內(nèi)抑素在腫瘤生長和動脈粥樣硬化斑塊形成中的作用

1、    內(nèi)抑素在腫瘤生長和動脈粥樣硬化斑塊形成中的作用          摘要內(nèi)抑素是新發(fā)現(xiàn)的很強的血管生成抑制劑。它是膠原的C末端片斷，包含184個氨基酸。內(nèi)抑素能夠特異地抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移并抑制新生血管生成。內(nèi)抑素能夠有效地抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，為腫瘤的治療提供了新的希望。內(nèi)抑素還能夠延緩動脈粥樣硬化的發(fā)展。關(guān)鍵詞內(nèi)抑素；腫瘤；動脈粥樣硬化學(xué)科分類號R73-3； R543.5新生血管的生成是實體瘤生長和轉(zhuǎn)移所必需的。腫瘤在生長過程中能夠分泌一系列的促血管生成

2、因子，如成纖維細(xì)胞生長因子（aFGF和bFGF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等。近年來的研究提出抑制腫瘤血管生成可以有效地阻止腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。這已經(jīng)成為新的治療腫瘤的策略。近幾年已克隆了一系列血管生成抑制因子如內(nèi)抑素、血管抑素、組織型金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)等。其中關(guān)于內(nèi)抑素（endostatin）的研究最多。它是從小鼠內(nèi)皮瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)液中分離出來的一種內(nèi)皮細(xì)胞增殖的特異性抑制劑，具有很強的抑制血管生成的作用。它現(xiàn)已應(yīng)用于臨床。此外，內(nèi)抑素尚能延緩動脈粥樣硬化的發(fā)展。一、內(nèi)抑素的克隆表達1997年，O'Reilly從小鼠的血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞株（EOMA細(xì)胞）培養(yǎng)基中分離出了不同于

3、血管抑素的血管生成抑制劑并將其命名為內(nèi)抑素1。這是一種分子量為20kD的能夠親和肝素的蛋白，它能夠特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。對其氨基酸序列的分析表明它是膠原的C末端片斷，包含184個氨基酸。膠原是由Oh等于1994年首先報道的一種膠原樣蛋白家族成員。人的膠原的基因定位于21q22.3，可以編碼1 516個氨基酸的蛋白質(zhì)，它主要分布于血管周圍區(qū)域。膠原的C端有NC1區(qū)，約300個氨基酸殘基，包括N端結(jié)合區(qū)（約50個殘基），中央的蛋白酶敏感區(qū)（約70個殘基）和C端的穩(wěn)定的內(nèi)抑素區(qū)（約180個殘基）2。內(nèi)抑素包含有鋅結(jié)合位點，位于第1、3、11位的組氨酸和第76位的天冬氨酸，內(nèi)抑素的N端環(huán)繞鋅形成二

4、聚體結(jié)構(gòu)，N端的鋅結(jié)合位點與前體緊密相連，說明鋅可能參與修飾后抑制血管生成活性的激活或修飾過程本身。內(nèi)抑素有11個精氨酸殘基，可與肝素結(jié)合。由于內(nèi)抑素是膠原的一部分，本身沒有信號肽，因此在表達重組內(nèi)抑素時需加一個外源的信號肽才能成為分泌蛋白。常用的信號序列有膠原和Ig鏈的分泌信號序列。O'Reilly等構(gòu)建了內(nèi)抑素的原核表達載體，在大腸桿菌中表達出有活性的內(nèi)抑素，但表達的內(nèi)抑素不溶于水，難以在體外檢測其活性。Dhanabal構(gòu)建了其真核表達載體，從酵母中生產(chǎn)出水溶性內(nèi)抑素2。在蛋白純化過程中，內(nèi)抑素的構(gòu)型易發(fā)生改變，可直接影響到其活性，因此不同實驗室中內(nèi)抑素藥效試驗結(jié)果不盡相同。二、

5、內(nèi)抑素的生物學(xué)作用(一)內(nèi)抑素特異抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成內(nèi)抑素在體內(nèi)以可溶狀態(tài)存在，它是由膠原經(jīng)過蛋白酶作用而裂解出的一個活性片斷。在O'Reilly的研究中，桿狀病毒生產(chǎn)的重組內(nèi)抑素能夠特異地抑制牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。而在其他非內(nèi)皮起源的細(xì)胞如牛主動脈平滑肌細(xì)胞、牛視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、Lewis肺癌細(xì)胞或血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞中，即使增量十倍都未觀察到顯著的抑制作用。因此，內(nèi)抑素對內(nèi)皮細(xì)胞具有特異性抑制作用。在劑量為1020g時，重組內(nèi)抑素能夠顯著抑制雞絨毛膜尿囊（CAM）中的血管生成1。在Dhanabal構(gòu)建的酵母表達內(nèi)抑素系統(tǒng)中，還觀察到內(nèi)抑素可以抑制bFGF誘

6、發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。對VEGF和bFGF誘導(dǎo)的血管生成，內(nèi)抑素（20g）的抑制作用分別為47%和39%2。膠原本身對調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長并無作用。膠原基因敲除的純合子小鼠發(fā)育正常，并未表現(xiàn)出血管形成的異常。因此膠原在胚胎發(fā)育中不是作為一種血管生長的負(fù)調(diào)控因子，而是作為一種具有調(diào)控活性的因子的來源。當(dāng)血管被誘導(dǎo)生成時，完整的膠原分子被蛋白酶水解，釋放出具有抑制血管內(nèi)皮生長活性的C端片斷內(nèi)抑素。直至目前對內(nèi)抑素產(chǎn)生的調(diào)控機制仍不了解，這都有待于進一步工作的闡明。如上所述，內(nèi)抑素含有11個精氨酸，與肝素有很高的親和力。內(nèi)抑素能夠降低IGF-1和bFGF的活性，可能是通過與生長因子信號通路有關(guān)的硫酸肝素結(jié)

7、合而達到的。另有研究表明，內(nèi)抑素可誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，加入內(nèi)抑素可明顯降低Bcl-2和Bcl-xL存活蛋白的表達3。這也可能是內(nèi)抑素抑制內(nèi)皮增殖的機制之一。近來有一項關(guān)于血管抑素（angiostatin）的研究表明血管抑素可與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的ATP合成酶的/亞單位結(jié)合，造成內(nèi)皮細(xì)胞中ATP減少，從而降低其對缺氧的耐受力并造成不可逆損傷4。這為研究內(nèi)抑素作用機制提供了新的思路。目前對內(nèi)抑素作用機制還不清楚，尚需進一步研究。（二）內(nèi)抑素可抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移O'Reilly證明內(nèi)抑素對Lewis肺癌、T241纖維肉瘤、EOMA血管內(nèi)皮瘤、B16F10黑色素瘤的體內(nèi)生長均有抑制作用。內(nèi)抑素皮下注

8、射2.5 mg/kg，每天一次，治療15天，對Lewis肺癌的抑制率約為53%，在10mg/kg劑量下，腫瘤生長抑制率為97%，在20mg/kg時，幾乎全部的腫瘤被抑制。而且在治療中未發(fā)現(xiàn)有藥物毒性的表現(xiàn)。在其他幾種腫瘤模型中也觀察到同樣效果。另外發(fā)現(xiàn)給予每天0.3mg/kg皮下注射，可幾乎全部抑制Lewis肺癌轉(zhuǎn)移灶的生長1。Blezinger等肌肉內(nèi)注射含內(nèi)抑素基因的質(zhì)粒，結(jié)果表明，應(yīng)用240g質(zhì)粒肌肉注射每周一次共兩周，治療第13天，腎癌和Lewis肺癌生長被抑制40%。對腎癌肺轉(zhuǎn)移的模型的研究表明，基因治療能顯著抑制轉(zhuǎn)移灶的生長，肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目下降了85%，肺重量較對照減輕32%5。C

9、hen應(yīng)用編碼內(nèi)抑素和血管抑素的質(zhì)粒與脂質(zhì)體復(fù)合物治療實驗性乳腺癌，瘤內(nèi)注射的抑制率分別為49%和36%，靜脈注射內(nèi)抑素的抑制率為40%6。結(jié)果提示，應(yīng)用內(nèi)抑素基因治療腫瘤亦有明顯效果，且一次注射，長期有效。內(nèi)抑素抑制腫瘤生長可能與其抑制血管生成和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。血管生成在腫瘤生長中起重要作用，一個內(nèi)皮細(xì)胞可支持50100個腫瘤細(xì)胞的生長。有研究表明，腫瘤細(xì)胞離血管越遠(yuǎn)，其增殖率亦越低，這與其氧供和營養(yǎng)不足有關(guān)。在腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞的數(shù)目與內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目是相關(guān)的，它們之間能夠互相促進，內(nèi)皮細(xì)胞越多，血管越豐富，腫瘤細(xì)胞增殖率也越高。因此抑制血管生長能夠顯著抑制腫瘤生長。內(nèi)抑素還可能通過誘

10、導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而抑制其生長。O'Reilly研究表明內(nèi)抑素治療組較對照組中腫瘤細(xì)胞凋亡增加了7倍1。Blezinger的研究也發(fā)現(xiàn)內(nèi)抑素基因治療可促進腫瘤細(xì)胞凋亡5。但目前關(guān)于內(nèi)抑素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機制尚不十分了解，有待于進一步闡明。（三）內(nèi)抑素能夠延緩動脈粥樣硬化的發(fā)展內(nèi)膜增生是動脈粥樣斑塊形成的一個重要機制，而內(nèi)膜下血管的形成是斑塊形成的必需條件。Moulton利用Apo E缺失突變的小鼠制作動脈粥樣硬化的模型，從第6周起給予膽固醇飼料喂養(yǎng)，從第20周開始以20mg/kg內(nèi)抑素皮下注射，每天一次，持續(xù)16周，可明顯抑制動脈粥樣斑塊的生長，主動脈起始部斑塊生長的抑制率可高達85%7

11、。在正常血管中，血管壁中的微血管網(wǎng)局限于外膜中，在動脈粥樣硬化的血管中，血管網(wǎng)變得更加豐富并延伸至斑塊的內(nèi)膜。這些內(nèi)膜血管大部分是從原有的外膜血管網(wǎng)中分支而來，斑塊血管中內(nèi)皮細(xì)胞增殖率可高達43%。這些新生血管可促進炎癥細(xì)胞向斑塊中浸潤并誘發(fā)正反饋調(diào)節(jié)而促進斑塊生長。另外，當(dāng)斑塊生長超過一定厚度（>0.25mm）時，單純依靠營養(yǎng)物質(zhì)從管腔浸潤已不能滿足其代謝需要，血管生成成為斑塊生長必不可少的前提條件。內(nèi)抑素可抑制斑塊內(nèi)膜血管生成從而抑制動脈粥樣硬化斑塊的生長。Moulton等還發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)膜血管增生期（2036周）給予內(nèi)抑素治療顯著抑制斑塊的生長（85%），而當(dāng)內(nèi)膜血管已經(jīng)建立后（324

12、8周）治療，抑制效果就會減弱。在動脈粥樣硬化的早期，內(nèi)膜血管還未增生（622周）時給予內(nèi)抑素對斑塊生長并無抑制作用。這說明內(nèi)抑素主要是通過抑制內(nèi)膜血管生成而抑制斑塊生長的。三、結(jié)語內(nèi)抑素是新發(fā)現(xiàn)的強有力的血管生成抑制劑。它的抗腫瘤作用給腫瘤治療帶來了新的思路和希望。目前內(nèi)抑素已完成臨床前研究進入臨床試驗。內(nèi)抑素的抑制動脈粥樣硬化發(fā)展的作用為內(nèi)抑素增添了新的應(yīng)用價值。因此，進一步研究血管的生成和抑制，開拓新的血管生成和抑制劑不僅具有重要的理論意義，亦具有重要的應(yīng)用價值。朱建健（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部心血管基礎(chǔ)研究所，北京 100083）高煒（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部心血管基礎(chǔ)研究所，北京 100083）陳光慧（北

13、京大學(xué)醫(yī)學(xué)部心血管基礎(chǔ)研究所，北京 100083）參考文獻1，O'Reilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin: A endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell, 1997, 88277285.2，Dhanabal M, Ramchandran R, Volk R, et al. Endostatin: Yeast production, mutants, and antitumor effect in renal cell carcinoma. Cancer R

14、esearch, 1999, 59189197.3，Dhanabal M, Ramchandran R, Waterman MJ, et al. Endostatin induces endothelial cell apoptosis. J Biol Chem, 1999, 2741172111726.4，Moser TL, Stack MS, Asplin L, et al. Angiostatin binds ATP synthase on the surface of human endothelial cells. Cell Biology, 1999, 9628112816.5，B

15、lezinger P, Wang J, Gondo M, et al. Systemic inhibition of tumor growth and tumor metastases by intramuscular administration of the endostatin gene. Nat Biotechnol, 1999, 17343348.6，Chen QR, Kumar D, Stass SA, et al. Liposome complexed to plasmids encoding angiostatin and endostatin inhibit breast cancer in nude mice. Canc