細胞毒性試驗方案

1、細胞毒性實驗設計方案1. 準備材料：DMEM高糖) 胰酶 雙抗(青霉素/鏈霉素)DAPIMTT(5mg/mL) DMSOPBS 4% 多聚甲醛 指甲油 6 孔培養(yǎng)板96 孔培養(yǎng)板 超薄載玻片培養(yǎng)瓶(25mL) 一包卩m濾膜滅菌： 50mL ， 10mL，5mL離心管兩種槍頭2. 實驗方案本實驗所用的 材料 為載藥的通過二硫鍵橋連透明質(zhì)酸的夾心二氧化硅(SiO2-SS-HA/DOX ,在高谷胱甘肽條件下，二硫鍵斷裂，透明質(zhì)酸脫離，同時 夾心二氧化硅中藥物得以釋放。 本實驗的 目的 為測定透明質(zhì)酸修飾的夾心二氧化 硅(SiO2-SS-HA/DOX 的細胞毒性。實驗組為 SiOzSS-HA/DOX

2、SG-SS-HA、DOX空白對照組為純細胞,分別采用HepG處肝癌細胞為腫瘤細胞模型和L929成纖維細胞為正常細胞模型。采用HepG2人肝癌細胞為腫瘤細胞模型，實驗組為SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX空白對照組為純細胞。培養(yǎng)基中含有10%(v/v) FBS和1%(w/v) 雙抗(青霉素/鏈霉素)。配制不同濃度的SiO2-SS-HA/DOX SiO2、HA DOX藥物載體培養(yǎng)基溶液。(1).以HepG2人肝癌細胞為腫瘤細胞模型：培養(yǎng)基的配置：雙抗 1% 血清12% DMEM 87%具體操作步驟：細胞的復活： 將凍存于液氮中的細胞取出，迅速放入 37 r溫水中，使細胞快速

3、溶解。 將懸浮的細胞移至離心管中，加 5mL無血清培養(yǎng)基，1000rmp,5min離心去上清，再加5mL有血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。(每次轉(zhuǎn)移時，將之前的離 心管洗滌，并用移液槍來回吸，使液體混合均勻。 ) 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞的傳代：將的胰酶分裝至小離心管中，每個管中2mL凍存于-20 r，每次使用一管,避免反復凍融。 將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，蓋子旋緊，噴 75%勺酒精放入超凈臺。 將培養(yǎng)液倒入廢液缸， 殘留培養(yǎng)基用吸管吸干凈， 操作完成后， 培養(yǎng)瓶口用火燒。 加入2mL胰酶將瓶底鋪滿，消化2-3min，于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，呈 圓形，即消化完畢，加入2mL 12% DME終止

4、消化，用槍吹打，使細胞懸浮。 將細胞懸浮液移入lOmL離心管中，lOOOrmp,5min,離心。 迅速倒掉上清，加入 6mLDMEI培養(yǎng)基，分裝至兩個培養(yǎng)瓶中，再各加入2mLDMEM至 5mL于37C, 5%勺CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。下一次傳代步驟同 - 。細胞存活率測定方法(布板，加樣) 同傳代步驟 -。 給每個離心管中加入定量的培養(yǎng)基， 并用移液槍來回吸， 使液體混合均勻， 將所有含有細胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到一個 50mL離心管中，最終使液體體積為30mL 96孔板中每個濃度設計5個復孔，每塊板設一組空白調(diào)零孔，內(nèi)加培養(yǎng)液，不含細胞與藥物，一組空白對照組，只加培養(yǎng)基和細胞，不加藥物。除過空 白調(diào)

5、零孔，每孔加入100卩L含細胞的培養(yǎng)基。將孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保 持一定的濕度，5%(V/V)CO 2,溫度保持在37C,培養(yǎng)22小時。 將谷胱甘肽加入到10mL培養(yǎng)基，充分溶解，濃度為 mL,取2微升的mL谷 胱甘肽溶液加入到10mL的培養(yǎng)基中，將這兩個濃度含谷胱甘肽的培養(yǎng)基替換部 分原來的培養(yǎng)基， 作為對照， 不需要加谷胱甘肽的孔換上新鮮培養(yǎng)基， 將孔板放 入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5% (V/V) CO 2,溫度保持在37C，培養(yǎng)2小時，具體的加樣孔見圖一。 將的SiO2-SS-HA/DOX樣品溶到3mL的培養(yǎng)基中，分成兩份，其中一份里 加入的培養(yǎng)基， 再將稀釋后的含液樣的培

6、養(yǎng)基分成兩份， 其中一份加入新鮮培養(yǎng)基，依此類推，便得到一個濃度梯度的的濃度配制方法同上。SiO2-SS-HA/DOX樣品。SiO2-SS-HA樣品將的SiO2-SS-HA/DOX羊品溶到3mL的培養(yǎng)基中，剩下的步驟同。將配制好的載體溶液替換原來96孔板中的培養(yǎng)基，如圖 1 所示。將孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5%(v/v) CO,溫度保持在37C，培養(yǎng) 24 小時。配制5 mg/mL的MTT溶液，將孔板中的培養(yǎng)更換成 MTT溶液，將孔板放 入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5% (v/v) CO 2，溫度保持在37 C。培養(yǎng)4小時后，將孔板中的培養(yǎng)基取出，用PBS溶液清洗3次，然

7、后向每孔加入100卩L的DMSO溶解孔中的甲瓚，采用酶標儀測定，波長設定為 490nm圖1藥物載體布板示意圖(2).以L929成纖維細胞為正常細胞模型：實驗組為 SiO2-SS-HA/DOX SiOSS-HA、DOX空白對照組為純細胞。實驗 目的為測定藥物載體溶液對正常細胞的細胞毒性。培養(yǎng)基的配置：雙抗 1% 血清 12% DMEM 87%具體操作步驟：細胞的復活： 將凍存于液氮中的細胞取出，迅速放入 37 C溫水中，使細胞快速溶解。 將懸浮的細胞移至離心管中，加 5mL無血清培養(yǎng)基，1000rmp,5min離心去上清，再加5mL有血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。（每次轉(zhuǎn)移時，將之前的離 心管洗滌

8、，并用移液槍來回吸，使液體混合均勻。 ） 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞的傳代：將的胰酶分裝至小離心管中，每個管中2mL凍存于-20 °C,每次使用一管,避免反復凍融。 將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，蓋子旋緊，噴 75%勺酒精放入超凈臺。將培養(yǎng)液倒入廢液缸， 殘留培養(yǎng)基用吸管吸干凈， 操作完成后， 培養(yǎng)瓶口 用火燒。 加入2mL胰酶將瓶底鋪滿，消化2-3min，于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，呈 圓形，即消化完畢，加入2mL 12% DME終止消化，用槍吹打，使細胞懸浮。 將細胞懸浮液移入lOmL離心管中，1000rmp,5min,離心。 迅速倒掉上清，加入 6mLDMEI培養(yǎng)基，分裝至兩個培養(yǎng)瓶

9、中，再各加入 2mLDMEM至5mL于37C, 5%勺CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。 下一次傳代步驟同 - 。細胞存活率測定方法（布板，加樣） 同傳代步驟 -。 給每個離心管中加入定量勺培養(yǎng)基， 并用移液槍來回吸，使液體混合均勻， 將所有含有細胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到一個 50mL離心管中，最終使液體體積為12mL 96 孔板中每個濃度設計 5 個復孔，每塊板設一組空白調(diào)零孔，內(nèi)加培養(yǎng) 液，不含細胞與藥物，一組空白對照組，只加培養(yǎng)基和細胞，不加藥物。除過空白調(diào)零孔，每孔加入100卩L含細胞的培養(yǎng)基。將孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保 持一定的濕度，5%（V/V）CO 2,溫度保持在37C，培養(yǎng)22小時。 將所有加

10、樣的孔換成新鮮培養(yǎng)基， 作為與癌細胞的對照。 將孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5%(v/v) CO,溫度保持在37C,培養(yǎng)2小時。 將的SiO2-SS-HA/DOX樣品溶到1mL的培養(yǎng)基中，分成兩份，其中一份里SiO2-SS-HA/DOX樣品。SiO2-SS-HA樣品加入的培養(yǎng)基，再將稀釋后的含液樣的培養(yǎng)基分成兩份， 其中一份加入新鮮培養(yǎng) 基，依此類推，便得到一個濃度梯度的的濃度配制方法同上。 將的SiO2-SS-HA/DOX羊品溶到1mL的培養(yǎng)基中，剩下的步驟同。將配制好的載體溶液替換原來96孔板中的培養(yǎng)基，如圖2所示。將孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5%(v/v) CO,溫度保持在37C，培養(yǎng) 24小時。配制5 mg/mL的MTT溶液，將孔板中的培養(yǎng)更換成 MTT溶液，將孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5% (v/v) CO 2,溫度保持在37 C。培養(yǎng) 4小時后，將孔板中的培養(yǎng)基取出，用PBS溶液清洗3次，然后向每孔加入100卩L的DMSO溶解孔中的甲瓚，采用酶標儀測定，波長設定為 490nm細胞存活率米用百分比表示：細胞存