非諾貝特對(duì)高糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞胞外基質(zhì)產(chǎn)生及降解影響

1、非諾貝特對(duì)高糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞胞外基質(zhì)產(chǎn)生及降解影響                      作者：倪連松，金潔娜，鄭景晨，沈飛霞 【摘要】  目的 ：探討非諾貝特對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)機(jī)制。方法：大鼠腎小球系膜細(xì)胞分別培養(yǎng)在正常糖濃度（5.5 mmol·L-1，對(duì)照組）、高糖濃度（25 mmol·L-1，高糖組）及25 mmol·L-1葡萄糖+非

2、諾貝特100mol·L-1（非諾貝特組）。CCK-8測(cè)定系膜細(xì)胞增殖；ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液型膠原(Col-)、纖維連接蛋白(FN)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1(TGF-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)；明膠酶譜法檢測(cè)培養(yǎng)上清基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9(MMP-2，9)的活性。結(jié)果 ：高糖組系膜細(xì)胞較對(duì)照組出現(xiàn)增殖增加，合成基質(zhì)蛋白Col-，F(xiàn)N增多，MMP-2及MMP-9活性下降，TIMP-1含量增加，TGF-1分泌增加。與高糖組比較非諾貝特干預(yù)后能完全或部分逆轉(zhuǎn)上述變化。結(jié)論 ：非諾貝特能抑制高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞增殖，減少胞外基質(zhì)合成，增加胞外基質(zhì)的降解。 【關(guān)鍵詞】&#

3、160; 糖尿病腎??；非諾貝特；腎小球系膜細(xì)胞Abstract:   Objective: To explore the protective mechanism of fenofibrate on diabetic nephropathy. Methods: Rat mesangial cells (MC) were incubated in media containing 5.5 mmol·L-1 glucose （control group），25 mmol·L-1 high glucose (HG group) and 25 mmol·

4、;L-1 glucose+100mol·L-1 fenofibrate (FB group). Cellular proliferation was assessed with CCK-8. Fibronectin (FN)， type collagen (Col-)，transforming growth factor-1 (TGF-1) and matrix metalloproteinase inhibitor-1(TIMP-1) in supernatant were detected with ELISA method. Activities of matrix metal

5、loproteinase-2，9 (MMP-2，9) in supernatant were detected with gelatinase zymography. Results: Compared with control group， MC in HG group showed a high growth rate and synthesis of Col-and FN were increased ；activities of MMP-2 and MMP-9 decreased，and secretion of TGF-1 and TIMP-1 increased. Compared

6、 with HG group， these changes could be fully or partly reversed by fenofibrate treatment. Conclusion: Fenofibrate can inhibit high glucose-induced proliferation of mesangial cells， decrease synthesis of extracellular matrix， and increase degradation of extracellular matrix. Key words: diabetic

7、nephropathy；fenofibrate；mesangial cells過(guò)氧化物酶體增殖體激活受體(PPARs)是一種配體依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體基因家族。PPARs包括PPAR，PPAR和PPAR三種亞型。最近人們發(fā)現(xiàn) PPAR在腎臟疾病治療中是一個(gè)新的靶點(diǎn)1。PPAR可通過(guò)對(duì)單核巨噬細(xì)胞的影響而發(fā)揮其強(qiáng)大的抗炎作用， 因此PPAR活性改變可能參與腎臟炎癥反應(yīng)過(guò)程1。貝特類(lèi)藥物可通過(guò)激活PPAR，調(diào)整其在腎臟的表達(dá)，從而降低腎血管性腎炎、腎血管性硬化癥及糖尿病腎病等腎病的發(fā)生1。目前，有關(guān)貝特類(lèi)藥物對(duì)糖尿病腎病保護(hù)作用的研究還很少見(jiàn)。為進(jìn)一步證實(shí)貝特類(lèi)藥物對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用，我們

8、擬觀察非諾貝特（FB）對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及其分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分（IV型膠原、纖連蛋白）的影響，并同時(shí)檢測(cè)其對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1（TGF-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)的影響，以探討其作用機(jī)制，并為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。1  材料和方法1.1  材料 大鼠腎小球系膜細(xì)胞（MC）為武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的大鼠腎小球系膜細(xì)胞EC(HBZY-1)，CCTCC編號(hào)：GDC124。非諾貝特（Fenofibrate，F(xiàn)B）購(gòu)自徐州恩華藥業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司（產(chǎn)品批號(hào)：20050501）。CCK-8試劑盒購(gòu)購(gòu)自

9、日本同仁化學(xué)研究所，DMEM培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清為天津正江公司產(chǎn)品。分光光度儀為Backman DU460。酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-tek Instruments ELX 800。IV型膠原（Col-IV）ELISA檢測(cè)試劑盒、TIMP-1 ELISA檢測(cè)試劑盒、TGF-1 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bionewtrans Pharm-aciutical Biotechnology公司，纖連蛋白（FN）ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自大連泛邦化工技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司（日本進(jìn)口分裝）。     1.2  方法1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法&

10、#160;組間差異用單因素方差分析，有顯著差異者用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，組內(nèi)不同時(shí)間比較用兩樣本t檢驗(yàn)。2  結(jié)果2.1  FB對(duì)高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比，24、48及72 h HG組的細(xì)胞存活都有顯著增高，提示高糖可明顯促進(jìn)MC增殖。非諾貝特干預(yù)明顯抑制高糖的促增殖作用，且與HG組比較差異均有顯著性(24、48及72 h)（見(jiàn)表1）。2.2  FB對(duì)高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞上清液中基質(zhì)蛋白表達(dá)的影響 表2結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，高糖刺激24 h與48 h可增加MC上清液中FN的合成。FB干預(yù)24 h與48 h后對(duì)高糖刺激

11、的FN的合成都有明顯的抑制作用，可接近對(duì)照組水平。與對(duì)照組相比，在實(shí)驗(yàn)24 h與48 h，高糖都可刺激MC上清液中Col-IV的合成。FB干預(yù)24 h對(duì)高糖刺激的Col-IV合成的抑制作用不明顯，但干預(yù)48 h則對(duì)COL-IV合成有較明顯的抑制作用。2.3  FB對(duì)高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞上清液中TGF-1及TIMP-1蛋白含量的影響 表3結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，高糖在24 h和48 h都可刺激TGF-1的合成；FB干預(yù)24 h及48 h后對(duì)高糖刺激的TGF-1合成都有顯著的抑制作用。與對(duì)照組相比，高糖在24 h和48 h都可刺激TIMP-1的合成；FB干預(yù)24 h及48 h后對(duì)高

12、糖刺激的TIMP-1的合成有明顯的抑制作用，可達(dá)接近對(duì)照組水平。2.4  FB對(duì)高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞上清液中MMP-2及MMP-9活性活性的影響  見(jiàn)圖1所示，明膠酶譜電泳后發(fā)現(xiàn)凝膠上出現(xiàn)3條透明條帶，其中92 kD為MMP-9相應(yīng)條帶，72 kD為MMP-2酶原相應(yīng)條帶（pro-MMP-2），64 kD為MMP-2活化形式相應(yīng)的條帶。MMP-2表達(dá)強(qiáng)于MMP-9，且MMP2以活性形式為主。表4結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，24 h及48 h高糖刺激下上清液中MMP-2和MMP-9均顯著減少，組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)含量在各時(shí)間點(diǎn)變化不明顯。FB干預(yù)24 h及48 h后MMP-2和MMP-9活性

13、明顯增強(qiáng)，但均未達(dá)到低糖組水平。     3  討論細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)代謝的失平衡（合成增多，降解減少）是糖尿病腎病（DN）形成的關(guān)鍵性因素。Col-IV與FN是構(gòu)成ECM的主要結(jié)構(gòu)蛋白。我們發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)可明顯促進(jìn)MC增殖，并對(duì)系膜細(xì)胞分泌Col-IV和FN有顯著的促進(jìn)作用，這一點(diǎn)同諸多報(bào)道一致2-3?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是ECM主要的降解酶之一，其中起作用的主要是MMP-2及MMP-9。基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑是MMPs天然的特異性抑制因子，在腎臟中起作用的主要為T(mén)IMP-1。我們的研究發(fā)現(xiàn)高糖刺激會(huì)促使系膜細(xì)胞MMP-2及MMP-9表達(dá)

14、顯著下降，而TIMP-1表達(dá)升高。這揭示了高糖不僅可以通過(guò)下調(diào)MMPs的基因表達(dá)而減少其對(duì)ECM的降解，同時(shí)可通過(guò)增加TIMP-1表達(dá)而抑制MMPs酶的活性，最終加速FN、Col-IV等細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。TGF-1既可刺激ECM蛋白質(zhì)合成，又可降低ECM降解酶的活性，從而引起基質(zhì)蛋白沉積。近年來(lái)，TGF-1已被認(rèn)為是MMPs/TIMP系統(tǒng)最重要的調(diào)控因子4。本研究發(fā)現(xiàn)高糖在導(dǎo)致ECM分泌增加、MMPs/TIMP系統(tǒng)的紊亂同時(shí)，也引起TGF-1蛋白分泌的增加，因此ECM的累積及降解減少可能與TGF-1介導(dǎo)有關(guān)。貝特類(lèi)降脂藥物是最先發(fā)現(xiàn)的PPAR合成配體，目前臨床使用的有氯貝特、苯扎貝特及FB等。

15、此外，除了對(duì)脂代謝的影響外，尚可起到抗炎及抗動(dòng)脈硬化的作用5。Park等6報(bào)道16周PPAR基因敲除的糖尿病小鼠較野生型糖尿病小鼠有著更為嚴(yán)重的微量白蛋白尿、腎小球硬化及系膜基質(zhì)的擴(kuò)張；體外研究還顯示FB可明顯下調(diào)高糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞Col-IV及TGF-1的合成。Park等7還發(fā)現(xiàn)FB能顯著改善db/db小鼠的高血糖、胰島素抵抗、尿微量白蛋白及腎小球纖維化。Chen等8報(bào)道FB通過(guò)下調(diào)TGF-1及纖溶酶原激活物抑制物-1的表達(dá)而顯著改善STZ誘導(dǎo)的Wistar大鼠糖尿病腎病的進(jìn)展。也有臨床研究表明，F(xiàn)B治療3年可顯著減少2型糖尿病患者微量白蛋白尿的進(jìn)展9。我們的研究表明，F(xiàn)B干預(yù)除了能明顯

16、減少高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞Col-IV，F(xiàn)N的合成外，還可上調(diào)MMP-2及MMP-9的表達(dá)及減少TIMP-1的分泌，從使MMPs/TIMP-1比值升高，說(shuō)明了FB干預(yù)確實(shí)能有效減輕ECM的積聚，延緩腎小球硬化。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)FB能顯著降低促纖維化因子TGF-1的表達(dá)，提示了FB對(duì)MMPs/TIMP系統(tǒng)的影響可能部分是通過(guò)阻斷TGF-1來(lái)介導(dǎo)的?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1Varghese Z, Moorhead JF, Ruan XZ. The PPARalpha ligandfenofibrate: meeting multiple targets in diabetic nephropa-th

17、y J. Kidney Int, 2006, 69(9): 1511-1517. 2Koya D, Haneda M, Nakagawa H, et al. Amelioration ofaccelerated diabetic mesangial expansion by treatment witha PKC beta inhibitor in diabetic db/db mice, a rodent modelfor type 2 diabetesJ. FASEB J, 2000, 14(3): 439-447.3Park IS, Kiyomoto H, Abboud SL, et a

18、l. Expression of trans-forming growth factor-beta and type IV collagen in earlytreptozotocin-induced diabetes J. Diabetes, 1997, 46(3):473-480.4Border WA, Noble NA. Evidence that TGF-beta should be atherapeutic target in diabetic nephropathyJ. Kidney Int,1998,54(4):1390-1391.5Staels B, Fruchart JC. Therapeutic roles of peroxisomeproliferator-activated receptor agonists J. Diabetes, 2005,54:2460-2470.6Park CW, Kim HW, Ko SH