用聚乳酸-羥基乙酸共聚物制備載多西他賽納米顆粒的實(shí)用制備過(guò)程

1、用聚乳酸-羥基乙酸共聚物制備載多西他賽納米顆粒的實(shí)用制備過(guò)程背景：用生物可降解和生物相容性聚合物、聚乳酸-羥基乙酸共聚物制備納米粒是藥物傳遞系統(tǒng)中研究最深入的共聚物。該研究的目標(biāo)是充分探究PLGA納米粒藥物傳遞系統(tǒng)在商業(yè)劑型中的發(fā)展。我們的目的是比較納米粒制造過(guò)程中不同的制備參數(shù)的影響。方法：載多塔賽西PLGA納米粒通過(guò)單一乳液技術(shù)和溶劑蒸發(fā)來(lái)進(jìn)行比較。納米粒用各種技術(shù)進(jìn)行探究，包括掃描電子顯微鏡對(duì)其表面形態(tài)，動(dòng)態(tài)光散射對(duì)其尺寸和zeta電位，X-射線光電子能譜對(duì)其表面化學(xué)和高效液相色譜對(duì)藥物體外釋放動(dòng)力學(xué)的研究。為了得到更小的納米粒，采用0.2%聚乙烯醇，0.03%D-生育酚聚乙二醇1000

2、琥珀酸鈉（TPGS），2%泊洛沙姆188，130瓦功率超聲五分鐘，磁力攪拌蒸發(fā)，和每分鐘8000轉(zhuǎn)的離心條件。為了提高納米粒的封裝效率，不同的條件效率也不同，即，2-5分鐘的超聲時(shí)間，70-120瓦功率，和5-25mg的載藥量。結(jié)果：選擇130瓦功率下超聲5分鐘，10mg載藥量。在這種條件下，納米粒達(dá)到90%的封裝效率。藥代動(dòng)力學(xué)顯示，包含泊洛沙姆188，TPGS或者聚乙烯醇的納米粒在28天內(nèi)釋放量分比為20.83%，40.07%，和51.5%。TPGS和泊洛沙姆比聚乙烯醇的釋放動(dòng)力學(xué)要小。據(jù)預(yù)測(cè)，根據(jù)X-射線光電子能譜發(fā)現(xiàn)有藥物殘留在表面。結(jié)論：我們的研究顯示表面活性劑的選擇對(duì)控制多西他賽的

3、釋放非常重要。關(guān)鍵詞：多西他賽、納米粒、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、不同的劑型、超聲、封裝效率。簡(jiǎn)介多西他賽是紫杉醇家族中的一個(gè)抗癌劑。紫杉醇類似物多西他賽通過(guò)從歐洲紫衫中提取的10-脫乙?；麧{赤霉素III半合成得到的。多西他賽聯(lián)合其他化療藥物在治療乳腺癌、胰腺癌、胃癌和膀胱通路上皮癌方面顯示很高的治療效果。多西他賽水溶性低，臨床上唯一使用的劑型是40mg/mL包含聚山梨酯80的高濃度溶液。這種賦形劑與一些過(guò)敏反應(yīng)和其與普通聚氯乙烯經(jīng)脈給藥組不相容。為了消除聚山梨酯80為基礎(chǔ)的賦形劑和提高藥物溶解性，已經(jīng)提出替代劑型，包括脂質(zhì)體和環(huán)糊精。納米粒的聚合物基體必須符合多重要求，如生物相容性和生物可降

4、解性，機(jī)械強(qiáng)度，易于加工。大家熟知的控釋的生物可降解性材料是聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）。許多出版物已經(jīng)介紹了用PLGA制備納米顆粒和配方變量的研究，包括PLGA的分子量，凍干劑，表面活性劑。因此，我們研究了用PLGA通過(guò)溶劑蒸發(fā)方法制備多西他賽來(lái)持續(xù)注射的配方。乳液的形成是制備納米粒最重要的一步，因?yàn)槿榈蔚拇笮∨c最終納米粒的大小直接相關(guān)。這種乳液是通過(guò)含有多西他賽的有機(jī)相和包含表面表面活性劑或穩(wěn)定劑的水相混合制備的，可以用外部能量將其分散成小液滴，通過(guò)有機(jī)溶劑的蒸發(fā)，納米小液滴可以生成納米顆粒。在該研究中，我們專注于用PLGA制備多西他賽納米顆粒的細(xì)節(jié)。為了獲得更小的顆粒和更窄的粒徑分

5、布，我們根據(jù)乳化和蒸發(fā)條件改變了一些重要的參數(shù)。首要目的是確定以PLGA制備多西他賽納米顆粒的最佳制備條件。材料和方法材料： 有游離羧基的PLGA（50：50 Resomer RG 502H）是從Boehringer Ingelheim (Ingelheim, Germany)獲得的。多西他賽是SamyangGenex Corporation (Daejeon, Korea)贈(zèng)送的。聚乙烯醇是從Sigma-Aldrich (Steinheim, Switzerland)購(gòu)買(mǎi)的，87-89%的水解，分子量為146000-186000。泊洛沙姆188從BASF (Ludwigshafen, Ger

6、many)購(gòu)得。D-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸鈉（TPGS）和蔗糖從Sigma Aldrich購(gòu)得。所有其它化學(xué)試劑是分析級(jí)或試劑級(jí)商品，使用時(shí)無(wú)需進(jìn)一步純化。納米顆粒制備：包含多西他賽的納米顆粒是用單一乳化技術(shù)和溶劑蒸發(fā)的方法制備的。簡(jiǎn)要地說(shuō)，多西他賽溶解于2mL二氯甲烷中，再向該溶液中加入100mgPLGA。油相在冰浴條件下用探頭超聲波破碎儀100瓦（VCX 130 Sonic and Mateerials，Newtown，CT）乳化2分鐘。得到的油性溶液在冰浴條件下超聲10分鐘，進(jìn)一步乳化成40mL含有0.2%聚乙烯醇的水性溶液。，乳化后，水包油型乳液磁力攪拌8小時(shí)，以蒸發(fā)掉有機(jī)溶劑。

7、得到的納米顆粒以8000轉(zhuǎn)每分鐘分離心20分鐘分離。最后，納米顆粒用蒸餾水洗滌除去殘留的表面活性劑然后在蔗糖存在條件下凍干。我們對(duì)流體粒子大小和藥物封裝效率百分比的各種處理參數(shù)進(jìn)行了研究。處理參數(shù)包括水相中表面活性劑濃度和類型，初始載藥量，超聲時(shí)間和功率。除另外說(shuō)明，所有實(shí)驗(yàn)是在其他變量不變的條件下僅改變一個(gè)變量條件下進(jìn)行的。多西他賽評(píng)價(jià): 包含多西他賽的凍干納米顆粒稱重后溶解于二氯甲烷中。渦流15分鐘后，二氯甲烷在氮?dú)鈼l件下?lián)]發(fā)。產(chǎn)率、載藥量、封裝效率按如下方法計(jì)算：產(chǎn)率（%）=顆粒重量/含聚合物的藥物重量×100載藥量（%）=顆粒中藥物重量/顆粒重量×100封裝效率（%

8、）=顆粒中藥物重量/給藥重量×100顆粒大小，zeta電位和表面張力測(cè)量: 納米顆粒的大小的分析用動(dòng)態(tài)光散射分析儀（ELS-8000，Otasuka Electaxel，Tokyo，Japan）進(jìn)行分析。含有多西他賽的納米顆粒加入到樣品分散單元并進(jìn)行超聲，以減弱顆粒間的相互作用。遮蔽范圍維持在2%-50%。用儀器測(cè)量樣品30次可得到平均粒徑。為了測(cè)量納米顆粒的zeta電位，制備含有多西他賽的水性稀釋?xiě)腋∫翰⒊曇环昼?。根?jù)表面活性劑的濃度，檢查含多西他賽的納米顆粒的表面張力（Sigma 703D, Attension/Biolin Scientific, Espoo, Finland

9、）。掃描電子顯微鏡: 掃描電子顯微鏡用來(lái)驗(yàn)證顆粒形狀和大小的均勻性。凍干納米顆粒灑落在雙層碳帶上。與鉑和混合物在真空下包衣45秒，并用FE-SEM（JEOL JSM7500, Thermo Scientific）在5千瓦條件下進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查。紅外光譜和X-射線光電子能譜: 含多西他賽納米顆粒表面結(jié)構(gòu)特征用傅里葉變換紅外光譜（FTIR, Nicolet 380, Thermo Scientific）在其固態(tài)條件下測(cè)定。納米顆粒樣品在紅外光譜的掃描范圍是400-4000cm-1.包含多西他賽的納米顆粒的表面化學(xué)用X-射線光電子能譜檢查（Multilab 2000, Thermo Scientifi

10、c），測(cè)得的光譜用80eV傳遞能量，結(jié)合能量范圍從0-1200eV。用制造商提供的軟件進(jìn)行曲線擬合。載多西他賽的納米顆粒體外釋放曲線: 對(duì)包含多西他賽的納米顆粒的多西他賽釋放進(jìn)行一式三份的研究，在室溫下進(jìn)行，用半透膜（molecular weight cut off 10,000 Da, MEMBRA-CEL, Chicago, IL）分離供體和受體介質(zhì)。受體介質(zhì)填充100mL pH為7.4的磷酸鹽緩沖液，以保證溶解度。相當(dāng)于300µg的大量納米顆粒分散在供體介質(zhì)中（5mL），在定義好的時(shí)間點(diǎn)將1mL的樣品從吸收介質(zhì)中撤回，并用等體積的新鮮介質(zhì)替代。統(tǒng)計(jì)分析: 學(xué)生的t檢驗(yàn)作為對(duì)照組

11、。P值小于0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果與討論載多西他賽的PLGA納米顆粒直徑的影響因素: 在制備的各步驟中，對(duì)影響載多西他賽納米顆粒的平均粒徑的變量進(jìn)行了研究。這些變量包括有機(jī)溶劑，聚乙烯醇的濃度，TPGS，和水相中的泊洛沙姆188，超聲功率和時(shí)間，以及離心速度。不同有機(jī)溶劑和表面活性劑的影響: 乳液的形成是制備納米顆粒最重要的一步，因?yàn)槿榈蔚拇笮∨c最終的納米顆粒的大小直接相關(guān)。這種乳液是用包含聚合物的有機(jī)層和包含表面活性劑或穩(wěn)定劑的水相混合制得，運(yùn)用外部能量將其破碎為小液滴，這些納米液滴在有機(jī)溶劑揮發(fā)后形成納米顆粒。首先，我們確定表面活性劑，即聚乙烯醇，TPGS，或泊洛沙姆188在水相中的

12、最佳濃度。在標(biāo)準(zhǔn)條件下保持其他參數(shù)的恒定，改變表面活性劑濃度來(lái)確定濃度對(duì)顆粒大小的影響。圖1中，顯示了水相中各表面活性劑的濃度下的納米顆粒大小和表面張力。水相中表面活性劑濃度的變化為：聚乙烯醇0.1%-4%，TPGS 0.015%-1%，或者泊洛沙姆188 0.1%-4%；其它所有制備參數(shù)，包括超聲時(shí)間和藥物濃度保持恒定。聚乙烯醇濃度的增加引起納米顆粒大小的顯著減少，減少量為0.2%，這與表面張力一致。這與低界面張力一致，界面張力減小從而顆粒大小也減小。聚乙烯醇濃度增加0.2%顆粒大小也增加。其他研究者已經(jīng)報(bào)道，增加提高聚乙烯醇濃度可以增加外部水相的粘度，導(dǎo)致凈剪應(yīng)力的下降，顆粒大小也相應(yīng)增加

13、。泊洛沙姆188濃度為4%時(shí)顆粒大小為44.3± 0.7 µm，泊洛沙姆188濃度為2%時(shí)顆粒大小為46.5± 1.2 µm.然而，當(dāng)制備納米顆粒時(shí)采用TPGS，顆粒大小和表面張力沒(méi)有相關(guān)性。圖1 含不同溶劑和表面活性劑的劑型的顆粒大小和表面張力在前面的試驗(yàn)中，事先確定表面活性劑聚乙烯醇，TPGS，和泊洛沙姆188的濃度分別為為2%，0.03% 和0.2%。隨后，使用三種有機(jī)溶劑，包括二氯甲烷，氯仿和乙酸乙酯。用氯仿時(shí)，泊洛沙姆188，TPGS和聚乙烯醇制備的納米顆粒的大小分別為290.2 nm，292.8 nm和265.5 nm，zeta電位分別為-1

14、9.27mV,-3.29 mV和-16.6 mV。用氯仿時(shí)，泊洛沙姆188，TPGS和聚乙烯醇制備的納米顆粒的大小分別為340.5 nm，531.0 nm和274.4 nm，zeta電位分別為18.94 mV，-20.39 mV和-16.44 mV。用乙酸乙酯時(shí)，泊洛沙姆188，TPGS和聚乙烯醇制備的納米顆粒的大小分別為438.8 nm，1044.2 nm和393.6 nm，zeta電位分別為-20.75 mV，-14.52 mV和-19.2 mV（圖2）.根據(jù)以上結(jié)果，二氯甲烷作為有機(jī)溶劑和0.2%聚乙烯醇作為水性溶劑時(shí)得到最小的顆粒大小。另?yè)?jù)報(bào)道，表面活性劑的作用是通過(guò)阻止凝聚而使乳化液

15、滴穩(wěn)定。為達(dá)到高效穩(wěn)定的作用，表面活性劑分子必須覆蓋在有機(jī)溶劑和水相界面的所有液滴。圖2 含不同溶劑和表面活性劑的劑型的顆粒大小和zeta電位超聲功率和時(shí)間的影響: 最小的納米顆粒是在130瓦下超聲5分鐘得到的（表1）。因此，超聲功率可能會(huì)減小納米顆粒的大小，可能是因?yàn)槁暭{能量可以通過(guò)乳化和減小平均顆粒粒徑來(lái)增加能量的釋放。表1 超聲功率和時(shí)間對(duì)納米顆粒特征的影響蒸發(fā)方法和時(shí)間的影響: 除去有機(jī)溶劑的方法對(duì)納米顆粒的大小有非常重要的影響。我們用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和磁力攪拌得到了亞微納米顆粒，但是在氮?dú)夂蜏p壓條件下不可能得到亞微大小的顆粒。表2中顯示氮?dú)庥凶羁斓挠袡C(jī)溶劑的蒸發(fā)率，但是也會(huì)導(dǎo)致得到的顆粒比

16、磁力攪拌下得到的顆粒大。這表明，有機(jī)溶劑去除的蒸發(fā)率影響顆粒大小。圖3顯示，在制備納米顆粒的過(guò)程中，不同磁力攪拌時(shí)間對(duì)去除有機(jī)溶劑的影響。在攪拌時(shí)間分別為2,4,6小時(shí)條件下，納米顆粒成聚集狀態(tài)并呈球形。因此，我們總結(jié)，在磁力攪拌下，至少需要蒸發(fā)8小時(shí)來(lái)去除有機(jī)溶劑。圖3 不同磁力攪拌時(shí)間對(duì)去除有機(jī)溶劑的影響(A)2小時(shí) (B)4小時(shí) (C)6小時(shí) (D)8小時(shí)表2 攪拌時(shí)間對(duì)納米顆粒大小的影響離心速度的影響: 圖4顯示納米顆粒在不同離心速度下的制備。在每分鐘8000和10000轉(zhuǎn)離心速度下，納米顆粒呈球形，而且不聚集，但是在每分鐘13000和15000轉(zhuǎn)離心速度下會(huì)發(fā)生聚集。每分鐘8000和

17、10000轉(zhuǎn)離心速度相比較，在每分鐘10000轉(zhuǎn)速度下大的納米顆粒伴有小顆粒。圖4 不同轉(zhuǎn)速下納米顆粒大小的電子掃描顯微鏡圖片。(A)8000 (B)10000（C）13000 (D)15000載多西他賽納米顆粒封裝效率的影響因素:在載多西他賽PLGA納米顆粒制備過(guò)程中，對(duì)影響封裝效率的影響因素進(jìn)行了研究。這些因素包括按順序混合的有機(jī)相，藥物用量，超聲功率和時(shí)間，有機(jī)溶劑類型和水相中聚乙烯醇，TPGS或者泊洛沙姆188的濃度。有機(jī)相混合順序的影響: 為了優(yōu)化載多西他賽PLGA納米顆粒的用量，我們對(duì)制備這些顆粒的不同試驗(yàn)條件進(jìn)行了評(píng)價(jià)。我們將有機(jī)相的制備對(duì)顆粒的影響進(jìn)行了評(píng)價(jià)，對(duì)多西他賽封裝效率

18、的影響列于表3中。納米顆粒中，有機(jī)相按照F4方法制備，封裝效率為78.78%，除此之外，初始載藥量的封裝效率僅為3.64%-10.03%。因此，F(xiàn)4被選為有機(jī)相制備的方法。這可能是由于多西他賽和聚合物都溶解時(shí)發(fā)生的不同相互作用，因此導(dǎo)致不同的封裝效率。F4和其他制備方法也有不同聚合物濃度和混合方法，并且藥物和聚合物之間也會(huì)發(fā)生相互作用。表3 多西他賽和PLGA混合順序?qū)Ψ庋b效率的影響藥物用量的影響: 表4顯示初始藥量對(duì)封裝效率的影響。當(dāng)初始載藥量為25mg時(shí)，隨著初始藥量的增加，藥物封裝效率先增加后減小。多西他賽藥量為10mg時(shí)，有最大封裝效率。在我們的試驗(yàn)中，在制劑過(guò)程中初始藥量增加時(shí)，有機(jī)

19、相中的藥物濃度也增加。這表明更多的藥物分子可以和PLGA分子相互作用，導(dǎo)致封裝多西他賽量的增加。然而，封裝量的增加與制劑中藥量的增加不成比例，所以封裝效率下降。表4 藥物用量對(duì)納米顆粒特性的影響超聲影響程度: 表1表明不同超聲參數(shù)對(duì)封裝效率的影響。超聲時(shí)間為5分鐘和10分鐘時(shí)，封裝效率隨著超聲的功率的增加而增加。然而，時(shí)間為2分鐘時(shí)，在此過(guò)程中釋放更高的能量將導(dǎo)致封裝效率的下降。這些結(jié)果表明，超聲時(shí)間為5分鐘和10分鐘時(shí)，增大超聲功率會(huì)增加封裝效率。超聲時(shí)間2分鐘時(shí)，超聲功率高于70瓦則太高而無(wú)法制備穩(wěn)定的納米混懸劑。不同有機(jī)溶劑和表面活性劑的影響: 圖5顯示多西他賽的封裝效率。使用氯仿時(shí)，多

20、西他賽的封裝效率顯著下降。用TPGS制備相同的溶劑則導(dǎo)致最低的封裝效率，使用聚乙烯醇得到最高的封裝效率。圖5 使用不同有機(jī)溶劑和表面活性劑的劑型的封裝效率和百分率X-射線光電子能譜和紅外光譜分析: X-射線光電子能譜是是一種定量技術(shù)，通過(guò)測(cè)量聚合物基質(zhì)5-10 nm深度下電子和原子的結(jié)合能，得到基本的和平均化的化學(xué)組成。X-射線光電子能譜C1s對(duì)載多西他賽納米顆粒表面進(jìn)行封裝，并且其成分被檢測(cè)，結(jié)果展示與表5中。首先，在物理混合物的納米顆粒中有淡信號(hào)的檢測(cè)，這可以表明多西他賽在表面上。氮信號(hào)只是在多西他賽中被發(fā)現(xiàn)就是多西他賽存在于納米顆粒表面的證據(jù)。表5 表面化學(xué)的X-射線電子能光譜多西他賽納

21、米顆粒的紅外光譜顯示在圖6中。多西他賽主要的峰在1725 cm-1附近，PLGA顯示特征的羧酸羰基峰在1750 cm-1附近。物理混合的紅外光譜檢測(cè)顯示了PLGA和多西他賽的主峰。然而，在多西他賽納米顆粒的紅外光譜中，多西他賽的主峰非常低。這顯示PLGA和多西他賽間的相互作用，羧酸在PLGA和多西他賽中酯基相互作用，酯基的吸收頻率相應(yīng)地降低。圖6 表面化學(xué)的傅立葉變換紅外光譜在不同表面活性劑和有機(jī)溶劑條件下的體外釋放: 圖7A顯示三種多西他賽納米顆粒體外釋放動(dòng)力學(xué)。對(duì)所有的表面活性劑，都能夠觀察到初始的爆發(fā)釋放。之后，多西他賽以恒定速率釋放。很明顯，由TPGS和泊洛沙姆188制得的納米顆粒中多

22、西他賽的釋放速率要小于由聚乙烯醇制得的納米顆粒的釋放速度。藥物的擴(kuò)散，腐蝕，聚合物的膨脹，和聚合物基體的降解是藥物釋放的主要機(jī)制。由于PLGA的降解速率緩慢，多西他賽從納米顆粒中主要依靠藥物擴(kuò)散和基體腐蝕。在這種情況下，大小，硬度，和納米粒孔隙度顯著影響釋放特性。掃描電鏡觀察結(jié)果表明，所有類型的納米顆粒都有光滑的表面，這有利于藥物緩慢釋放。而且，大小也是決定釋放速率的重要因素，且用TPGS，聚乙烯醇和泊洛沙姆188 制得的納米顆粒有相似的大小。TPGS和泊洛沙姆188體積較大，且有較大的表面積。因此，用TPGS乳化納米顆粒在體外釋放的速率小于聚乙烯醇，因?yàn)樗胁煌谋砻嫣卣?。圖7B顯示了三種類型的載多西他賽納米顆粒體外釋放動(dòng)力學(xué)常數(shù)。對(duì)所有所有有機(jī)溶劑，都能夠觀察到初始的爆發(fā)釋放。之后，多西他賽以恒定的速率釋放。乙酸乙酯