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文檔簡介
1、病毒轉染原理及步驟在細胞相關的實驗操作中,對于一些按常規(guī)方法難以轉染甚至無法轉染的細胞, 通過病毒介導的實驗能夠大大提高基因的轉導效率, 以達到目的基因的高效瞬時 表達。病毒轉染包括以下步驟:1構建載體2包裝提純病毒3感染靶細胞。以慢病毒 為例。慢病毒(Lentivirus )載體是以HIV-1 (人類免疫缺陷I型病毒)為基礎發(fā)展起來 的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉錄病毒載體,它對分裂細胞和非分裂細胞均具 有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快,研究的也非常深入。該載體可以將 外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而達到持久性表達。在感染能力方面可 有效地感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細
2、胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多 種類型的細胞,從而達到良好的的基因治療效果,在美國已經(jīng)開展了臨床研究, 效果非常理想,因此具有廣闊的應用前景。一、慢病毒載體構建原理:慢病毒載體的包裝系統(tǒng)一般由兩部分組成,即包裝成分和載體成分。包裝成分由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列而構建,能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白;載體成分則與包裝成分互補,即含有包裝、 逆轉錄和整合所需的順式作用序列,同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及 在此位點插入的目的基因。將包裝成分與載體成分的多個質(zhì)粒共轉染包裝細胞, 即可在細胞上清中收獲攜帶目的基因的復制缺陷型慢病毒載體顆粒。慢病毒表達載體包含了包
3、裝、轉染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝 質(zhì)??商峁┧械霓D錄并包裝 RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒,需要利用表達載體和包裝質(zhì)粒同時共轉染細胞, 在細胞中進行病毒的包裝,包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中,離心 取得上清液后,可以直接用于宿主細胞的感染,目的基因進入到宿主細胞之后, 經(jīng)過反轉錄,整合到基因組,從而高水平的表達效應分子。對于一些較難轉染的細胞,如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等,能大大提高目的基因轉導效率,而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加,這就為RNAi,cDNA克隆以及報告基因的研究提供了一個有利的途徑。對進行穩(wěn)轉
4、 細胞株的篩選,為活體動物模型實驗提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液提供基 礎。、慢病毒載體構建及包裝流程:(一)實驗流程(1和2為并列步驟)1慢病毒過表達質(zhì)粒載體的構建設計上下游特異性擴增引物,同時引入酶切位點,PCR(采用高保真KOD酶,3K內(nèi)突變率為0%)從模板中(CDNA質(zhì)?;蛘呶膸欤┱{(diào)取目的基因CDS區(qū)(coding sequenc0連入T載體。將CDS區(qū)從T載體上切下,裝 入慢病毒過表達質(zhì)粒載體。2. 慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構建合成siRNA對應的DNA頸環(huán)結構,退火后連入慢病毒干擾質(zhì)粒載體3慢病毒載體的包裝與濃縮純化制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒,三種質(zhì)粒載體分別進行 高
5、純度無內(nèi)毒素抽提,共轉染293T細胞,轉染后6 h更換為完全培養(yǎng)基, 培養(yǎng)24和48h后,分別收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液,病毒上清液 通過超離心濃縮病毒。(二)實驗材料:慢病毒載體、包裝細胞和菌株該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng),組成為pspax2, pMD2G,pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中質(zhì)粒上的 ZsGreen1 表達框能 表達綠色熒光蛋白(GFP)。細胞株293T,慢病毒的包裝細胞,為貼壁依賴型成上皮樣細胞,生長培 養(yǎng)基為DMEM(含10% FBS)。貼壁細胞經(jīng)培養(yǎng)生長增殖形成單層細胞。菌株大腸桿菌菌株DHa。用于擴增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。、慢
6、病毒轉染細胞實驗方法(一)慢病毒轉染貼壁細胞實驗方法1、慢病毒轉染前18-24小時,將貼壁細胞以1 X105/孔鋪到24孔板中。使細胞在 慢病毒轉染時的數(shù)量為2X105/孔左右。2、第二天,用含有6卩g/ml polybren的 2ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基,加入 適量病毒懸液。37 T孵育。3、(對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟)4小時后加入2ml新鮮培養(yǎng)基以 稀釋 polybrene。4、繼續(xù)培養(yǎng)24小時,用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培5、 繼續(xù)培養(yǎng)。如果慢病毒含有熒光蛋白,一般轉染48小時后可見明顯熒光表達,72小時后更加明顯。如需FACS檢測轉染效率,可在轉染后 72-96小
7、 時進行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加藥篩選,可以在轉染3-4天后開始加藥。(二)慢病毒轉染懸浮細胞實驗方法1、在2X105/ml懸浮細胞中加入polybrene至6卩g/m和適量病毒,充分混勻。37C孵育?;蛘?50g室溫離心4小時(選作,部分難轉染的細胞系采用此步 驟可以提高轉染效率)。2、 (對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟)4小時后(或離心結束后)加入等 體積新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybre ne。3、繼續(xù)培養(yǎng)3-4天。中間視細胞生長情況可傳代或換液。病毒感染細胞本來效率就較低,一定要注意以下幾點:1.感染時的培養(yǎng)基盡量少些;2.每1ml的培養(yǎng)基中加入5-10ul的Pol
8、ybrene(儲存液濃度為2mg/ml),可 以提高效率約3-5倍。不過病毒感染效率的問題都是相對的,達到自己的研究目 的即可。北京英格恩生物公司最新研發(fā)合成一種新型納米聚合物病毒感染增強試劑(病 毒轉染試劑)Envirus,具有對病毒吸附和獨有的濃縮功能。Envirus通過物理 作用將病毒大量富集在細胞表面,大大增加病毒與細胞的接觸,最大限度促進病 毒感染細胞,可大大提高腺病毒,慢病毒,腺相關病毒,逆轉錄病毒等病毒的感 染效率,并且細胞毒性很小。通常情況下,比不用EnvirusTM增強劑,提高感染效率20-50倍。virus on(y virus+Polybrene virus+Enviru
9、s病毒感染細胞本來效率就較低,整個過程相對復雜難操作,一般一次花費周期至 少兩三個月,多則幾個月到十幾個月不等,經(jīng)費也是幾萬到十幾萬。萬一實驗失敗需要重復操作會花費更多的時間和開支。 所以有效提高病毒轉染效率是病毒轉染細胞的關鍵。僅供個人用于學習、研究;不得用于商業(yè)用途。For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.P
10、our l ' e tude et la recherche uniquementa des fins personnelles; pasa des fins commerciales.t o ji e k ogfljirogeifcc, TOpBicnob3 groimio 麻yqeHuicic 碼 egoBua Hudo 員冶hbiucno 員 B30BaTbCEb KoMMepqeckux qeiix.以下無正文僅供個人用于學習、研究;不得用于商業(yè)用途。For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude et la recherche uniquementa des
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