假基因作為競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性rna

1、假基因作為競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性 rna:目標(biāo)預(yù)測(cè)和驗(yàn)證摘要：假基因可以通過(guò)各種機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)他們的親本基因的表達(dá)以及其他蛋白質(zhì)編碼基因。其中一個(gè)調(diào)節(jié)機(jī)制就是可以作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA(ceRNA )和參與 microRNA 介導(dǎo)的交叉調(diào)節(jié)。在這里，我們描述如何用生物信息學(xué)技術(shù)來(lái)預(yù)測(cè)ceRNA 的目標(biāo)及如何驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。1 In troduct ion假基因可以分為三類(lèi)：假基因分為三類(lèi)：未加工假基因，加工假基因和單一假基因，未加工假基因是通過(guò)基因復(fù)制而來(lái)，保留了內(nèi)含子和調(diào)控序列，相比之下，加工假基因來(lái)源于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座，這種假基因缺乏調(diào)控序列和內(nèi)含子，但含有相當(dāng)于它們親本的 5 and 3 UTR 序列元件unitar

2、y pseudogenes 來(lái)源于突變的蛋白質(zhì)編碼基因，但不具備編碼功能，所有三種類(lèi)型的 假基因，即使被轉(zhuǎn)錄成 mRNAye 也最終無(wú)法被轉(zhuǎn)錄為蛋白質(zhì)。重要的是，力口工假基因和未加工假基因跟他們的親本基因高度相似，經(jīng)常引起一種狀況就是：兩種幾乎完全相同的 mRNA 來(lái)源于基因組上的不同基因座。當(dāng)然，在多種 mRNA 申類(lèi)中只有一種是來(lái)源于親本基因，家基因曾經(jīng)被認(rèn)為是遺傳遺跡，在過(guò)去十年中研究的相對(duì)較少。但是， 最近的研究顯示：假基因是在進(jìn)化中被特意保留下來(lái)的，他們參與了多種監(jiān)控職能。假基因的監(jiān)控職能是多方面的，并且具有親本基因依賴(lài)性或獨(dú)立性，它的作用通過(guò)假基因的正義和反義 mRNA DNA 甚

3、至是通過(guò)由假基因編碼的蛋白質(zhì)和氨基酸來(lái)發(fā)揮調(diào)控作用。其中一種功能就是最近發(fā)現(xiàn)的通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA(ceRNA)調(diào)控基因表達(dá)。ceRNA 具有一個(gè)或多個(gè)mRNA向應(yīng)調(diào)控元件(MREs),并參與到對(duì)有限的 mRN 虎爭(zhēng)性的結(jié)合中。 比如，A、BceRNA具有相同的 MREs 改變 AceRNA的表達(dá)，會(huì)改變共有靶 mRNA 勺生物使用，并且引起 BceRNA表達(dá)的改變，A、BceRNA會(huì)采用相同的變化趨勢(shì)，這種交談反過(guò)來(lái)也可以進(jìn)行。任何包含 MREs 的轉(zhuǎn)錄都能作為ceRNA，包括長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 和假基因、mRAN 此外每一個(gè)轉(zhuǎn)錄本可 能包含許多 MREs 這大大增加了網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜程度，確保對(duì)

4、眾多生物過(guò)程的精確調(diào)控。異常 的ceRNA表達(dá)會(huì)導(dǎo)致生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)混亂和疾病的產(chǎn)生。ceRNA 首先在植物和病毒中被找到，然后我們又在脯乳動(dòng)物細(xì)胞中找到具有ceRNA 活性的 mRNA、lncRNA 和假基因。特另提我們證明了PTENP 是一種親本基因PTEN的ceRNA，負(fù)調(diào)控了PTEN的表 達(dá)，再比如KRAS1兩調(diào)控了KRAS的表達(dá)。假基因不僅跟他的親本基因形成負(fù)調(diào)控，同時(shí)也跟所有具有MREs的轉(zhuǎn)錄本形成負(fù)調(diào)控，最終形成一個(gè)極為復(fù)雜的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在本章我們講述一下ceRNA的鑒I II II-I III別和用實(shí)驗(yàn)來(lái)證明他的方法。這種方法不僅適用于假基因的目標(biāo)檢測(cè)，同樣適合和任何帶有M

5、REs的轉(zhuǎn)錄本。2 Materials2.1 組織培養(yǎng)1. 組織培養(yǎng)制品2. 合適的細(xì)胞系生長(zhǎng)介質(zhì)3. 磷酸鹽緩沖生理鹽水4 胰蛋白酶2.2 siRNA、DNA 和雙重轉(zhuǎn)染1.Opti-MEM reduced 血清2. siRNAs 重組液3. siRNA 轉(zhuǎn)染物4. pCDNA3 等哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒5.DNA 轉(zhuǎn)染試劑2.3 RNA 和蛋白質(zhì)分析1 . RNA 提取設(shè)備或試劑盒2. DNAse3. cDNA 合成試劑盒4. 實(shí)時(shí) PCR5. 蛋白裂解緩沖液6.免疫印跡分析2.4熒光素酶實(shí)驗(yàn)1 .避光 96 孔板2. 雙熒光素酶分析系統(tǒng)3. 生物發(fā)光感光板3 Methods3.1 生物信息學(xué)預(yù)

6、測(cè)假基因 ceRNAs考慮到假基因和 RNA 尚由于多個(gè)MREs 的存在而引起的放大效應(yīng)，因此，要選出具有最好吻合度的假基因候選者。這里我們要通過(guò)一種計(jì)算的方法，尋找出給定假基因中最可能的ceRNA 這種計(jì)算方法是基于 MREs 的共有屬性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?？紤]到假基因A 會(huì)產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，定義T 為轉(zhuǎn)錄本的預(yù)定義列表，并且按照假基因與靶標(biāo)之間的相互作用程度來(lái)排序，同時(shí)定義M 為 microRNAs的螯合度列表，|M和|T|將會(huì)分別指出 microRNAs 的總數(shù)和轉(zhuǎn)錄本的總數(shù)。3.1.1輸入建立一個(gè)非負(fù)整數(shù)矩陣，每一行的數(shù)據(jù)來(lái)源于轉(zhuǎn)錄本列表T,每一列的數(shù)據(jù)來(lái)源于microRNAs列表M,PBI

7、II II-I III卩則代表MRES 勺數(shù)量，該矩陣來(lái)源于 microRNA 數(shù)據(jù)庫(kù) RNA interactions 的預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)，在這里，我們只考慮至少有一個(gè)被預(yù)測(cè)到并屬于列表T 的 MRE3.1.2 空假設(shè)基于 MRE 在所有 microRNA 中隨機(jī)分布的空假設(shè)相異性測(cè)試：在假基因 A 中找出 microRNA 的 MRE的概率為一個(gè)積累的泊松分布：(oooooooooooo3.2ceRNA僉證 1:siRNA 沉默為了調(diào)查假基因和它的ceRNA 靶標(biāo)之間的關(guān)系，我們?cè)u(píng)估了對(duì)假基因作用于RNA 和蛋白表達(dá)的沉默效應(yīng)。1.在 12 孔板上每孔 800 卩 L 培養(yǎng)基，并種植 1X105個(gè)

8、細(xì)胞，在組織培養(yǎng)箱中，準(zhǔn)備 siRNA 轉(zhuǎn)染混合物：添加 100pmol 的 siRNA 到 100 卩 L 的 Opti-MEM，并在一個(gè)單獨(dú)的試管中加 2L專(zhuān)染試劑到100(1 L 的 Opti-MEM;溫育 5 分鐘，結(jié)合 siRNA 和轉(zhuǎn)染試劑，繼續(xù)溫育 15 - 20 分鐘，然后定容在 1ml 并加至細(xì)胞。2.4-24 小時(shí)以后替換培養(yǎng)基3.轉(zhuǎn)染 48-72 小時(shí)以后，回收細(xì)胞用于表達(dá)分析，用PBS 中洗并剝下細(xì)胞，離心分離細(xì)胞，每一個(gè)孔的細(xì)胞單獨(dú)分離 RNA 和蛋白質(zhì)。4.RNA表達(dá)分析： 利用 cDN冶成試劑盒從 1-2ig的總 RNA中合成 cDNA,按照 1:20的比例稀釋

9、cDNA,然后每次提取 4iL 的稀釋后 cDNAI 于 RT-PCR5.蛋白質(zhì)表達(dá)分析：將 10-20ig 的總蛋白注射到 SDS-PAG 中，利用特定的一抗，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的Western blotti ng流程搜尋蛋白質(zhì)編碼假基因 ceRNAs6.預(yù)期的結(jié)果：如果假基因 A 真實(shí)地能調(diào)節(jié)ceRNAB 的表達(dá)，那么沉默假基因 A 應(yīng)該會(huì)導(dǎo)致 ceRNAB的下降。由于 miRNAB過(guò)促進(jìn) RNA 勺周轉(zhuǎn)代謝和抑制其翻譯來(lái)調(diào)控表達(dá)，所以ceRNA 勺交互作用只能在蛋白水平或 RNA 與蛋白質(zhì)水平作為證據(jù)來(lái)使用。3.3 ceRNA驗(yàn)證II: 3 UTR超表達(dá)為了與沉默實(shí)驗(yàn)互補(bǔ)，通過(guò)過(guò)表達(dá)假基因的 3

10、UT 瞇作用于 ceRNA 靶標(biāo)的表達(dá)也必須得到實(shí) 驗(yàn)的證實(shí)，這樣才能確定這些 RNA 之間的交互作用。1.PCRT 增假基因的 3 UTR 然后把它克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中2.在 12 孔板上每孔 800iL 培養(yǎng)基，并種植 1X105個(gè)細(xì)胞3.在組織培養(yǎng)箱里準(zhǔn)備 3 UTR 專(zhuān)染混合物：加入 1ig 質(zhì)粒到 100iL 的 Opti-MEM ;在分 離管中加入 3iL Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑至 100iL 的 Opti-MEM。溫育 5 分鐘，使 DNA 與轉(zhuǎn)染試劑結(jié)合，再溫育 15-20 分鐘，然后定容在 1ml 并加至細(xì)胞4.4-24 小時(shí)后替換培養(yǎng)基5.轉(zhuǎn)染后

11、 72 小時(shí)，回收細(xì)胞并如前所述進(jìn)行RT-PCF 流程I II II- I III6.預(yù)期的結(jié)果：如果假基因 A 調(diào)控 ceRNAB的表達(dá)，那么在過(guò)表達(dá)假基因A 勺 3 UTR 后必然會(huì)引起 ceRNAB 水平的的升高，同樣的該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果只能在蛋白水平或RNA 與蛋白質(zhì)水平作為證據(jù)來(lái)使用，然后定容在1ml 并加至細(xì)胞。7.。3.4 ceRNA驗(yàn)證III:熒光素酶報(bào)告分析為了排除一些間接的實(shí)驗(yàn)干擾，例如：通過(guò)轉(zhuǎn)錄或者是RNA、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性引起的siRNA 介導(dǎo)的沉默效應(yīng)和 3 UTR 勺過(guò)表達(dá)。為了證實(shí)假基因 ceRNAB 標(biāo)的交互作用，建議使用帶有假基因 ceRNA革巴標(biāo)3 UTR 的熒光素

12、酶報(bào)告體系。1.PCRT 增假基因 ceRNAB 標(biāo)的 3 UTRs，然后將它們克隆到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒中，建議使 用包含螢火蟲(chóng)和海腎螢光素酶的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，它們可以提高轉(zhuǎn)染的效率，2.在 12 孔板上每孔 800 卩 L 培養(yǎng)基，并種植 1X105 個(gè)細(xì)胞3.基于不同的對(duì)照需求可以參考 Table 1。準(zhǔn)備 siRNA 轉(zhuǎn)染混合物：100 pmol 的 siRNA 和 150ng 的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒到100 卩 L 的 Opti-MEM，在另一試管中，加入 2 卩 L 的Dharmafect Duo 轉(zhuǎn)染試劑 to 100 卩 L 的 Opti-MEM.溫育 5 分鐘，使 siRNA 和轉(zhuǎn)

13、染試劑結(jié) 合，再溫育 15-20 分鐘，然后定容在 1ml 并加至細(xì)胞4.4-24 小時(shí)后替換培養(yǎng)基5.轉(zhuǎn)染 72 小時(shí)以后，用 PBS 中洗并裂解細(xì)胞，務(wù)必使用雙熒光素酶試劑盒里的100 卩 L 溫和裂解緩沖液6.在避光的 96 孔板上選兩孔，每孔移入 20 卩 L 轉(zhuǎn)染物，然后按試劑盒的操作說(shuō)明檢測(cè)樣本 熒光素酶的活性7.為了量化熒光素酶活性，所有樣品都要與對(duì)照孔進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)，以了解轉(zhuǎn)染的效率， 然后對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，同時(shí)確定對(duì)照孔的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，最后將試驗(yàn)樣品 與陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化比較。8.除了分析 3 UTR光素酶活性 siRNA 下調(diào)效應(yīng)，ceRNA3 UTR 熒光素酶活性的假基因 3UTR表達(dá)的