益生菌的篩選及安全性研究進(jìn)展

1、cacy of MS -222and benzocaine as anaesthetics under simulated transport conditions of a tropical ornamental fish Puntius filamento sus (Valenciennes J.Aquaculture research, 2010,41(2:309-31417劉長琳, 何力, 陳四清, 等. 魚類麻醉研究綜述J.漁業(yè)現(xiàn)代化,2007,34(5:21-2518Kiessling A,Johansson D,Zahl I H, et al. Pharmacokinetics,

2、plasmacortisol and effectiveness of benzocaine,MS -222and isoeugenol measured in individual dorsal aorta -cannulated Atlantic salmon(Salmo salar following bath administrationJ.Aquaculture,2009,286(3/4:301-30819Tang S,Thorarensen H,Brauner C J,et al. Modeling the accumulationof CO 2during high densit

3、y,re-circulating transport of adult Atlantic salmon,Salmo salar,from observations aboard a sea -going commer cial live-haul vesselJ.Aquaculture,2009,296(1/2:288-29220Velisek J,Svobodova Z,Piackova V. Effects of clove oil anaesthesiaon Rainbow Trout (Oncorhynchus mykissJ.Acta Veterinaria Brno, 2005(7

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5、ing Salmon Smolt,Salmo salar L. Transport and Transfer to SeaJ.Journal of the World Aquaculture Society,2009, 40(2:216-22523趙艷麗, 楊先樂, 黃艷萍, 等. 丁香酚對大黃魚麻醉效果的研究J.水產(chǎn)科技報,2002,29(4:163-16524Coyle S D,Durborow R M,Tidwell J H. Anesthetics in AquacultureR.Southern Regional Aquaculture Center (SRACPublication

6、, 2004, No. 3900收稿日期：2012-03-19益生菌的篩選及安全性研究進(jìn)展董秋月，陳檬燕，辛楊，秦雪艷，程卓，石陸娥*（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310036）摘要：評價益生菌安全性的方法很多，如研究益生菌的特性、益生菌的藥物動力學(xué)及益生菌與宿主之間的相互作用等。隨著研究的不斷深入，益生菌獨(dú)特的營養(yǎng)與保健作用越來越受到人們廣泛關(guān)注。就益生菌的篩選鑒定，生物安全性以及功能的最新研究進(jìn)展作一綜述。關(guān)鍵詞：益生菌；安全性；篩選；研究Safety Research and Selection in ProbioticsDONG Qiu-yue ，CHEN Meng-yan

7、 ，XIN Yang ，QIN Xue-yan ，CHENG Zhuo ，SHI Lu-e *（College of Life and Environmental Sciences ，Hangzhou Normal University ，Hangzhou 310036，Zhejiang ，China ）Abstract ：Evaluation of security of Probiotics have many methods ，such as studying the characteristics of Probiotics ，the pharmacokinetics of Probi

8、otics ，the interaction between the Probiotics and the host and so on. With the deepening of the study ，Probiotics unique nutrition and health-care effect have got more and more peoples attention. The paper will focus on the latest research progress of Probiotics screening and identification ，bio-sec

9、urity and function.Key words ：Probiotics ；safety ；screening ；research食品研究與開發(fā)F ood Research And Development作者簡介：董秋月（1992），女（漢），本科，研究方向：生物技術(shù)。*通信作者：石陸娥（1979），女（漢），副教授，博士，研究方向：生物技術(shù)。隨著生活水平的提高，大家開始更多地關(guān)注健康，人們對食品的要求也不再僅限于滿足最基本的生理需求。于是，像益生菌、益生元這類有益于身體健康的食品添加劑逐漸吸引了人們的眼球。雖然目前益生菌的多種益生性能已經(jīng)被大家所認(rèn)可，但是益生菌制品卻沒有得到充分的開

10、發(fā)。這主要是因?yàn)橐嫔谋２夭灰?，更重要的是益生菌的種類繁多。篩選出動物體內(nèi)的不同益生菌，研究益生菌的生理生化特性，進(jìn)行安全性鑒定是近年來微生物研究中重要的重要組!專題論述2012年10月第33卷第10期228成部分1。益生菌在促進(jìn)人體健康和防止疾病中發(fā)揮著重要的作用，是未來功能食品發(fā)展的重要領(lǐng)域。1益生菌的來源、種類益生菌來源主要是動物腸道正常生理性菌和非腸道菌?？茖W(xué)家已發(fā)現(xiàn)的益生菌大體上分成3大類，其中包括：（1）乳酸桿菌類（如嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、詹氏乳桿菌、拉曼乳桿菌、短乳桿菌、保加利亞乳桿菌等）；（2）雙歧桿菌類（如長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、卵形雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌、青春雙歧桿菌等

11、）2；（3）革蘭氏陽性球菌（如糞鏈球菌、乳球菌、中介鏈球菌等）。此外，還有一些釀酒酵母菌、布氏酵母菌、部分霉菌與非致病性大腸桿菌亦可歸入益生菌的范疇。2益生菌的選擇32.1安全性要求（1）人類用的益生菌要來自于人體；（2）分離來自于健康人的胃腸道；（3）不能產(chǎn)生某些疾?。ㄈ缧膬?nèi)膜炎或胃腸道紊亂）；（4）沒有可傳遞的抗生素基因。2.2功能性要求（1）耐膽汁；（2）耐酸和耐胃液；（3）可黏附在胃腸道等上皮表面并且能夠存活（定植和黏附力）；（4）刺激免疫系統(tǒng)，提高免疫力，并不引起某些炎癥；（5）對病原菌有拮抗作用（抑菌作用），如幽門螺桿菌、沙門氏菌桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿

12、菌等；（6）有抗誘變和防癌功能。2.3加工性要求（1）成本低廉且容易處理；（2）具有好的感官特性；（3）能夠抗噬菌體；（4）在產(chǎn)品和儲藏過程中能夠保持穩(wěn)定性；（5）在加工過程中能夠保證穩(wěn)定有效的活菌數(shù)。3益生菌的傳統(tǒng)分類篩選方法傳統(tǒng)的分類鑒定方法通常指表型分類法，包含形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)、血清學(xué)反應(yīng)等，方法原理都是基于微生物表面受體的特異性。形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特征試驗(yàn)：形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察是指利用顯微鏡對被染色的微生物形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及染色特性進(jìn)行鏡下直接觀察。不同微生物在相同的培養(yǎng)基中形成的菌落特征有很大的差異，而在一定的條件下，同一種微生物的培養(yǎng)特征具有一定的穩(wěn)定性，因此可以區(qū)別不同微

13、生物的一依據(jù)4。細(xì)菌生理生化試驗(yàn)：包括含碳化合物利用、淀粉水解試驗(yàn)、糖或醇類發(fā)酵試驗(yàn)、過氧化氫測定等。4益生菌的敏感性和存活力采用濾紙片抑菌圈法或牛津杯法可辨別不同種類益生菌對各種抗生素的敏感性，馬艷等5進(jìn)行了益生菌對抗生素的敏感性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：乳酸菌對鹽酸林可霉素、慶大霉素敏感，而對丁胺卡那霉素不敏感；芽抱桿菌對慶大霉素敏感，對鹽酸林可霉素不敏感，對丁胺卡那霉素中度敏感，視具體情況配伍使用；糞鏈球菌對慶大霉素敏感，而對鹽酸林可霉素、丁胺卡那霉素不敏感；而3種菌的復(fù)合菌可以分別與以上3種抗生素混合使用。有研究發(fā)現(xiàn)要獲得所期望的治療效果，益生菌的數(shù)量必須達(dá)到足夠的數(shù)量。因此提高益生菌活菌數(shù)量己

14、成為商業(yè)中的重點(diǎn)研究課題。日前，提高生菌存活力的方法有6：（1）選擇耐酸和耐膽鹽的菌株，有助于提高原生菌的生存能力；（2）選擇合適的接種量；（3）利用二步發(fā)酵法，可以使產(chǎn)品中的益生菌數(shù)量比原來提高4倍5倍；（4）微膠囊技術(shù)，以此來降低細(xì)胞的損傷或死亡；（5）抗性調(diào)整，有助于提高益生菌體對不同環(huán)境的耐受性；（6）添加微量營養(yǎng)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、肽和氨基酸；（7）添加抗壞血酸（作為除氧劑）；（8）選擇合適的包裝容器；（9）利用超聲波降解乳酸菌釋放a-半乳糖酶。5益生菌功能性的研究進(jìn)展5.1緩解腹瀉和調(diào)節(jié)腸道菌群的功能根據(jù)研究表明，益生菌能夠預(yù)防和改善腹瀉，由于飲食習(xí)慣或食用抗生素均會打破腸道菌群的平衡，

15、從而會導(dǎo)致腹瀉，補(bǔ)充益生菌能夠增加腸道蠕動，防止細(xì)菌過度生長，調(diào)節(jié)腸道菌群及恢復(fù)腸道正常的pH 值，從而提高腸道機(jī)能，緩解腹瀉癥狀7。具有改善胃腸道功能的益生菌必須具備某種特性才能在微環(huán)境中保持優(yōu)勢，如鉆附、競爭排斥、占位和產(chǎn)生抑制物等。以雙岐桿菌和乳酸桿菌為主的專性厭氧菌與黏膜上皮表面特異性受體相結(jié)合形成組分相當(dāng)同定的菌膜結(jié)構(gòu)和生物屏障，構(gòu)成腸道定植力，可有效抵御過路菌對機(jī)體的侵襲。目前已證實(shí)對胃腸炎具有預(yù)防與治療功效的專利菌株包括LGG ，L. rhumnosus 19070-2，L. reuteri DSM 12246，Bifidobuterium Bl ）-12和L. purucase

16、i ST11等8-9。5.2降低血脂膽固醇水平的功能針對益生菌降低血脂膽固醇水平的機(jī)制，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了廣泛的研究，目前產(chǎn)生了多種不同的假說，包括（1）膽鹽的脫結(jié)合；（2）膽固醇摻入細(xì)胞膜（膽固醇摻入或附著在細(xì)胞上將有可能減少膽固醇由腸道進(jìn)入血液中）；（3）益生菌對膽固醇的吸收；（4）菌體董秋月，等：益生菌的篩選及安全性研究進(jìn)展專題論述229對膽固醇的吸附；（5）菌體對膽固醇的轉(zhuǎn)化（益生菌產(chǎn)生的膽固醇還原酶的作用將膽固醇轉(zhuǎn)化為糞烯醇排出體外從而起到了降低血液中膽固醇含最的作用）等。目前已申報具有降低血脂脂膽固醇功能的專利菌株眾多，包括L. ucidophilus RP32L. uci doph

17、ilus ATCC 4962L.delbrueckiisubsp. bulgaricus ATCC 33409 L. plunturum 299V 等10。5.3調(diào)節(jié)血壓的功能根據(jù)研究表明益生菌的降血壓作用在于其能夠代謝產(chǎn)生蛋白酶，從而降解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生ACE 活性抑制肽。益生菌代謝產(chǎn)生的蛋白酶，包括肽鏈內(nèi)切酶以及氨基肽酶，在這些酶系的連續(xù)作用下，限制性水解蛋白，主要是酪蛋白，產(chǎn)生分子大小以及作用各有差異的生物活性肽段，其中包括已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的具有抑制ACE 活性的小肽，如從啤酒酵母和瑞士乳桿菌中分離的三肽物質(zhì)（Val-Pro-Pro 或Ile-Pro-Pro ），具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)移酶I 活性的作

18、用11-12。此外Saivacla 等13發(fā)現(xiàn)L. casei 細(xì)胞壁成分對自發(fā)性高壓血大鼠（SHR ）和和腎性高血壓大鼠（RHR ）具有明顯降壓作用，這種降壓作用呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)。以上研究說明益生菌的菌體或其代謝產(chǎn)物都可能具有調(diào)節(jié)血壓的效果。5.4具有營養(yǎng)功能目前，有營養(yǎng)特性的益生菌主要是芽孢桿菌、其次是雙歧桿菌、乳酸桿菌等14。益生菌（如芽孢桿菌）可產(chǎn)生多種揮發(fā)性酸，包括乙酸、丙酸、丁酸等，這些有機(jī)酸能夠降低動物腸道的pH ，抑制病原菌的生長，為乳酸菌的生長提供條件。也有一些益生菌如（雙歧桿菌和乳酸桿菌等）可產(chǎn)生多種機(jī)體所需要的維生素，包括V B 1 ，VB 2，VB 6，VB 12以

19、及煙酸和葉酸等，使機(jī)體保持正常的生理活動。此外部分益生菌可代謝產(chǎn)生人體所需的必需氨基酸、短鏈脂肪酸等，均對人體骨骼成長和心臟健康有重要作用。5.5刺激免疫系統(tǒng)，提高免疫功能益生菌對機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響，包括體液免疫調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用及非特異性免疫調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，雙歧桿菌在胃腸道中能夠刺激B 淋巴細(xì)胞活化增殖和分泌抗體，來發(fā)揮體液免疫功能。Gately 等給小鼠喂短雙歧桿菌發(fā)酵乳，發(fā)現(xiàn)小鼠的腸粘膜下淋巴結(jié)增生，在機(jī)體外實(shí)驗(yàn)中，短雙歧桿菌能夠促進(jìn)小腸粘膜下淋巴結(jié)細(xì)胞增殖。經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些淋巴細(xì)胞主要是B 淋巴細(xì)胞15。目前人類研究表明，益生菌對宿主細(xì)胞免疫系統(tǒng)具有正面作用如增強(qiáng)抵抗力。一

20、些益生菌已被證明是 使Th1/Th2的平衡傾向于Th1細(xì)胞，這可以解釋它們對過敏和抵抗力的影響，缺點(diǎn)可能是益生菌可以刺激Th1細(xì)胞介導(dǎo)的疾病（如自身免疫疾?。?6。此外雙歧桿菌作為機(jī)體消化道內(nèi)的優(yōu)勢菌群，能夠明顯激活作為機(jī)體天然抵抗力的一個重要組成部分吞噬細(xì)胞的活性，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫功能。Guarino 等研究發(fā)現(xiàn)，健康人口服兩雙歧桿菌，可以提高粒細(xì)胞和單核白血球的吞噬活性。益生菌對免疫抵抗力，接種疫苗的反應(yīng)，過敏性濕疹，和潰瘍性結(jié)腸炎的影響公布的數(shù)據(jù)表明，某些益生菌可能是有效的。然而，需要更多的研究來證實(shí)這一點(diǎn)。5.6抗突變抗癌功能人們發(fā)現(xiàn)，以大鼠和小鼠作為模型，一些雙歧桿菌和乳桿

21、菌在體外具有抗癌和抗腫瘤作用17。人體實(shí)驗(yàn)表明，益生菌可以通過結(jié)合、阻斷或移除來抑制致癌物和前致癌物。還可以對前致癌物轉(zhuǎn)化為致癌物的細(xì)菌及轉(zhuǎn)化酶的活力進(jìn)行抑制。說的簡單點(diǎn)，益生菌可以吸附致癌物和對致癌物質(zhì)進(jìn)行加工或轉(zhuǎn)移，減弱它們的毒性。益生菌能夠幫助身體遠(yuǎn)離有害細(xì)菌和有害的酶，它們就沒有加工致癌物的機(jī)會了。最典型的例子就是益生菌能降低糞便酶的活力，有效預(yù)防結(jié)腸癌。第二，益生菌能酸化腸道，調(diào)節(jié)腸道菌群，從而減少有害菌的數(shù)量和改變膽汁溶解性。使膽汁減少向致癌物二次膽汁酸的轉(zhuǎn)化。第三，益生菌能促進(jìn)腸道蠕動，加快對糞便中有害的致癌物的排出。除以上生理功能外益生菌還具有其他功能，包括：緩解不耐乳糖癥狀；

22、預(yù)防生殖系統(tǒng)感染；緩解關(guān)節(jié)炎；促進(jìn)消化作用；延緩衰老（抗氧化作用）；抑菌作用。6益生菌的潛在危害性研究益生菌的安全性是非常重要的。通過研究益生菌在胃腸道的存活、移位、定居和代謝，可用來評價食用益生菌的正面作用和負(fù)面作用。益生菌所帶來的益處很多，但也存在著一些潛在危害，包括：可能產(chǎn)生條件性感染（如心內(nèi)膜炎和敗血癥等局部或全身性感染）；可能產(chǎn)生炎癥（超敏反應(yīng)）；可能產(chǎn)生具有潛在危害性代謝產(chǎn)物和對機(jī)體有影響的代謝酶（如D 型乳酸、氨基脫羧酶和硝基還原酶等）可能會轉(zhuǎn)移抗生素基因等18-19。7分子水平上益生菌研究進(jìn)展7.1菌株的分離與鑒定應(yīng)用分子生物學(xué)的方法，能夠根據(jù)益生菌基因組董秋月，等：益生菌的篩

23、選及安全性研究進(jìn)展專題論述230DNA 序列的特異性，進(jìn)行群間、屬間、種間、亞種間、乃至菌株之間的鑒定，幫助從復(fù)雜的培養(yǎng)物中間分離菌株20。鑒定益生菌的分了生物學(xué)方法主要包括PCR 技術(shù)、基因組探針技術(shù)、基因組指紋技術(shù)（如RFLPs 技術(shù)、RAPD 技術(shù)和AFLPs 技術(shù)）等21。PCR 技術(shù)相對簡單快速，指利用專一性的引物，分析復(fù)雜菌群的菌種分布情況檢測染色體上是否存在致病因子的基因，幫助進(jìn)行菌株鑒定。探針技術(shù)與生物芯片技術(shù)結(jié)合，能夠從復(fù)雜微生物環(huán)境中快速檢出并追蹤感興趣的菌株，探針技術(shù)使用的探針包括核糖體寡核苷酸探針（一般是16S rRNA ）、全染色體探針、根據(jù)基因組的特殊的序列設(shè)計(jì)的D

24、NA 片段、質(zhì)粒DNA 探針等。基因組指紋技術(shù)利用DNA 片段長度的多態(tài)性，能夠區(qū)分不同的菌株，幫助分析多樣的、動態(tài)的微生物菌群22-23。7.2益生菌基因遺傳修飾目前基因工程技術(shù)在益生菌研究方面得到了廣泛的應(yīng)用，包括：構(gòu)建能合成有用的特殊營養(yǎng)成分的益生菌菌株、構(gòu)建能產(chǎn)生動物生理性缺乏的物質(zhì)的益生菌株、利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗耐性菌株以及提高定植和黏附力益生菌等24。呂道俊等采用PCR 方法擴(kuò)增，對益生芽抱桿菌進(jìn)行遺傳改造，得到了地衣芽抱桿菌天門冬氨酸激酶基因，為研制既有益生功能，又可以在體內(nèi)直接產(chǎn)生供機(jī)體需要的氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的多功能基因工程益生菌提供了基礎(chǔ)。此外利用益生菌作為體內(nèi)生物反應(yīng)器，

25、可以表達(dá)外源基因主要包括酶基因和抗病基因，對促進(jìn)消化的外源激素、酶基因的克隆和表達(dá)的報道也比較多?？梢娨嫔鳛榛蚬こ淌荏w菌的應(yīng)用前景十分廣闊。8展望隨著益生菌產(chǎn)品的不斷壯大，益生菌的研究工作還需要進(jìn)一步深入，亟待研究的領(lǐng)域總結(jié)如下：通過直接對人進(jìn)行口服益生菌產(chǎn)品等試驗(yàn)，確定益生菌的生理學(xué)功能、作用機(jī)理及其產(chǎn)生的影響程度。益生菌的功能評價，特別是對免疫系統(tǒng)、癌癥和腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)功能。評價益生菌對腸道微生物的數(shù)量和活性的影響，基因重組技術(shù)在這一領(lǐng)域有較大的應(yīng)用潛能。確立載體對益生菌的影響。提高益生菌分類的可靠性并使之易于分類，提高菌株的性能和活性。參考文獻(xiàn)：1Adams M R. Safet

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33、mples by using multiple PCR. FEMSJ.Microbiology Letters,1998,158:273-27821Application molecular biological method s for studyiy prohiotic 董秋月，等：益生菌的篩選及安全性研究進(jìn)展專題論述231食用色素作為目前食品添加劑的一個重要組成部分，通常分為合成色素和天然色素兩大類。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)試驗(yàn)證明，長期和過量使用合成色素對人體健康有一定的危害，部分合成色素還具有致癌、致毒、致畸、致瀉等作用1-2。而天然色素以其色香誘人、無毒無害、色調(diào)自然、口感甘純，同時具有生理保健等

34、優(yōu)點(diǎn)，日益受到人們的青睞3。因此，尋找和開發(fā)更多的天然色素資源已成為食品工業(yè)的發(fā)展趨勢。當(dāng)歸藤（Embelia parviflora Wall. ）系紫金?？扑崽僮訉僦参?，主要分布在廣西、廣東、云南等地4。當(dāng)歸藤sand the gut flora. BritishJ.Joumal of Nutrition,2002, 88(Suppl 1:S29-S3722袁鐵錚, 姚斌. 分子水平上益生菌研究進(jìn)展J.中國生物工程雜志,2004,24(10:27-3323Randazzo C L, Caggia C, Neviani E. Application of molecular ap proach

35、es to study lactic acid bacteria in artisanal cheesesJ.Journal of Microbiological Methods,2009,78:1-924吳信, 江寧, 印遇龍, 等. 基因工程在益生菌中的研究進(jìn)展J.天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2007(1:152-156收稿日期:2012-08-07當(dāng)歸藤紅色素穩(wěn)定性研究管海波1，黃忠京2，銀小玲1，覃江克1，梁敏1，羅艷3，楊瑞云1，*（1. 藥用資源化學(xué)與藥物分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西桂林541004；2. 廣西民族大學(xué)化學(xué)與生態(tài)工程學(xué)院，廣西南寧530006；3

36、. 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530021）摘要：采用紫外分光光度法研究不同環(huán)境條件對當(dāng)歸藤紅色素穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，當(dāng)歸藤紅色素在440nm處有最大吸收峰，酸性條件下較穩(wěn)定，見光不穩(wěn)定，具有一定的抗氧化、抗還原性及耐熱性，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、苯甲酸鈉對該色素?zé)o明顯影響，金屬離子對其影響較大。關(guān)鍵詞：當(dāng)歸藤；紅色素；穩(wěn)定性Study on Stability of Red Pigment from Embelia Parviflora Wall. GUAN Hai-bo 1，HUANG Zhong-jing 2，YIN Xiao-ling 1，QIN Jiang-ke 1，LIANG min 1，LUO Yan 3，YANG Rui-yun 1，*（1. Key Laboratory