動(dòng)物肝臟中DNA的提取及檢測試驗(yàn)報(bào)告

1、動(dòng)物肝臟中DNA勺提取及檢測一、前言脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸（DNA ,為英文Deoxyribo nucleic acid的縮寫），又稱去氧核糖核酸，是脫氧核糖核酸染色體的主要化學(xué)成分， 同時(shí)也 是組成基因的材料。有時(shí)也被稱為“遺傳微?！保蚴窃诜敝尺^程 中，父代會(huì)把它們自己DNA的一部分復(fù)制傳遞到子代中，從而完成 性狀的傳播。DNA是高分子聚合物，DNA溶液為高分子溶液，具有很高的粘 度，可被甲基綠染成綠色。DNA對(duì)紫外線（260nm ）有吸收作用， 利用這一特性，可以對(duì)DNA進(jìn)行含量測定。當(dāng)核酸變性時(shí)，吸光度 升高，稱為增色效應(yīng)；當(dāng)變性核酸重新復(fù)性時(shí)，吸光度又會(huì)恢復(fù)到原 來的水平。較高溫

2、度、有機(jī)溶劑、酸堿試劑、尿素、酰胺等都可以引 起DNA分子變性，即DNA雙鏈堿基間的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解 開一也稱為DNA的解螺旋。在細(xì)胞內(nèi)，DNA能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，整組染色體則統(tǒng) 稱為染色體組。對(duì)于人類而言，正常的體細(xì)中含有46條染色體。染色體在細(xì)胞分裂之前會(huì)先在分裂間期完成復(fù)制，細(xì)胞分裂間期又可劃 分為：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后 期。對(duì)于真核生物，如動(dòng)物、植物及真菌而言，染色體主要存在于細(xì) 胞核內(nèi)；而對(duì)于原核生物，如細(xì)菌而言，則主要存在于細(xì)胞質(zhì)中的擬 核內(nèi)。染色體上的染色質(zhì)蛋白，如組織蛋白，能夠?qū)?DNA進(jìn)行組織 并壓縮，以幫助DNA與其他蛋

3、白質(zhì)進(jìn)行交互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的 轉(zhuǎn)錄。脫氧核糖核酸的結(jié)構(gòu)DNA的結(jié)構(gòu)：DNA的結(jié)構(gòu)一般可劃分為一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、 三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)四個(gè)水平。DNA是一種長鏈聚合物，組成單位為四種脫氧核苷酸，即腺嘌 呤脫氧核苷酸（dAMP脫氧腺苷）、胸腺嘧啶脫氧核苷酸（dTMP脫 氧胸苷）、胞嘧啶脫氧核苷酸（dCMP脫氧胞苷）、鳥嘌呤脫氧核 苷酸（dGMP脫氧鳥苷）。而脫氧核糖（五碳糖）與磷酸分子借由 酯鍵相連，組成其長鏈骨架，排列在外側(cè)，四種堿基排列在內(nèi)側(cè)。每 個(gè)糖分子都與四種堿基里的其中一種相連，這些堿基沿著DNA長鏈所排列而成的序列，可組成遺傳密碼，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。讀取密碼 的過程稱為轉(zhuǎn)錄，是以D

4、NA雙鏈中的一條單鏈為模板轉(zhuǎn)錄出一段稱 為mRNA （信使RNA ）的核酸分子。DNA是由許多脫氧核苷酸按一定堿基順序彼此用 3 '，5 '-磷酸二酯鍵相連構(gòu)成的長鏈。大多數(shù) DNA含有兩條這樣的長鏈，也有 的DNA為單鏈，如大腸桿菌噬菌體 © X174、G4、M13等。DNA 有環(huán)形DNA和鏈狀DNA之分。在某些類型的 DNA中，5-甲基胞 嘧啶可在一定限度內(nèi)取代胞嘧啶，其中小麥胚DNA的5-甲基胞嘧啶 特別豐富。在某些噬菌體中，5-羥甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。40年 代后期，查加夫（E.Chargaff ）發(fā)現(xiàn)不同物種DNA的堿基組成不同， 但其中的腺嘌呤數(shù)等于其胸

5、腺嘧啶數(shù) （A=T ），鳥嘌呤數(shù)等于胞嘧啶 數(shù)（G=C），因而嘌呤數(shù)之和等于嘧啶數(shù)之和，一般用幾個(gè)層次描繪 DNA的結(jié)構(gòu)。濃鹽法從動(dòng)物組織中提取DNA核酸和蛋白質(zhì)在生物體中常以核蛋白（DNP/RNP）的形式存在， 其中DNP能溶于水及高濃度鹽溶液，但在 0.14 M的鹽溶液中溶解 度很低，而RNP則可溶于低鹽溶液，因此可利用不同濃度的NaCI溶液將其從樣品中分別抽提出來。將抽提得到的DNP用SDS處理可 將其分離DNA和蛋白質(zhì)，用氯仿-異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去可得 DNA上清，加入冷乙醇即可將其呈纖維狀析出。肝臟細(xì)胞肝臟是由肝細(xì)胞組成，肝細(xì)胞極小，肉眼看不到，必須通過顯微 鏡才能看到。人肝約有2

6、5億個(gè)肝細(xì)胞，5000個(gè)肝細(xì)胞組成一個(gè)肝 小葉，因此人肝的肝小葉總數(shù)約有 50萬個(gè)。肝細(xì)胞為多角形，直徑 約為20-30/加（微米），有6-8個(gè)面，不同的生理?xiàng)l件下大小有差異， 如饑餓時(shí)肝細(xì)胞體積變大。每個(gè)肝細(xì)胞表面可分為竇狀隙面、肝細(xì)胞 面和膽小管面三種。肝細(xì)胞里面含有許許多多復(fù)雜的細(xì)微結(jié)構(gòu)：如肝細(xì)胞核、肝細(xì)胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、高爾基氏體、微粒體 及飲液泡等組成。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握濃鹽法從動(dòng)物組織中提取 DNA 的原理與技術(shù)三、實(shí)驗(yàn)原理核酸和蛋白質(zhì)在生物體中常以核蛋白 ( DNP/RNP )的形式存在， 其中 DNP 能溶于水及高濃度鹽溶液，但在 0.14 M 的鹽溶液中溶解

7、度很低，而 RNP 則可溶于低鹽溶液，因此可利用不同濃度的 NaCl 溶液將其從樣品中分別抽提出來。將抽提得到的 DNP 用 SDS 處理可將其分離 DNA 和蛋白質(zhì)，用 氯仿 -異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去可得 DNA 上清，加入冷乙醇即可將 其呈纖維狀析出。四、實(shí)驗(yàn)器材和材料試劑實(shí)驗(yàn)器材： 勻漿器 量筒 離心機(jī) 離心管 試管 吸管 恒溫水浴鍋實(shí)驗(yàn)材料： 豬肝實(shí)驗(yàn)試劑： O.1mol/L NaCI-0.05mol/L 檸檬酸鈉溶液（pH6.8 ） 95%乙醇（A.R.） NaCI 固體（A.R.） 5%SDS溶液（5g SDS 定容至100ml ） V（氯仿）:V （異戊醇）20 : 1的混合液五

8、、實(shí)驗(yàn)操作1. 稱量 稱 取 一 定 質(zhì) 量 的 豬 肝 ， 加 入 2 倍 肝 重 的 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L 檸檬酸鈉緩沖液并用勻漿器磨碎（已完成）。2. 提取 DNA 量取肝糜 4 ml 于 10 毫升離心管，在 4000r/min 下離心 10min ，沉淀中再加入 8 ml 緩沖液于 4000r/min 離心 5 min ； 棄上清，取沉淀； 將沉淀用 10 ml 檸檬酸鈉緩沖液完全洗入干凈的小燒杯、加入5 ml氯仿-異戊醇混合液、1 ml SDS，振蕩30min （保鮮膜封口）； 緩慢加入固體 NaCl （約 0.9g ），使其最終濃度為 1mol/L ；

9、將溶液分裝到 2 個(gè) 10 毫升離心管中，在 4000r/min 離心 5 min ，取上清水相； 在上述水相溶液中分別加等體積冷95% 乙醇，邊加邊用玻棒慢慢朝一個(gè)方向攪動(dòng)， 將纏繞在玻棒上的凝膠狀物用濾紙吸去多余的乙醇，即得DNA粗品; 用8ml蒸餾水溶解DNA粗品于10ml離心管中水和（含DNA衲Ik；蛋白厳戰(zhàn)層有機(jī)杓3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按下表加入各種 試劑，混勻，于60 C恒溫水浴鍋45min，冷卻后，在595nm 波長下于分光光度計(jì)比色測定，以吸光度對(duì)DNA濃度作圖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線012345標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液/ml0.00.40.81.21.62.0蒸餾水/ml2.01.61.20.80

10、.40二苯胺試劑/ml4.04.04.04.04.04.0A595nm4. 樣品的測定將DNA粗品定容至25ml容量瓶，再取DNA樣液1.0ml，加 入蒸餾水1.0ml，混勻。然后準(zhǔn)確加入二苯胺試劑 4.0ml，混勻，于60 C恒溫水浴鍋45min ,冷卻后，595nm波長下于分光光度計(jì)比色 測定，根據(jù)所測的吸光度對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得 DNA的質(zhì)量（ug ）。5. 計(jì)算100g豬肝中DNA含量w=m1/m2 X100%w : DNA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）ml :樣液中測得的DNA的質(zhì)量（ug ）m2 :樣液中所含樣品的質(zhì)量（ug ）六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理1.標(biāo)準(zhǔn)曲線012345標(biāo)準(zhǔn)DNA溶0.00.40.81

11、.21.62.0液/ml蒸餾水/ml2.01.61.20.80.40二苯胺試劑4.04.04.04.04.04.0/mlA595nm00.0390.090.1460.1970.249DNA含量/ug080160240320400450a 0.050 丄 0丄50.2025032.實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理豬肝質(zhì)量為2.04gDNA提取液體積為12.53ml序號(hào)123A595nm0.1020.1020.101平均A595nm0.102樣液中DNA含量/ug171.4樣液中樣品質(zhì)量/g0.1628根據(jù)公式w=m1/m2 X100%得：w=0.1053 %則100g豬肝中DNA 含量為：w xi00=0.1053

12、g七、思考題1.實(shí)驗(yàn)中的乙醇、SDS、氯仿-異戊醇、NaCl、檸檬酸鈉分別有什么作用？答：檸檬酸的鈉鹽在實(shí)驗(yàn)中既充當(dāng) DNA酶的抑制劑，也是 pH 緩沖溶液； SDS是表面活性劑，可以讓蛋白質(zhì)與 DNA分開； 氯仿是有機(jī)溶劑， 可以使蛋白質(zhì)聚集沉淀， 便于分離出去； 異戊醇是消泡劑，可以減少泡沫的發(fā)生； 氯仿-異戊醇的作用是使蛋白質(zhì)變性、膜溶解； NaCI固體溶解使得試液成為高濃度的鹽溶液，在這樣的 環(huán)境中 DNA 核蛋白能溶解， RNA 核蛋白則溶解度很低，可以利用 這一性質(zhì)分離兩種核酸。八、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1. DNA 主要集中在細(xì)胞核中，因此，通常選用細(xì)胞核含量比例 大的生活組織作為提取制備

13、 DNA 的材料，小牛胸腺組織中細(xì)胞核比 例較大，因而 DNA 含量豐富，同時(shí)其脫氧核苷酸酶活性較低，制備 過程中 DNA 被降解的可能性相對(duì)較低，所以是制備 DNA 的良好材 料，但其來源較困難，脾臟或肝臟易獲得，也是實(shí)驗(yàn)室制備 DNA 常 用的材料，本實(shí)驗(yàn)用新鮮肝臟作為實(shí)驗(yàn)材料。2. 為了防止大分子核酸在提取過程中被降解，須采取以下措施： 整個(gè)過程必須在低溫下進(jìn)行， 可加入某些物質(zhì)抑制核酸酶的活性， 如 檸檬酸鈉、 EDTA、 SDS 等， EDTA 是抑制核酸酶的活性最好的抑制 劑。3. 從核蛋白中脫去蛋白質(zhì)的方法很多，經(jīng)常采用的有：氯仿- 異 丙醇法、苯酚法、去垢劑法等，他們均能使蛋白

14、質(zhì)變性和核蛋白解聚， 并釋放出核酸。4. 使用離心機(jī)時(shí)，對(duì)稱放置的離心管必須用天平調(diào)平衡。5. 避免劇烈振蕩，如研磨過程、攪拌過程等。九、實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差分析及討論 經(jīng)過對(duì)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得出 100g 豬肝中 DNA 含量大約為 0.1053g 的結(jié)論，在上網(wǎng)查閱相關(guān)資料后發(fā)現(xiàn)：豬肝中 DNA 含量與 本次試驗(yàn)實(shí)際操作測量得出的結(jié)果大致相互吻合。 由此可知， 本次試 驗(yàn)結(jié)果是相對(duì)比較成功的，較為粗略地測量出豬肝中 DNA 的含量， 并且較為熟練地掌握了濃鹽法從動(dòng)物組織中提取 DNA 的原理與技 術(shù)，基本達(dá)到了本次實(shí)驗(yàn)的目的。但是本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果只是粗略測量，并未達(dá)到精確測量豬肝中DNA 的含量

15、，且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較理論值偏低，這是由于某些誤差導(dǎo)致， 在實(shí)驗(yàn)過程中些許因素可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)有偏差， 經(jīng)分析得出 以下幾點(diǎn)： 在稱取豬肝后加入檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行研磨的過程中， 由于豬 肝組織表面較滑不易磨碎， 且研磨至最后依舊有小部分豬肝組織塊殘 留，因此可能導(dǎo)致豬肝中 DNA 提取不充分，致使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較理論值 偏低； 研磨過程中， 可能由于操作不當(dāng)，導(dǎo)致部分液體濺出，因此可能使得提取液中部分 DNA 損失，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏低； 在粗提取 DNA 操作中，頻繁地將 DNA 提取液轉(zhuǎn)移至各個(gè)儀 器內(nèi)，可能有極小部分 DNA 提取液未倒凈， 殘留在儀器壁上損耗掉， 導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差； 在使用移液槍的過程中， 可能因?yàn)椴僮鞑划?dāng)或移液槍經(jīng)常錯(cuò)誤 使用，出現(xiàn)儀器誤差， 導(dǎo)致吸取的 DNA 樣液不精確，出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)誤差； 在水相中加入乙醇析出 DNA 時(shí)，不是所