由光譜學(xué)與電化學(xué)渠道檢測尼古丁

1、由光譜學(xué)與電化學(xué)渠道檢測尼古丁對遺傳物質(zhì)DNA的作用Interaction of nicotine with DNA investigated via ultraviolet and electroanalysis methods 化學(xué)與分子工程學(xué)院99級 劉玥 摘 要尼古丁,即煙堿3-(1-甲基-2-吡咯烷基)吡啶在煙草中的重量含量約為1%2%，被公認為是導(dǎo)致吸煙上癮的主要因子。研究它對DNA的作用以揭示其基因毒性對于闡釋尼古丁的致癌致畸機制具有重要的意義。通過對DNA組分與結(jié)構(gòu)的詳細分析可知，對DNA復(fù)制起到加密作用的是堿基，而具有光學(xué)及電化學(xué)活性的也恰是A、T、G、C四種堿基，因此可將其

2、作為光與電探測手段的入口點。研究證明紫外譜學(xué)的探測手段相對易行且有效，而電化學(xué)方法由于DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將活性中心深藏其中從而對電極的設(shè)計提出很高的要求。原擬定用碳納米管修飾的玻碳電極來采集電信號，但實驗證明效果并不理想?，F(xiàn)在嘗試一種新的但頗具潛力的解決方案。即利用甲基纖維素的負溫度敏感性將其制成高分子材料電極，DNA分子直接包覆其中。通過加入具備生物兼容性的電解質(zhì)同時解決降低凝膠點和導(dǎo)電的問題。AbstractConsumption of tobacco is one of the most deadly threaten to human health. In this sense, it

3、 is urgent to investigate whether and how much nicotinecould impose an negative effect on the structure of DNA，therefore causing sufferings particularly from breathing system diseases. A detailed knowledge of the structure of DNA suggests that it is both ultraviolet and electrical responsive. The ul

4、traviolet spectrum of the mixture of DNA and nicotine proved the postulation that there do exist an interactionbetween molecules of nicotine and DNA. A certain adduct is probable. Electrodes modified with single wall carbon nanotubes are adopted for eletroanalysis of DNA in solution, yet little resp

5、onses had been detecteddue to double helix structure of DNA where active centers are deep hidden.Fortunately methylcellulose, a polymer material with thermogelation properties, had been brought into consideration for designing a new electrode where in which molecules of DNA themselves are being trap

6、ped.It is a promising new method though highly postulating, and experimentsare being carried out to test its feasibility. 一 引言尼古丁,即煙堿3-(1-甲基-2-吡咯烷基)吡啶在煙草中的重量含量約為1%2%。尼古丁不僅能轉(zhuǎn)化為具有強致癌性的亞硝胺化合物,而且被公認為是導(dǎo)致吸煙上癮的主要因子。核酸是遺傳信息的載體，它可以與許多化合物發(fā)生相互作用（如金屬離子及其絡(luò)合物、小分子有機化合物及蛋白質(zhì)等）并進而影響到核酸的復(fù)制及斷裂；本項研究則是通過測定尼古丁和DNA之間的相互作用以

7、揭示尼古丁的基因毒性。DNA是由許多單體組成的線形大分子，基本結(jié)構(gòu)重復(fù)單元是脫氧核苷酸，其組成結(jié)構(gòu)如下圖所示： 磷酸DNA 脫氧核苷酸 D-2脫氧核糖脫氧核苷 腺嘌呤 堿基 鳥嘌呤 胞嘧啶 胸腺嘧啶 (一).DNA的紫外吸收由于嘌呤和嘧啶殘基中含有共軛雙鍵結(jié)構(gòu),所以DNA具有強烈的紫外吸收性質(zhì),其最大波長在260nm處.正是由于它有這樣的光學(xué)活性,故而可以采用譜學(xué)探測方法.(二). DNA的電化學(xué)1. DNA的電化學(xué)活性在DNA的組分中,堿基能發(fā)生氧化還原反應(yīng).鳥嘌呤和腺嘌呤可以在碳電極上氧化,鳥嘌呤, 腺嘌呤和胞嘧啶也可以在很負的電位下還原,故只能在貢電極上得到還原峰.基于此特性可將電化學(xué)的

8、方法作為又一種探測手段。2. DNA在固體電極上的電化學(xué)氧化DNA的組分中，能發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)的只是堿基。然而DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)又將其隱藏在雙螺旋內(nèi)部。DNA變性處理的實質(zhì)即為其二級結(jié)構(gòu)的破壞。原本依靠配對堿基之間氫鍵作用維系的雙螺旋被打開形成兩條單鏈。從而將包藏于內(nèi)部的堿基暴露出來，在電極上產(chǎn)生較強的電信號。3. DNA在修飾電極上電活性的改善單層碳納米管具有很好的電學(xué)性質(zhì)，可以作為一種特殊的電極材料來促進電子的傳遞。碳納米管具有獨到的優(yōu)勢：極小的尺寸，極高的縱橫比，以及具有催化作用的表面。將其修飾在玻碳電極表面是一項很有研究價值的探測手段。 二.實驗PART I :紫外部分(一).儀器Car

9、y IE紫外-可見分光光度計（Varian公司）。(二).試劑小牛胸腺DNA（純度99%，購于sigma）；尼古丁（中國醫(yī)藥公司，北京采購供應(yīng)站）；石英亞沸三次重蒸水。(三).實驗程序2.測定尼古丁與DNA作用后的紫外吸收。 配置多種濃度的DNA與Nicotine純?nèi)芤阂约岸喾N濃度配比的DNA+Nicotine混合溶液分別測定，用計算機作圖并扣除相應(yīng)濃度的尼古丁溶液的吸收以初步觀察尼古丁對DNA的紫外吸收有何影響。3.以相應(yīng)濃度的尼古丁溶液為空白測定混合溶液的紫外吸收。PART II:電化學(xué)部分(一).儀器M273恒電位儀及M270電化學(xué)分析系統(tǒng)（EG&G, PAR公司，美國）；三電極

10、體系：工作電極為玻碳電極，參比電極為飽和甘汞電極（SCE）,對電極為鉑電極；(二).試劑小牛胸腺DNA（純度99%，購于sigma）；尼古丁（中國醫(yī)藥公司，北京采購供應(yīng)站）；單層碳納米管（SWNT）(北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院制備)；石英亞沸三次重蒸水。(三).實驗程序1. 玻碳電極的修飾 將玻碳電極在金相砂紙上拋光,在麂皮上用Al2O3粉末拋光至鏡面，然后分別用水和乙醇在超聲波中清洗，晾干。再用微量注射器取15微升單層碳納米管懸浮液分三次滴加在玻碳電極表面，至于紅外燈下待溶劑揮發(fā)。2. 用循環(huán)伏安法掃描測定DNA溶液電化學(xué)響應(yīng)）3. 用循環(huán)伏安法掃描測定DNA與Nicotine混合溶液的電化

11、學(xué)響應(yīng)配置多種濃度配比的DNA+Nicotine混合溶液分別測定，以確定尼古丁對DNA的電化學(xué)響應(yīng)有何影響。三.結(jié)果與討論Part I:紫外部分 1.DNA的濃度測定A(稀釋25倍)B(稀釋10倍)C(稀釋5倍)Wavelength/nm259.00258.00257.00Abs0.69391.76003.1526表1.測定DNA儲備液濃度的三份不同稀釋倍數(shù)測試液的紫外吸收峰值。當吸光度為1.0時對應(yīng)的DNA溶液濃度為0.06mg/ml。測得其濃度為1.01 mg/ml。已知DNA溶液摩爾吸光系數(shù)=6600 mol-1.L.cm-1故DNA溶液摩爾濃度約為2.5X10-3mol/L。圖1. 測

12、定DNA儲備液濃度的三份不同稀釋倍數(shù)測試液的紫外吸收圖。2.DNA與尼古丁混合溶液的紫外吸收混合溶液的吸收譜圖用計算機扣除尼古丁的吸收后，其結(jié)果初步證明尼古丁的存在使得DNA在260nm處紫外吸收峰的峰高發(fā)生變化。即與DNA分子發(fā)生相互作用。更準確的結(jié)果可通過實驗直接將尼古丁的吸收作為空白扣除。3.以尼古丁為空白的混合溶液的紫外吸收樣品123空白nicotine（5.0X10-5mol/L）nicotine(1.0X10-4mol/L)nicotine (2.5X10-4mol/L)混合樣品DNA（5X10-5mol/L） +nicotine（5.0X10-5mol/L）DNA（5X10-5m

13、ol/L）+nicotine(1.0X10-4mol/L)DNA（5X10-5mol/L）+ nicotine(2.5X10-4mol/L)表2.各混合液體中DNA與Nicotine的濃度比及其相應(yīng)空白尼古丁溶液的濃度圖2.純尼古丁溶液（A）樣品峰高與純DNA吸收值之差A(yù)0.329B(1:1)0.3390.010（3%）C(1:2)0.3630.024（7%）D(1:5)0.4180.055（13%）表3. 將各混合溶液在260nm處的紫外吸收與純DNA溶液在該波長的吸收值之差圖3.尼古丁存在時引起DNA紫外吸收的改變對尼古丁濃度的線性擬和Part II:電化學(xué)部分 循環(huán)伏安法掃描未得到預(yù)想的

14、電化學(xué)響應(yīng)信號,說明堿基在雙螺旋中隱藏較深, 玻碳電極上修飾的碳納米管還不足以深入雙鏈內(nèi)部采集電信號.暑期我在臺灣新竹清華大學(xué)進行的高分子材料方面的研究給予我很大啟發(fā),我所作的關(guān)于甲基纖維素的研究為這里要攻克的難題提供了一種新的解決方案.(一).甲基纖維素的負溫度敏感性0C.這種獨特的負溫度敏感性，使得它具有廣闊的應(yīng)用前景。譬如：在藥物制放系統(tǒng)中，很多大分子的藥物需要一種特殊的載體。常溫下為溶液狀態(tài)，進入人體到達治療部位后，藥物的包覆材料變?yōu)槟z狀從而避免了藥物立即擴散，達不到治療所需的濃度。負溫度敏感性材料如甲基纖維素之所以受到關(guān)注也正因如此。關(guān)鍵的地方是要將甲基纖維素的凝膠溫度由800C變

15、為370C。 一種方法是向甲基纖維素的水溶液中加入對生物體無毒的添加劑。已實驗過有NaCl、CaCl2和蔗糖。其效果相當顯著。其可能的機理如下圖所示：a.低溫下的高分子鏈b.隨著溫度升高，支鏈的轉(zhuǎn)動越來越劇烈，導(dǎo)致鏈端張開將甲基暴露出來。c.包圍在甲基周圍的水分子被排開，各高分子鏈通過甲基之間的疏水相互作用彼此交聯(lián)從而形成凝膠。圖4.凝膠過程示意細線為至鏈稀疏區(qū),粗線反之.當溶液中有添加劑時,會對凝膠過程有一定影響.雖然溶液是均相的,當對于一微觀區(qū)域并非如此.以CaCl2為例，被困在高分子鏈之間的離子數(shù)量遠少于游動在之外廣闊的水域中的數(shù)量（圖4a）。這種內(nèi)外濃度的差別就造成了滲透壓，高分子束即

16、可看作半透膜。當鏈端張開時（圖4b），由于滲透壓的存在，使得高分子鏈束內(nèi)的水分子流出，從而暴露出甲基加速了交聯(lián)作用，并導(dǎo)致凝膠點下降。圖5.甲基纖維素的凝膠點對蔗糖濃度的線性擬和圖6. 甲基纖維素的凝膠點對CaCl2濃度的線性擬和（二）. 甲基纖維素對DNA的電化學(xué)響應(yīng)的意義已知DNA具有電化學(xué)活性位點，存在的問題是找到合適的電極去采集應(yīng)有的電信號?？梢钥紤]將DNA直接包覆于電極中，甲基纖維素恰是一種理想的可應(yīng)用高分子材料。首先它可以在較低溫度（370C）結(jié)成凝膠狀作為電極，此溫度又恰好可以使實驗條件更好的模擬人體的生理環(huán)境。其次，材料的導(dǎo)電性需加入電解質(zhì)來實現(xiàn)，而NaCl、CaCl2等常用的

17、電解質(zhì)又正是降低甲基纖維素凝膠溫度所需的添加劑。這樣制成的電極應(yīng)該會有改善，具體的工作正在進行之中。致 謝在此論文完成之際,我要衷心感謝所有在此期間給于我指導(dǎo)和幫助的人!感謝我的指導(dǎo)老師莊乾坤教授在思想方法,學(xué)術(shù)態(tài)度,科研精神等各個方面給予我太多的啟迪和指導(dǎo)。與莊老師每一次討論之后都會有豁然開朗之感,使我充滿熱情和信心地投入到下一步的研究中去。感謝臺灣新竹清華大學(xué)的宋信文教授在赴臺交流期間給予我的悉心指導(dǎo)和細致關(guān)懷,使我能夠順利的完成在臺灣的研究計劃,并在短暫的暑假期間受益良多。同時對生醫(yī)實驗室的各位學(xué)長與學(xué)姐致以謝意,感謝他們的幫助。還要感謝同實驗室的甘鎮(zhèn)海,趙強,趙怡芳等諸位師兄師姐在整個

18、過程中的熱情幫助,使我能夠順利的投入到研究工作中去。最后,真誠地感謝“政基金”給我們提供了如此難得自我發(fā)展的機會。感謝李政道先生。感謝“政基金”委員會的各位老師。參考文獻1 J.Marmur, 1961,3,208.2 S.Yamada, H.Sato, Nature, 1962,193,261. Nature, 1971,231,175. 4 V.Vrabec, 1978,89,161.Electroanalysis 2001,13,1105.Electroanalysis 2000,12,1419.7 Anwarul Haque& Edwen R. Morris. Carbohyd

19、rate Polymers 22 (1993) 161-173.8 Anwarul Haque, Robert K. Richardson, Edwen R. Morris. Carbohydrate Polymers 22 (1993) 175-186.9 Matthew C. Tate, Deborah A. Shear, Stuart W. Hoffman, Donald G. Stein, Michelle C. Laplaca. Biomaterials 22 (2001) 1113-1123.10 Biodegradable hydrogels for drug delivery. Written by Kinam Park, Waleed S.W. Shalaby, Haesun Park. 1993. Technomic Publishing Company, Inc.11 High Polymets Vol. V Cellulose and Cellulose Derivatives