病毒轉染原理及步驟

1、病毒轉染原理及步驟在細胞相關的實驗操作中，對于一些按常規(guī)方法難以轉染甚至無法轉染的細胞， 通過病毒介導的實驗能夠大大提高基因的轉導效率， 以達到目的基因的高效瞬時 表達。病毒轉染包括以下步驟：1構建載體2包裝提純病毒3感染靶細胞。以慢病毒 為例。慢病毒(Lentivirus )載體是以HIV-1 (人類免疫缺陷I型病毒)為基礎發(fā)展起來 的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具 有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將 外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可 有效地感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細

2、胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多 種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果，在美國已經(jīng)開展了臨床研究， 效果非常理想，因此具有廣闊的應用前景。一、慢病毒載體構建原理：慢病毒載體的包裝系統(tǒng)一般由兩部分組成，即包裝成分和載體成分。包裝成分由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列而構建，能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白；載體成分則與包裝成分互補，即含有包裝、 逆轉錄和整合所需的順式作用序列，同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及 在此位點插入的目的基因。將包裝成分與載體成分的多個質(zhì)粒共轉染包裝細胞， 即可在細胞上清中收獲攜帶目的基因的復制缺陷型慢病毒載體顆粒。慢病毒表達載體包含了包

3、裝、轉染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝 質(zhì)?？商峁┧械霓D錄并包裝 RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質(zhì)粒同時共轉染細胞， 在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，離心 取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后， 經(jīng)過反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子。對于一些較難轉染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，能大大提高目的基因轉導效率，而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，這就為RNAi，cDNA克隆以及報告基因的研究提供了一個有利的途徑。對進行穩(wěn)轉

4、 細胞株的篩選，為活體動物模型實驗提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液提供基 礎。、慢病毒載體構建及包裝流程：（一）實驗流程（1和2為并列步驟）1慢病毒過表達質(zhì)粒載體的構建設計上下游特異性擴增引物，同時引入酶切位點，PCR（采用高保真KOD酶，3K內(nèi)突變率為0%）從模板中（CDNA質(zhì)?；蛘呶膸欤┱{(diào)取目的基因CDS區(qū)（coding sequenc0連入T載體。將CDS區(qū)從T載體上切下，裝 入慢病毒過表達質(zhì)粒載體。2. 慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構建合成siRNA對應的DNA頸環(huán)結構，退火后連入慢病毒干擾質(zhì)粒載體3慢病毒載體的包裝與濃縮純化制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，三種質(zhì)粒載體分別進行 高

5、純度無內(nèi)毒素抽提，共轉染293T細胞，轉染后6 h更換為完全培養(yǎng)基， 培養(yǎng)24和48h后，分別收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，病毒上清液 通過超離心濃縮病毒。（二）實驗材料：慢病毒載體、包裝細胞和菌株該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，組成為pspax2, pMD2G,pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中質(zhì)粒上的 ZsGreen1 表達框能 表達綠色熒光蛋白（GFP）。細胞株293T，慢病毒的包裝細胞，為貼壁依賴型成上皮樣細胞，生長培 養(yǎng)基為DMEM（含10% FBS）。貼壁細胞經(jīng)培養(yǎng)生長增殖形成單層細胞。菌株大腸桿菌菌株DHa。用于擴增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。、慢

6、病毒轉染細胞實驗方法（一）慢病毒轉染貼壁細胞實驗方法1、慢病毒轉染前18-24小時，將貼壁細胞以1 X105/孔鋪到24孔板中。使細胞在 慢病毒轉染時的數(shù)量為2X105/孔左右。2、第二天，用含有6卩g/ml polybren的 2ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入 適量病毒懸液。37 T孵育。3、（對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟）4小時后加入2ml新鮮培養(yǎng)基以 稀釋 polybrene。4、繼續(xù)培養(yǎng)24小時，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培5、 繼續(xù)培養(yǎng)。如果慢病毒含有熒光蛋白，一般轉染48小時后可見明顯熒光表達，72小時后更加明顯。如需FACS檢測轉染效率，可在轉染后 72-96小

7、 時進行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加藥篩選，可以在轉染3-4天后開始加藥。（二）慢病毒轉染懸浮細胞實驗方法1、在2X105/ml懸浮細胞中加入polybrene至6卩g/m和適量病毒，充分混勻。37C孵育?；蛘?50g室溫離心4小時（選作，部分難轉染的細胞系采用此步 驟可以提高轉染效率）。2、 （對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟）4小時后（或離心結束后）加入等 體積新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybre ne。3、繼續(xù)培養(yǎng)3-4天。中間視細胞生長情況可傳代或換液。病毒感染細胞本來效率就較低，一定要注意以下幾點：1.感染時的培養(yǎng)基盡量少些；2.每1ml的培養(yǎng)基中加入5-10ul的Pol

8、ybrene（儲存液濃度為2mg/ml），可 以提高效率約3-5倍。不過病毒感染效率的問題都是相對的，達到自己的研究目 的即可。北京英格恩生物公司最新研發(fā)合成一種新型納米聚合物病毒感染增強試劑（病 毒轉染試劑）Envirus，具有對病毒吸附和獨有的濃縮功能。Envirus通過物理 作用將病毒大量富集在細胞表面，大大增加病毒與細胞的接觸，最大限度促進病 毒感染細胞，可大大提高腺病毒，慢病毒，腺相關病毒，逆轉錄病毒等病毒的感 染效率，并且細胞毒性很小。通常情況下，比不用EnvirusTM增強劑，提高感染效率20-50倍。virus on(y virus+Polybrene virus+Enviru

9、s病毒感染細胞本來效率就較低，整個過程相對復雜難操作，一般一次花費周期至 少兩三個月，多則幾個月到十幾個月不等，經(jīng)費也是幾萬到十幾萬。萬一實驗失敗需要重復操作會花費更多的時間和開支。 所以有效提高病毒轉染效率是病毒轉染細胞的關鍵。僅供個人用于學習、研究；不得用于商業(yè)用途。For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.P

10、our l ' e tude et la recherche uniquementa des fins personnelles; pasa des fins commerciales.t o ji e k ogfljirogeifcc, TOpBicnob3 groimio 麻yqeHuicic 碼 egoBua Hudo 員冶hbiucno 員 B30BaTbCEb KoMMepqeckux qeiix.以下無正文僅供個人用于學習、研究；不得用于商業(yè)用途。For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude et la recherche uniquementa des