PCR技術(shù)克隆目的基因全過程

1、實驗：目的基因克?。?PCR 技術(shù)）【課前預(yù)習(xí)】PCR （polymerase chain reaction） 反應(yīng)的基本原理?！灸康囊蟆?學(xué)習(xí)和掌握 PCR 反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)方法。 2認真完成每一步實驗操作，詳細記錄實驗現(xiàn)象和結(jié)果并加以分析和總結(jié)。【基本原理】類似于 DNA 的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板 DNA的變性：模板 DNA經(jīng)加熱 至93C左右一定時間后， 使模板DNA雙鏈或經(jīng) PCR擴增形成的雙鏈 DNA解離，使之成 為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）

2、：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后， 溫度降至55 C左右，引物與模板 DNA單鏈的互補序列配對結(jié) 合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應(yīng) 原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性 -退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期（Plateau）所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝?！緦嶒炗闷贰?材料：重組質(zhì)粒 DNA 作為模板2器材和儀器：移液器及吸頭，硅烷化的

3、PCR 小管， DNA 擴增儀 （PE 公司） ，瓊脂糖凝 膠電泳所需設(shè)備 （電泳槽及電泳儀 ），臺式高速離心機3試劑： 10X PCR 反應(yīng)緩沖液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris Cl,在 25C下，pH9.0, 1.0 % Triton X-100 。 MgCl2 ： 25mmol/L 。 4 種 dNTP 混合物:每種 2.5mmol/L。 Taq DNA聚合酶 5U/卩l(xiāng)。 T4 DNA 連接酶及連接緩沖液：方法步驟】（一） PCR 反應(yīng)1. 依次混勻下列試劑 35卩I H2 O 5卩I 10 X PCR反應(yīng)緩沖液 4卩I 25mmol/L MgCI2 4卩

4、I 4種dNTP 0.5卩I上游引物（引物1）0.5卩I下游引物（引物2）0.5卩I模板DNA（約1ng）混勻后離心 5秒。2. 將混合物在 94 C下加熱5分鐘后冰冷，迅速離心數(shù)秒，使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5卩I約2.5U ）,混勻后稍離心，加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)混合物上。3. 用94C變性1分鐘，45C退火1分鐘，72C延伸2分鐘，循環(huán)35輪，進行PCR。最后一輪 循環(huán)結(jié)束后，于72 C下保溫10分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴增充分。4電泳按前所述，取10卩I擴增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠進行電泳分析，檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長度。 注意1. PCR非常靈敏，操作應(yīng)盡可能在無菌操作臺中

5、進行。2. 吸頭、離心管應(yīng)高壓滅菌 ， 每次吸頭用畢應(yīng)更換 ， 不要互相污染試劑。3. 加試劑前 ， 應(yīng)短促離心 10 秒鐘， 然后再打開管蓋 ， 以防手套污染試劑及管壁上的試劑污 染吸頭側(cè)面。4. 應(yīng)設(shè)含除模板 DNA 所有其它成分的負對照?！緦嶒灲Y(jié)果】【注意事項】微量操作、 PCR 反應(yīng)體系的設(shè)計、引物設(shè)計、擴增條件的優(yōu)化【思考題 】1. 降低退火溫度對反應(yīng)有何影響？2. 延長變性時間對反應(yīng)有何影響？3. 循環(huán)次數(shù)是否越多越好？為何？4. PCR 有哪些用途？舉例說明。附：PCR知識（供參考）（一） PCR 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件標準的 PCR 反應(yīng)體系：10 X擴增緩沖液10uI4 種 dN

6、TP 混合物 各 200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA 聚合酶 2.5u2+Mg 1.5mmol/L加雙或三蒸水至 100ul2+PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和 Mg引物： 引物是 PCR 特異性反應(yīng)的關(guān)鍵， PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板 DNA 互補 的程度。理 論上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做 引物，利用 PCR 就可將模板 DNA 在體外大量擴增。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則： 引物長度：1 5-30bp ，常用為 20bp 左右。 引物擴增跨度： 以 2

7、00-500bp 為宜，特定條件下可擴增長至 10kb 的片段。 引物堿基： G+C 含量以 40-60%為宜， G+C 太少擴增效果不佳， G+C 過多易出現(xiàn)非特 異條帶。 ATGC 最好隨機分布，避免 5 個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。 引物 3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿 基不配對而導(dǎo)致 PCR 失敗。 引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切 分析或分子克隆很有好處。 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序

8、列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度 0.1lumol或10100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。 酶及其濃度： 目前有兩種 Taq DNA 聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶， 另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR反應(yīng)約需酶量 2.5U（指總反應(yīng)體積為 100ul 時），濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。dNTP 的質(zhì)量與濃度 ： dNTP 的質(zhì)量與濃度和 PCR 擴增效率有密切關(guān)系， dNTP 粉呈顆粒 狀，如保存不當易變性失去生物學(xué)活性。

9、 dNTP 溶液呈酸性， 使用時應(yīng)配成高濃度后， 以 1M NaOH或1M Tris。HCl的緩沖液將其 PH調(diào)節(jié)到7.07.5,小量分裝，-20C冰凍保存。 多次凍融會使 dNTP 降解。在 PCR 反應(yīng)中， dNTP 應(yīng)為 50200umol/L ， 尤其是注意 4 種dNTP 的濃度要相等 （ 等摩爾配制 ）， 如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低 ），就會引起錯配。濃度過低又會降低 PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+ 濃度降低。模板 （靶基因 ）核酸： 模板核酸的量與純化程度，是PCR 成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA 純化方法通常采用 SDS

10、和蛋白酶 K 來消化處理標本。 SDS 的主要功能是： 溶解細 胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶 K 能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與 DNA 結(jié)合的組蛋白，再 用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份， 用乙醇或異丙醇沉淀核酸。 提取的核酸 即可作為模板用于 PCR 反應(yīng)。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解 病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR 擴增。 RNA 模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。Mg2+ 濃度： Mg2+ 對 PCR 擴增的特異

11、性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的 PCR 反應(yīng)中， 各種dNTP濃度為 200umol/L時，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反 應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減 少。PCR 反應(yīng)條件的選擇PCR 反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時間的設(shè)置： 基于 PCR 原理三步驟而設(shè)置變性 -退火 -延伸三個溫度點。在標準反 應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈DNA在9095C變性，再迅速冷卻至 4060C，弓|物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075C,在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因

12、 （長度為 100300bp 時）可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94 C變性，65C左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性 ）。 變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致 PCR 失敗的最主要原因。一般情況 下，93 C94C lmin足以使模板 DNA變性，若低于93C則需延長時間， 但溫度不能過高， 因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。 此步若不能使靶基因模板或 PCR 產(chǎn)物完全變性， 就會導(dǎo) 致 PCR 失敗。 退火（復(fù)性）溫度與時間：退火溫度是影響PCR 特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40C60C，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由

13、于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間， 取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20 個核苷酸， G+C 含量約 50%的引物，55 C為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm 值(解鏈溫度 )=4(G+C) 2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值-(510 C)在 Tm 值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為3060sec,足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 延伸溫度與時間： Taq DNA 聚合酶的生物學(xué)

14、活性：7080 C 150核苷酸/S/酶分子70 C 60核苷酸/S/酶分子55 C 24核苷酸/S/酶分子高于90C時，DNA合成幾乎不能進行。PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075 C之間，常用溫度為 72C,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。 PCR 延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。34kb的靶序列需 34min ;擴增10Kb需 延伸至15min。延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸 時間要稍長些。循環(huán)次數(shù) ：循環(huán)次數(shù)決定 PCR 擴增程度。 PCR 循環(huán)次數(shù)主要取決于模板 DNA 的濃

15、度。 一般的循環(huán)次數(shù)選在 30 40 次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。PCR 反應(yīng)特點特異性強 PCR 反應(yīng)的特異性決定因素為： 引物與模板 DNA 特異正確的結(jié)合; 堿基配對原則; Taq DNA 聚合酶合成反應(yīng)的忠實性; 靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。 引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對 原則的。 聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及 Taq DNA 聚合酶耐高溫性， 使反應(yīng)中模板與引物的結(jié) 合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保 持很高的正確度。 再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)， 其特異性程度就更

16、高。 靈敏度 高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10 -12 g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10 -6 g)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達 3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學(xué)中最小檢出率為3個細菌。簡便、快速 PCR 反應(yīng)用耐高溫的 Taq DNA 聚合酶， 一次性地將反應(yīng)液加好后， 即在 DNA 擴增液和水浴鍋上進行變性 -退火-延伸反應(yīng)，一般在 24小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一 般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。對標本的純度要求低 不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞， DNA 粗制品及總 RNA

17、 均可作為 擴增模板。 可直接用臨床標本如血液、 體腔液、 洗嗽液、 毛發(fā)、細胞、活組織等粗制的 DNA 擴增檢測。PCR 擴增產(chǎn)物分析PCR 產(chǎn)物是否為特異性擴增 ，其結(jié)果是否準確可靠， 必須對其進行嚴格的分析與鑒定， 才能得出正確的結(jié)論。 PCR 產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對象和目的不同而采用不同的分析方 法。凝膠電泳分析： PCR 產(chǎn)物電泳， EB 溴乙錠染色紫外儀下觀察， 初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計的一致，特別是多重PCR,應(yīng)用多對引物，其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)訐的大小，這是起碼條件。瓊脂糖凝膠電泳： 通常應(yīng)用 12%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。聚丙烯酰胺凝膠電泳： 6 1

18、0%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集 中，可用于科研及檢測分析。酶切分析：根據(jù) PCR 產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得 符合理論的片段，此法既能進行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。分子雜交： 分子雜交是檢測 PCR 產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測 PCR 產(chǎn)物堿基突 變的有效方法。Southern 印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈 （內(nèi)部寡核苷酸 ）標記后做探 針，與 PCR 產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測 PCR 產(chǎn)物的靈敏度，還 可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。斑點雜交： 將 PCR 產(chǎn)物點在硝酸

19、纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜 交，觀察有無著色斑點，主要用于 PCR 產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。核酸序列分析：是檢測 PCR 產(chǎn)物特異性的最可靠方法。PCR 常見問題總結(jié)PCR 產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為 48h 以內(nèi)，有些最好于當日電泳檢測，大于 48h 后 帶型不規(guī)則甚致消失。假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及活性 PCR 循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。模板核酸變性不

20、徹底。在酶和引物質(zhì)量好時， 不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理， 模板核酸 提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活： 需更換新酶， 或新舊兩種酶同時使用， 以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo) 致假陰性。需注意的是有時忘加 Taq 酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR 失敗或擴增條帶不理想、 容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看 OD 值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶

21、出現(xiàn)，而且兩 引物帶的亮度應(yīng)大體一致， 如一條引物有條帶， 一條引物無條帶， 此時做 PCR 有可能失敗， 應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。 如一條引物亮度高， 一條亮度低， 在稀釋引物時要平衡其濃度。 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存， 防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分， 導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失 效。引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg 2+離子濃度對 PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響 PCR 擴增產(chǎn)量甚至使 PCR 擴增失敗而不出擴增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進行 PCR擴增采用的體積為 20ul、30ul、50ul?；?00ul，

22、應(yīng) 用多大體積進行 PCR 擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對 PCR 擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出 現(xiàn)假陰性 ;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物 與模板的結(jié)合而降低 PCR 擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水 溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是 PCR 失敗的原因之一。靶序列變異： 如靶序列發(fā)生突變或缺失， 影響引物與模板特異性結(jié)合， 或因靶序列某段 缺失使引物與模板失去互補序列，其 PCR 擴增是不會成功的。假陽

23、性出現(xiàn)的 PCR 擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計不合適： 選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行 PCR 擴增時， 擴增出的 PCR 產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。 需重新設(shè)計引物。靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染： 這種污染有兩種原因： 一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標本前，反應(yīng)管和試劑用紫 外線照射， 以破壞存在的核

24、酸。 二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但 有一定的同源性。 可互相拼接， 與引物互補后， 可擴增出 PCR 產(chǎn)物， 而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生， 可用巢式 PCR 方法來減輕或消除。出現(xiàn)非特異性擴增帶PCR 擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。 非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物 聚合形成二聚體。二是 Mg 2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR 循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量， 往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。 其對策有： 必要時重新設(shè)計

25、引物。 減低酶量或調(diào)換另一 來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93 C變性，65 C左右退火與延伸）。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR 擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有： 減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。PCR 污染與對策PCR 反應(yīng)的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污 染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。污染原因（一）標本間交叉污

26、染 :標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密 封不嚴溢于容器外， 或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標本間污染 ;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴 散，導(dǎo)致彼此間的污染。（二）PCR 試劑的污染 :主要是由于在 PCR 試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及 其它溶液被 PCR 核酸模板污染 .（三） PCR擴增產(chǎn)物污染：這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題，因為PCR產(chǎn)物拷貝量 大（一般為1013拷貝/ml），遠遠高于 PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的 PCR產(chǎn)物 污 染，就可造成假陽就可形成假陽

27、性。 還有一種容易忽視， 最可能造成 PCR 產(chǎn)物污染的形式 是氣溶膠污染 ;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應(yīng)管， 開蓋時、 吸樣時及污染進樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。 據(jù)計算一個氣溶膠顆?？?含 48000 拷貝，因而由 其造成的污染是一個值得特別重視的問題。（四 ） 實驗室中克隆質(zhì)粒的污染 :在分子生物學(xué)實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗 室，這個問題也比較常見。 因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當高， 另外在純化過程中需用 較多的用具及試劑， 而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒， 由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的 生命力，其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測一

28、個好的實驗室， 要時刻注意污染的監(jiān)測， 考慮有無污染是什么原因造成的污染， 以便 采取措施，防止和消除污染。對照試驗1. 陽性對照 :在建立 PCR 反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有 PCR 陽性對照，它 是 PCR 反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽 性對照要選擇擴增度中等、 重復(fù)性好， 經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本， 如以重組質(zhì)粒為陽性對 照，其含量宜低不宜高 （100 個拷貝以下 ），但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本， 其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。 因而當某一 PCR 試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定， 檢驗人員 心中有數(shù)時，在以后的實驗中可免設(shè)陽性

29、對照。2. 陰性對照 :每次 PCR 實驗務(wù)必做陰性對照。 它包括標本對照 :被檢的標本是血清就 用鑒定后的正常血清作對照 ；被檢的標本是組織細胞就用相應(yīng)的組織細胞作對照。試劑對 照 : 在 PCR 試劑中不加模板 DNA 或 RNA ，進行 PCR 擴增，以監(jiān)測試劑是否污染。3. 重復(fù)性試驗4. 選擇不同區(qū)域的引物進行 PCR 擴增防止污染的方法（一）合理分隔實驗室 :將樣品的處理、配制 PCR 反應(yīng)液、 PCR 循環(huán)擴增及 PCR 產(chǎn)物 的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行，特別注意樣本處理及 PCR 產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴格分 開。最好能劃分標本處理區(qū)；PCR反應(yīng)液制備區(qū)：PCR循環(huán)擴增區(qū)；PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實驗用品及吸樣槍應(yīng)專用，實驗前應(yīng) 將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的 DNA 或 RNA 。（二）吸樣槍 :吸樣槍污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍 內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴重的污染源， 因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心， 吸樣要慢， 吸 樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。