兩液相培養(yǎng)中有機溶劑對細胞毒性的研究進展

1、    兩液相培養(yǎng)中有機溶劑對細胞毒性的研究進展吳兆亮胡濱鄭輝杰元英進 分類號：Q813.11文獻標識碼：B 文章編號：1004-311X(2000)02-0037-04 在生物化學工程中，細胞培養(yǎng)-分離耦合過程的研究越來越引起人們的重視1，其主要原因一是為了減少代謝產(chǎn)物的反饋作用，提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)率，促進更多的細胞培養(yǎng)工業(yè)化進程；二是為了協(xié)調(diào)上游和下游加工過程，使整個過程的研究得到優(yōu)化，以提高生產(chǎn)效率，降低生成成本。因此近十年細胞培養(yǎng)-分離耦合過程的研究有了較大的發(fā)展?？梢哉f幾乎所有主要的生化分離技術(shù)都有用在細胞培養(yǎng)-分離耦合過程的研究上。但研究較多的是

2、細胞培養(yǎng)與萃取分離耦合，即兩液相培養(yǎng)，并證明這是一項很有用的技術(shù)。 兩液相培養(yǎng)研究所涉及的內(nèi)容很多，但最重要的是如何篩選出萃取能力強，而且對細胞毒性小的合適有機溶劑。一般而言，考慮有機溶劑對代謝產(chǎn)物的萃取能力不是很困難，但考察有機溶劑對細胞的相容性卻困難得多。因此有機溶劑對細胞毒性的研究是一個熱點。最初Laane C等用不同的參數(shù)研究有機溶劑對生物催化劑作用的影響2，得出反映有機溶劑對生物催化劑作用影響最合適參數(shù)及其變化規(guī)律。在此基礎(chǔ)上，其他研究者進行了有機溶劑對微生物3，4、植物細胞5，6毒性的研究，同時也進行了如何減少有機溶劑對細胞毒性的研究7，8，從而通過許多研究者的努力，得出篩選有機溶

3、劑的一些基本原則9，10。 盡管如此，對于某一兩液相培養(yǎng)體系要篩選出合適的有機溶劑仍是一項艱巨的工作，而且就有機溶劑對細胞毒性的機理認識以及涉及到的許多技術(shù)問題遠沒有得到解決。本文在簡要闡述有機溶劑對細胞毒性的測定方法與分類的基礎(chǔ)上，評述了近十年有機溶劑對細胞毒性研究的進展，就如何深入開展有機溶劑對細胞毒性的研究提出幾點建議。 1有機溶劑對細胞毒性的測定方法與分類 1.1有機溶劑對細胞毒性的測定方法 有機溶劑對細胞毒性的測定方法分為短期毒性測定方法和長期毒性測定方法。 短期毒性測定方法是將有培養(yǎng)基的細胞和有機溶劑作短時間的培養(yǎng)，與無有機溶劑的細胞培養(yǎng)相比，以其氧消耗的測量值的差異作為有機溶劑短

4、期毒性的指標參數(shù)。有關(guān)攝氧率的測定方法有瓦氏呼吸儀法13、物料衡算法及電極法14。對于搖瓶培養(yǎng)體系，溫志友等開發(fā)出一種簡便測定攝氧率的方法15。 長期毒性測定方法是將有培養(yǎng)基的細胞和有機溶劑作長時間培養(yǎng)，與無有機溶劑的細胞培養(yǎng)相比，以其細胞生長和代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的差異作為有機溶劑長期毒性指標參數(shù)。 1.2有機溶劑對細胞毒性的分類 有機溶劑對細胞毒性分為分子毒性和相毒性。分子毒性指在兩液相培養(yǎng)中，很少量溶解在胞外培養(yǎng)液中的有機溶劑及有機相與細胞的接觸中，導(dǎo)致酶的抑制、蛋白質(zhì)變性和膜的改性，從而影響細胞的正常生長；相毒性指有機相萃取胞外培養(yǎng)液中的營養(yǎng)組分，特別是微量組分而影響細胞的正常生長。 2關(guān)聯(lián)有

5、機溶劑對生物萃化劑活性影響的參數(shù)研究 有機溶劑對生物萃化劑活性影響的參數(shù)很多。Brink L E S等11用34種有機溶劑的極性、分子量和在水中溶解度等參數(shù)進行研究。一般認為有機溶劑極性越小，分子量越大，在水中的溶解度越小，則有機溶劑對生物萃化劑活性影響越小。 為了進一步定量研究有機溶劑對生物萃化劑活性的影響，Lanne C等2考察了107種有機溶劑的介電常數(shù)、偶極矩、氫鍵、極化強度和LogP值(P為有機溶劑在辛醇和水兩相體系中的分配系數(shù))等參數(shù)，認為只有LogP值能很好預(yù)測生物相容性。一般LogP值大于4的有機溶劑對生物催化劑活性無影響，因此是生物相容的；LogP值小于2的有機溶劑對生物催化

6、劑活性影響很大，因此是生物非相容的；而LogP值介于2至4之間的有機溶劑對生物催化劑活性影響適中，可能是生物相容的，也可能是非生物相容的。 有機溶劑的LogP值，一是可以從文獻中查出2，4；二是根據(jù)疏水常數(shù)進行計算12；三是進行實測。對于兩種有機溶劑混合物的LogP值，其值根據(jù)下面計算式計算2。LogPm=X1LogP1+X2LogP2；其中X為有機溶劑的分子分數(shù)。 3兩液相培養(yǎng)中有機溶劑對細胞的毒性 3.1微生物發(fā)酵中有機溶劑對細胞的毒性：在兩液相培養(yǎng)的微生物發(fā)酵中，許多研究者探索了有機溶劑的分子毒性，認為有機溶劑的LogP值能很好地表征有機溶劑對細胞毒性的影響，但得出有機溶劑對細胞毒性隨有

7、機溶劑的LogP值變化規(guī)律不完全一樣。Hocknall M D等17認為LogP2的有機溶劑對節(jié)桿菌細胞有毒性，LogP在2-4之間的有機溶劑不確定，LogP4的有機溶劑則無毒性；Vermue M等4認為LogP3的有機溶劑對節(jié)桿菌和諾卡氏菌的革蘭氏陽性菌和不動桿菌及假單胞菌的革蘭氏陰性菌有毒性，LogP在3-5之間的有機溶劑不確定，LogP5的有機溶劑則無毒性；Bruce L等10認為LogP4的有機溶劑對釀酒酵母和梭菌細胞有毒性，LogP在4-6之間的有機溶劑不確定，而LogP6的有機溶劑則無毒性。實驗所用的有機溶劑有不同的飽和烴、烯烴、氟代烴、醇、脂、醚和芳香烴等。Vermue M 等4

8、研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌對有機溶劑的敏感性比革蘭氏陽性菌強，有機溶劑的毒性對細胞生長有影響。 3.2植物細胞培養(yǎng)中有機溶劑對細胞毒性：在植物細胞兩液相培養(yǎng)中，也有許多研究者深入探索了有機溶劑的分子毒性和相毒性。Bassetti L 等6在檄樹細胞培養(yǎng)生產(chǎn)蒽醌研究中，用LogP為-0.8至11.6的33種有機溶劑進行實驗，結(jié)果表明LogP5的有機溶劑具有毒性，18天觀察不到細胞生長和蒽醌產(chǎn)生，特別是LogP4的有機溶劑毒性更大，只有LogP5的8種有機溶劑不影響細胞的活性。因此在隨后的研究中，選擇了Log=8.7的十六烷作為萃取劑。吳兆亮等18在紅豆杉細胞兩液相培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇過程中，系統(tǒng)研究了不同的

9、有機溶劑(烷烴、有機酸、醇和脂)對細胞生長和紫杉醇合成的影響。結(jié)果油酸和鄰苯二甲酸二丁脂對細胞毒性較小，且能大幅度提高紫杉醇產(chǎn)量。傅旭慶等19在紫草細胞兩液相培養(yǎng)生產(chǎn)紫草寧中，得出十六烷和油醇對細胞生長影響小，且能有效提高產(chǎn)物合成速率。 4減小有機溶劑對細胞毒性的策略 4.1有機溶劑的選擇：兩液相培養(yǎng)中，關(guān)鍵是確定合適的有機溶劑。其最重要的二點要求，一是對細胞不產(chǎn)生毒性而不影響其細胞的生長；二是對代謝產(chǎn)物有較大的萃取能力，以發(fā)揮有機溶劑的作用，減少有機溶劑在反應(yīng)器中所占的體積。實際上高分配系數(shù)和好的生物相容性往往不可兼得。針對篩選合適的有機溶劑，一些研究者作了不少研究，其中Kollerup F

10、20，21開發(fā)了一個叫ESP(Extractant Screening Program)的計算機軟件用于乙醇萃取發(fā)酵中萃取劑的選擇，有一定參考價值；Bruce L J等10采用混合溶劑也有一定效果。由于培養(yǎng)體系極其復(fù)雜，要真正解決萃取劑的選擇問題，還有大量工作要做。 4.2有機溶劑的加入時間：吳兆亮等在紅豆杉細胞兩液相培養(yǎng)中，研究了有機溶劑的加入時間對細胞生長的影響，結(jié)果表明東北紅豆杉18、南方紅豆杉22，有機溶劑在細胞的生長對數(shù)期中期至末期加入使細胞的濕重、干重和細胞水含量下降較小。因此為減少有機溶劑對細胞的毒性，在培養(yǎng)過程中應(yīng)在細胞的生長對數(shù)期中期至末期加入對細胞生長影響最小。 4.3有機

11、溶劑的加入量：吳兆亮等在紅豆杉細胞兩液相培養(yǎng)中，也研究了有機溶劑的加入量對細胞生長影響，結(jié)果表明東北紅豆杉18、南方紅豆杉2，有機溶劑油酸、鄰苯二甲酸二丁脂，隨著有機溶劑體積分數(shù)增加(0-0.1)，細胞的濕重、干重和細胞水含量逐漸下降，有機溶劑對細胞毒性增加。因此為減少有機溶劑對細胞毒性，有機溶劑加入量越少越好，但有機溶劑加入量太少又起不到萃取作用，有機溶劑加入量有一個最佳值。 4.4有機溶劑的預(yù)處理：將萃取劑預(yù)先用等量培養(yǎng)基飽和，以減少有機溶劑的相毒性。吳兆亮等18研究結(jié)果表明，有機溶劑對紅豆杉細胞的生長有一定影響。為了減少有機溶劑的相毒性，有機溶劑應(yīng)經(jīng)預(yù)處理，實際生產(chǎn)中，還應(yīng)綜合考慮生產(chǎn)成

12、本。 4.5采用細胞固定化技術(shù)：在細胞兩液相培養(yǎng)中，可采用細胞固定化技術(shù)，以避免有機相中的有機溶劑與細胞直接接觸，減少有機溶劑對細胞的毒性8。Kim D J等23在紫草細胞兩液相培養(yǎng)(十六烷作有機溶劑)中，細胞固定化技術(shù)(藻朊酸鈣作加強載體)使得細胞比生長速率顯著提高。 4.6采用膜萃取技術(shù)：膜萃取是膜過程與液液萃取過程相結(jié)合的新型傳質(zhì)分離技術(shù)。膜萃取過程中料液相與有機相由微孔膜隔開，傳質(zhì)過程在膜孔中進行。優(yōu)點是不存在通常液液萃取過程中的液滴分散和聚合現(xiàn)象，避免了有機溶劑直接與細胞的接觸，減少有機溶劑對細胞的毒性24-26。 4.7減少溶于培養(yǎng)液的有機溶劑對細胞的毒性：有機溶劑對細胞的分子毒性

13、中一部分為溶于培養(yǎng)液中的有機溶劑所引起7。因此為減少溶于培養(yǎng)液的有機溶劑對細胞的毒性，一方面有機溶劑在培養(yǎng)液中的溶解度盡可能??；另一方面可采取特殊工藝技術(shù)。YabannavAr V M等7在乳桿菌兩液相培養(yǎng)(油醇作為萃取劑)中，采用固定在角叉聚糖卡拉膠基質(zhì)里的豆油能捕獲溶于培養(yǎng)液中的有機溶劑，從而降低了其分子毒性。 5幾點建議 5.1深入研究有機溶劑選擇規(guī)律。確定細胞兩液相培養(yǎng)合適的有機溶劑的一般過程認為22：一是根據(jù)有機溶劑的LogP值初步確定一定數(shù)量的不同有機溶劑；二是在這些有機溶劑中，測定代謝產(chǎn)物在有機溶劑和培養(yǎng)液中的分配系數(shù)，去掉分配系數(shù)小的有機溶劑；三是研究在細胞兩液相培養(yǎng)過程中，留

14、下的不同有機溶劑對細胞生長和生產(chǎn)的影響。因此要確定細胞兩液相培養(yǎng)合適的有機溶劑是研究中難度很大的一項工作。所以有必要根據(jù)細胞的生理生化特性和有機溶劑特性，對有機溶劑選擇規(guī)律作深入的研究，探索更簡便、針對性更強的選擇方法。 5.2加強有機溶劑對細胞毒性的動力學研究。迄今為止，有機溶劑對細胞毒性的研究僅限于一些實驗數(shù)據(jù)的報道，對其動力學物理和數(shù)學模型還未見報道。吳兆亮等22提出了有機溶劑毒性參數(shù)(10-LogP)使得所建立的植物細胞兩液相培養(yǎng)動力學模型不僅能反映兩液相培養(yǎng)中細胞生長的變化規(guī)律，而且將有機溶劑毒性參數(shù)(10-LogP)取為零，有機溶劑體積分數(shù)為零，其模型能反映單液相培養(yǎng)中(無有機溶劑

15、的細胞懸浮培養(yǎng))細胞生長的變化規(guī)律。然而，這方面的研究還很初淺，有待作深入的研究。 5.3加強有機溶劑對細胞毒性的機理研究。根據(jù)細胞的生理特性，細胞死亡分為兩大類27，一類是生理性細胞死亡；另一類是病理性死亡，其主要原因是有害信號的極度刺激造成細胞損傷引起的。對于有機溶劑對細胞毒性而引起的細胞死亡屬于病理性死亡。有關(guān)生理性細胞死亡的研究較多，而病理性細胞死亡的研究還很少。由于這兩類細胞死亡在細胞形態(tài)上表現(xiàn)不同28，因此應(yīng)從細胞學特性和分子機制信息深入研究有機溶劑對細胞毒性的機理，從理論上探索減少有機溶劑對細胞毒性的新途徑。 5.4重視兩液相培養(yǎng)體系流變特性和混合特性的研究。兩液相培養(yǎng)體系中，有

16、氣、液(水相)、液(有機相)和固四相，其體系流變特性和混合特性極其復(fù)雜，特別是有機溶劑在培養(yǎng)液中的分散度一方面直接影響有機溶劑對細胞的毒性；另一方面因控制有機溶劑在培養(yǎng)液中的分散度而調(diào)整操作條件對細胞生長也有影響。 5.5將新工藝和新技術(shù)應(yīng)用于兩液相培養(yǎng)，可望有效減少有機溶劑對細胞的毒性，甚至使得有些毒性大的有機溶劑(對代謝產(chǎn)物萃取能力大)也可用于兩液相培養(yǎng)。如上面所述的膜萃取很有希望用于兩液相培養(yǎng)，但目前還有許多技術(shù)問題，比如膜組件的價格、膜的抗污染性、膜的通量、有機溶劑對膜的影響等。 作者單位：吳兆亮（河北工業(yè)大學生物工程系，天津300130） 胡濱（河北工業(yè)大學生物工程系，天津30013

17、0） 鄭輝杰（河北工業(yè)大學生物工程系，天津300130） 元英進（天津大學生物化工系，天津300072） 參考文獻： 1Cen P L,Tsao G T.Sep Technol.1993,3:58-61. 2Laane C,Boeren S,Vos K,Veeger C.Biotechnol Bioeng.1987,30:81-87. 3Inose A,Horikoshi K.J Ferment Bioeng.1991,71:194-196. 4Vermne M,Sikkema J,Verheul A,Bakker R,Tramper J.Biotechnol Bioeng.1993,42:7

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