩步法和一步法兩種。其中一步法常用2-羥基苯甲酸或酯與苯酚類化合物混合，在PPA、二苯醚、ZnCl2/POCl3作用下加熱一步生成呫噸酮類化合物。本文采用一步加熱合成法，以水楊酸和均苯三酚或間苯二酚為原料，PPA為催化劑合成了1-羥基呫噸酮（5a）和1, 3-二羥基呫噸酮（5b）。并對合成5b的反應(yīng)條件進行了探索，提高反應(yīng)溫度有利于提高產(chǎn)率，1

15、40反應(yīng)4h，產(chǎn)率僅為5.6%，180反應(yīng)4h，產(chǎn)率提高到20%。同時我們嘗試了微波條件下的反應(yīng)，結(jié)果反應(yīng)時間減少到7分鐘，產(chǎn)率為23%。3.2 成醚反應(yīng)呫噸酮類化合物的1-羥基和羰基與文獻報道的一些抗腫瘤藥物的活性中心具有類似結(jié)構(gòu)，參考抗腫瘤作用的Cheng氏三點作用理論4，我們設(shè)計在3-羥基上引入含氮功能基，并與簡單甲基醚形成對比。因此利用成醚反應(yīng)，分別與硫酸二甲酯和N-氯乙基哌啶反應(yīng)，合成了1-羥基-3-甲氧基呫噸酮6a和1-羥基-3-（2-（1-哌啶）乙氧基）呫噸酮6b。以上已合成的四個化合物的結(jié)構(gòu)經(jīng)過質(zhì)譜（MS）、核磁共振譜（1H NMR）和紅外光譜（IR）等得以確證。其中6b未見文

16、獻報道。3.3 呫噸酮類衍生物對-葡萄糖苷酶的抑制作用：圖1 呫噸酮類衍生物對-葡萄糖苷酶的抑制作用 將合成的四個化合物按照所述的方法進行-葡萄糖苷酶的抑制實驗，以吸收強度對時間作圖，如圖1。實驗結(jié)果表明化合物5b對-葡萄糖苷酶有較好的抑制效果，化合物5a和6a對-葡萄糖苷酶基本上沒有抑制作用，其測量曲線與基線基本重合，而化合物6b對-葡萄糖苷酶有一定的激活作用。有關(guān)化合物5b和6b對-葡萄糖苷酶的抑制和激活機制將進一步進行研究和確證。3.4 呫噸酮類衍生物對酪氨酸酶的抑制作用：圖圖 2 呫噸酮類衍生物對酪氨酸酶的抑制作用目前發(fā)現(xiàn)的最有效的酪氨酸酶抑制劑例如曲酸、含羞成年堿等5，它們的結(jié)構(gòu)都含

17、有相鄰的羥基和羰基，根據(jù)所合成的四個化合物的結(jié)構(gòu)，估計它們對酪氨酸酶應(yīng)該也有抑制作用。將合成的四個化合物按照所述的方法進行酪氨酸酶的抑制實驗，以吸收強度對時間作圖，如圖2所示。實驗結(jié)果表明四個化合物對酪氨酸酶均有一定的抑制作用。關(guān)于它們的作用機制有待于進一步的深入研究。3.5 呫噸酮類衍生物與DNA的相互作用： 將合成的四個化合物按照所述的方法進行DNA的相互作用實驗，以吸收強度對波長做吸收曲線。實驗結(jié)果表明化合物6b與DNA能發(fā)生較好的相互作用，如圖3。由圖可看出，隨著DNA濃度的增加，吸收曲線的峰值減小，說明化合物6b與DNA發(fā)生了相互作用，產(chǎn)生了減色效應(yīng)，而且發(fā)生了一定的紅移。可能原因是

18、化合物6b符合cheng氏三點作用理論，它含有羰基、羥基以及2-（1-哌啶）乙氧基三個結(jié)合點，而且含有芳香環(huán)大平面，可能與DNA發(fā)生作用。我們將會對它們的作用機制做進一步的研究。圖3 化合物6b與DNA的相互作用致謝 本論文是在中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院第三屆創(chuàng)新化學(xué)實驗基金項目的資助下完成的，特此表示感謝。 參 考 文 獻1 胡利紅，覃章蘭. 呫噸2 .Res., India,1954,13,B:3982-39854 古煉權(quán)，許家喜，段玉峰. 生物化學(xué). 高等教育出版社，2000年7月第一版，第四章：酶化學(xué)，105頁5 Shiino M.,Watanabe Y.,Umezawa K.Synthesie of N-substituted N-nitrosohydroxylamines as inhibitors of mushroom tyrosinase. Bioorganic & Medicinal Chemistry,2001,9,1233-1240Synthesis and interaction with biological molecules of xanthone derivativesZOU, Lan MA, Lin