實驗室常用技術(shù)參數(shù)資

1、實驗室常用技術(shù)參數(shù)資料(1) 一、核酸及蛋白質(zhì)常用數(shù)據(jù)1核苷三磷酸的物理常數(shù)化合物分子量max(pH7.0)1摩爾溶液（pH7.0）中max時的最大吸收值OD280/OD260ATP507259154000.15CTP48327190000.97GTP523253137000.66UTP484262100000.38dATP494259152000.15dCTP46727193000.98dGTP507253137000.66dTTP48226796000.712常用核酸的長度與分子量核酸核苷酸數(shù)分子量DNA48502（雙鏈環(huán)狀）3.0107pBR3224363（雙鏈）2.810628SrRN

2、A48001.610623SrRNA37001.210618SrRNA19006.110519SrRNA17005.51055SrRNA1203.6104tRNA（大腸桿菌）752.51043常用核酸蛋白換算數(shù)據(jù)（1）重量換算1g=10-6g 1pg=10-12g1ng=10-9g 1fg=10-15g（2）分光光度換算：1A260雙鏈DNA=50g/ml1A260單鏈DNA=30g/ml1A260單鏈RNA=40g/ml（3）DNA摩爾換算：1g 100bp DNA=1.52pmol=3.03pmol末端1g pBR322 DNA=0.36pmol1pmol 1000bp DNA=0.66g

3、1pmol pBR322=2.8g1kb雙鏈DNA（鈉鹽）=6.6105道爾頓1kb單鏈DNA（鈉鹽）=3.3105道爾頓1kb單鏈RNA（鈉鹽）=3.4105道爾頓（4）蛋白摩爾換算：100pmol分子量100，000蛋白質(zhì)=10g100pmol分子量50，000蛋白質(zhì)=5g100pmol分子量10，000蛋白質(zhì)=1g氨基酸的平均分子量=126.7道爾頓（5）蛋白質(zhì)/DNA換算：1kb DNA=333 個氨基酸編碼容量=3.7104MW蛋白質(zhì)10，000MW蛋白質(zhì)=270bp DNA30，000MW蛋白質(zhì)=810bp DNA50，000MW蛋白質(zhì)=1.35kb100，000MW蛋白質(zhì)=2.7

4、kb DNA4常用蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物（1）高分子量標(biāo)準(zhǔn)參照（2）中分子量標(biāo)準(zhǔn)參照（3）低分子量標(biāo)準(zhǔn)參照肌球蛋白分子量磷酸化酶B97，400碳酸酐酶31，00肌球蛋白212，000牛血清白蛋白66，200大豆脻蛋白酶21，500-半乳糖甘酶B116，000谷氨酶脫氫酶55，000抑制劑磷酸化酶B97，400卵白蛋白42，700馬心肌球蛋白16，900牛血清白蛋白66，200醛縮酶40，000溶菌酶14，400過氧化氫酶57，000碳酸酐酶31，000肌球蛋白（F1）8，100醛縮酶40，000大豆脻蛋白酶21，500肌球蛋白（F2）6，200抑制劑肌球蛋白（F3）2，500溶菌酶14，400

5、5常用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物DNA/HindDNA/EcoR/Hind+EcoRpBR322/Hae23130212262122758712394167421514840510465575804497350489436156434268458802322484335304346420273530202726757564190423451125158421321137519218974184118311247564125續(xù)上表pBR322/Hinf174/Hinf174/Hae 174/Tap1631726140135329145177131181078117550655310087240439

6、6500826033273444176631023129841348281141221311422718722024940234541542002419433751511182072二、常用緩沖液1分子克隆常用緩沖液2磷酸緩沖液（1）25下0.1mol/L磷酸鉀緩沖液的配制pH1mol/L K2HPO4(ml)1mol/L KH2PO4(ml)5.88.591.56.013.286.86.219.280.86.427.872.26.638.161.96.849.750.37.061.538.57.271.728.37.480.219.87.686.613.47.890.89.28.094.06

7、.2（2）25下0.1mol/L磷酸鈉緩沖液的配制pH1mol/L Na2HPO4(ml)1mol/L NaH2PO4(ml)5.87.992.16.012.088.06.217.882.26.425.574.56.635.264.86.846.353.77.057.742.37.268.431.67.477.422.67.684.515.57.889.610.48.093.26.8:用蒸餾水將混合的兩種1mol/L貯存液稀釋至1000ml，根據(jù)Henderson-Hasselbalch方程計算其pH值：pH=pK+1g(質(zhì)子受體/質(zhì)子供體)在此，pK=6.86(25)。3電泳緩沖液測序凝膠加

8、樣緩沖液98%去離子甲酰胺10mol/L EDTA(pH8.0)0.025%二甲苯青FF0.025%溴酚藍甲酰胺：許多批號的試劑級甲酰胺，其純度符合使用要求，無須再進行處理。不過，一旦略呈黃色，則應(yīng)用在磁力攪拌器上將甲酰胺與Dowex XG8混合床樹脂共同攪拌1小時進行去離子處理，并用Whatman 1號濾紙過濾2次，去離子甲酰胺分裝成小份，充氮存于-70。常用的電泳緩沖液緩沖液使用液濃貯存液（每升）Tris-乙酸（TAE）1：0.04mol/L Tris-乙酸50：242g Tris堿0.001mol/L EDTA57.1ml冰乙酸100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris

9、-磷酸（TPE）1:0.09mol/L Tris-磷酸10:10g Tris堿0.002mol/L EDTA15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris-硼酸（TBE）a0.50.045mol/L Tris-硼酸5：54g Tris堿0.001mol/L EDTA27.5硼酸20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)堿性緩沖液b1:50mmol/L NaOH1:5ml 10mol/L NaOH1mmol/L EDTA2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)Tris-甘氨酸c1:25mmol/L Tris5:15.1g

10、Tris250mmol/L 甘氨酸94g 苷氨酸（電泳級）（pH8.3）0.1% SDS50ml 10% SDS(電泳級)說明：TBE溶液長時間存放后會形成沉淀物，為避免這一問題，可在室溫下用玻璃瓶保存5溶液，出現(xiàn)沉淀后則予以廢棄。以片都以1TBE作為使用液（即1：5稀釋濃貯液）進行瓊脂糖凝膠電泳。但0.5的使用液已具備足夠的緩沖容量。目前幾乎所有的瓊脂糖膠電泳都以1：10稀釋的貯存液作為使用液。進行聚丙烯酰胺凝膠垂直槽的緩沖液槽較小， 故通過緩沖液的電流量通常較大，需要使用1TBE以提供足夠的緩沖容量。堿性電泳緩沖液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。Tris-甘氨酸緩沖液用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。2SDS凝膠加

11、樣緩沖液：100mmol/L TrisHCl(6.8)200mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）4%SDS（電泳級）0.2%溴酚藍20%甘油不含DTT的2SDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫，應(yīng)在臨用前取1mol/L貯存液現(xiàn)加于上述緩沖液中。4凝膠加樣緩沖液緩沖液類型6緩沖液貯存溫度0.25%溴酚藍40.25%二甲苯青FF40%（W/V）蔗糖水溶液0.25溴酚藍室溫0.25%二甲苯青FF15%聚蔗糖(Ficoll400)0.25%溴酚藍40.25%二甲苯青FF30%甘油水溶液0.25%溴酚藍440%(W/V)蔗糖水溶液堿性加樣緩沖液:300mmol/L NaOH6mmol/L EDTA18%聚蔗糖(F

12、icoll400)40.15%溴甲酚綠0.25%二甲苯青FF使用以上凝膠加樣緩沖液的目的有三：增大樣品密度；以確保DNA均勻進入樣品孔內(nèi)；使樣品呈現(xiàn)顏色，從而使加樣操作更為便利，含有在電塊中能以可預(yù)知速率向陽極泳動的染料。溴酚藍在瓊脂糖中移動的速率約為二甲苯青FF的2.2倍，而與瓊脂糖濃度無關(guān)。以0.5TBF作電泳液時，溴酚藍在瓊脂糖中的泳動速率約與長300bp的雙鏈線狀DNA相同，而二甲苯青FF的泳動則與長4kb的雙鏈線狀DNA相同。在瓊脂糖濃度為0.5%1.4%的范圍內(nèi)，這些對應(yīng)關(guān)系受凝膠濃度變化的影響并不顯著。選用哪一種加樣染料純屬個人喜惡。但是，對于堿性凝膠應(yīng)當(dāng)使用溴甲酚綠作為示蹤染料

13、，因為在堿性pH條件下其顯色較溴酚更藍為鮮明。5各種pH值的Tris緩沖液的配制各種pH值的Tris緩沖液的配制所需pH值（25）0.1mol/L HCl的體積714577244773434744207540376385773667834579320802928.126.28.222.98.319.98.417.28.514.78.612.48.710.38.88.58.97.0某一特定pH值的0.05mol/L Tris緩沖液的配制：將50ml 0.1mol/L Tris堿溶液與上表所示相應(yīng)體積（單位：ml）的0.1ml/L HCl混合，加水將體積調(diào)至100ml（2）溫度對50mmol/L

14、TrisHCl液pH值的影響42537817572827673837774847875857976868077878178888279898380908481918582928683938784948885（6）常用緩沖液的pKa值緩沖液分子量pKa值緩沖范圍Trisa12.18.087.17.9HEPESb283.37.477.28.2MPOSc209.37.156.67.8PIPESd304.36.766.27.3MESe195.26.095.46.8a：三羥甲基氨基甲烷；b：N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磷酸；c：3-（N-嗎啉代）丙磺酸；d：N，N-雙（2-乙磺酸）哌嗪；e：2-（N-

15、嗎啉代）乙磺酸。7溫度對常用緩沖液pH的影響緩沖體系pKa(20)pKa/10Mes6.15-0.110Ada6.60-0.110PiPes6.80-0.085Aces6.90-0.200Bes7.15-0.160Mops7.20-0.013Tes7.50-0.200Hepes7.55-0.014Tricine8.15-0.210Tris8.30-0.310Bicine8.35-0.180Glycylglycine8.40-0.280三、常用酶的配制1溶菌酶用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液，分裝成小份并保存于-20。每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。2蛋白水解酶類貯存液貯存溫度反應(yīng)濃度反應(yīng)緩沖液

16、溫度預(yù)處理0.01mol/L Tris(pH7.8)鏈霉蛋白酶a20mg/ml-20（溶于水）1mg/ml0.01mol/L EDTA37自消化b0.5% SDS0.01mol/L Tris(pH7.8)蛋白酶Kc20mg/ml-20（溶于水）50g/ml0.005mol/L EDTA3756無須預(yù)處理0.5% SDSa：鏈霉蛋白酶是從鏈球菌（Streptomyces griseus）中分離到的一種絲氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。b：自消化可消除DNA酶和RNA酶的污染，經(jīng)自消化的鏈酶蛋白酶的配制方法如下：把該酶的粉末溶解于10mmol./l TrisHCl(pH7.5)、10mmol/l NaCl中，配成20mg/ml濃度，于37溫育1h。經(jīng)消化的鏈霉蛋白酶分裝成小份放在密封試管中，保存-20。c：蛋白酶K是一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，從林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber）中純化得到。該酶有兩個Ca2+結(jié)合位點，它們離酶的活性中心有一定距離，與催化機理并無直接關(guān)系。然而，如果從該酶中除去Ca2+，由于出現(xiàn)遠程的結(jié)構(gòu)變化，催化活性將喪失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情況下污染酸制品