低分子量透明質(zhì)酸增強(qiáng)HAV抗原誘導(dǎo)的小鼠體液免疫應(yīng)答的研究

1、低分子量透明質(zhì)酸增強(qiáng)HAV抗原誘導(dǎo)的小鼠體液免疫應(yīng)答的研究             作者：舒曉明, 胡凝珠, 蘭蕓, 陶里, 陳陽(yáng), 羅愛(ài)華, 胡云章【摘要】  目的: 研究?jī)?nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)分子低分子量透明質(zhì)酸作為天然佐劑對(duì)HAV抗原誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答的影響。方法: 將ICR小鼠分成9組, 分別設(shè)生理鹽水對(duì)照組、 HAV抗原組、 HAV抗

2、原+鋁佐劑組、 HAV抗原+低分子量透明質(zhì)酸50 g組、 HAV抗原+低分子量透明質(zhì)酸100 g、 HAV抗原+低分子量透明質(zhì)酸200 g、 HAV抗原+低分子量透明質(zhì)酸300 g、 HAV抗原+低分子量透明質(zhì)酸500 g、 HAV抗原+低分子量透明質(zhì)酸1 mg組, 皮下免疫小鼠。分別在4、 8、 12 、 16周用ELISA法檢測(cè)小鼠血清抗HAV IgG水平。結(jié)果: （1）空白對(duì)照組在4、 8、

3、 12 和16周未見(jiàn)抗HAV IgG產(chǎn)生; 各實(shí)驗(yàn)組抗HAV IgG水平在8周時(shí)達(dá)到最高; 12周和16周時(shí)各免疫組的抗HAV IgG水平逐漸下降, 尤以鋁佐劑組下降明顯; （2）與HAV抗原組相比, 低分子量透明質(zhì)酸各免疫組小鼠血清抗HAV IgG水平明顯升高（P<0.05）; 與鋁佐劑組相比, 低分子量透明質(zhì)酸免疫組明顯增強(qiáng)特異性抗HAV IgG水平（P<0.05或P>0.05）; （3）低分子量透明質(zhì)酸安全無(wú)毒, 

4、;無(wú)過(guò)敏反應(yīng)()。結(jié)論: 低分子量透明質(zhì)酸能夠明顯增強(qiáng)滅活HAV抗原的體液免疫應(yīng)答, 具有強(qiáng)的免疫佐劑作用。其免疫佐劑效應(yīng)優(yōu)于鋁佐劑。 【關(guān)鍵詞】  透明質(zhì)酸 危險(xiǎn)信號(hào) 佐劑  免疫佐劑對(duì)輔助抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持久高水平的免疫應(yīng)答十分重要1, 透明質(zhì)酸（hyalouronan acid, HA）是從動(dòng)物組織提取的一種黏多糖, 由（14）D葡糖醛酸和（1 3）N乙?；鵇氨基葡糖雙糖單位重復(fù)連接組成。透明質(zhì)酸是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分而廣泛分布于細(xì)胞外基質(zhì), 它是構(gòu)

5、成皮膚、 玻璃體、 關(guān)節(jié)滑液和軟骨組織的重要成分, 具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能。近年研究表明, 低分子量透明質(zhì)酸是免疫系統(tǒng)的一種重要內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào), 與TLR2作用后, 以依賴(lài)于MyD88、 IL1R相關(guān)激酶、 TNFR相關(guān)因子6、 蛋白激酶C、 NFB的方式進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo), 激活機(jī)體的天然免疫應(yīng)答2。因此我們推測(cè)低分子量透明質(zhì)酸可能具有免疫佐劑的特性。本研究中以低分子量透明質(zhì)酸作為疫苗佐劑, 與HAV抗原混合后皮下免疫接種小鼠, 觀察內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)分子低分子量透

6、明質(zhì)酸對(duì)HAV抗原誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答的影響, 以探討低分子量透明質(zhì)酸作為疫苗佐劑的可行性(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 )。1  材料和方法God defend me from my friends; form my enemy I can defend myself.  1.1  材料  ICR健康小鼠(SPF級(jí), 雌性, 68周齡, 質(zhì)量1820 g), 由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所靈長(zhǎng)類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供, 并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的方法飼養(yǎng)。酶標(biāo)

7、儀（BioRAD Microplate reader Model 550）購(gòu)自美國(guó)BioRAD公司?？笻AV IgG ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自KPL公司, 酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó)eBioscienc公司。滅活HAV抗原和Al(OH)3佐劑均由本室保存。低分子量透明質(zhì)酸（相對(duì)分子量（Mr）為10000以下）購(gòu)自江蘇鎮(zhèn)江東元生物科技有限公司。  1.2  方法Know thyself.  A thing is bigger for being shared.  2  

8、結(jié)果Knowledge will not be aquired without pain and application.  2.1  低分子量透明質(zhì)酸安全性  （1）低分子量透明質(zhì)酸的異常毒性試驗(yàn): 試驗(yàn)期內(nèi)所有動(dòng)物均未出現(xiàn)松毛、 縮團(tuán)、 發(fā)抖等異常反應(yīng); 進(jìn)食、 飲水、 糞便和精神等均正常。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后所有動(dòng)物均健在且質(zhì)量增加, 說(shuō)明低分子量透明質(zhì)酸安全無(wú)毒。（2）低分子量透明質(zhì)酸的刺激性試驗(yàn): 在小鼠股四頭肌注射低分子量透明質(zhì)酸48 h后解剖觀察局部組

9、織無(wú)充血、 水腫及硬結(jié)等異常變化; 小鼠后掌注射48 h后解剖觀察局部也無(wú)異常變化。表明低分子量透明質(zhì)酸劑量為5 mg時(shí)安全無(wú)毒性。（3）低分子量透明質(zhì)酸的過(guò)敏反應(yīng): 小鼠在過(guò)敏試驗(yàn)中未出現(xiàn)蜷縮、 豎毛、 流淚、 噴嚏、 搔鼻、 抽搐、 痙攣、 呼吸困難、 水腫及休克等過(guò)敏反應(yīng)。2.2  不同劑量低分子量透明質(zhì)酸免疫增強(qiáng)效應(yīng)  初免后4、 8、 12、 16周檢測(cè)抗HAV IgG水平,&

10、#160;結(jié)果顯示生理鹽水空白對(duì)照組檢測(cè)不到抗HAV IgG, 各實(shí)驗(yàn)組小鼠在4周內(nèi)均產(chǎn)生抗HAV IgG; 隨著時(shí)間推移呈上升趨勢(shì), 到第8周達(dá)到抗體滴度的峰值, 此后逐漸下降; 但是不同劑量透明質(zhì)酸免疫組的抗體水平仍然明顯高于HAV單獨(dú)抗原免疫組以及鋁佐劑組。不同劑量低分子量透明質(zhì)酸免疫組在同一時(shí)間的抗體水平不同, HAVHA4、 HAVHA5和HAVHA6組在8周時(shí)產(chǎn)生的抗HAV IgG的水平較高, 分別為1(359.19±2.25)、 1(320±

11、3.46)、 和1(285.09±3.10); 且HAVHA5和HAVHA6組的抗體水平能夠長(zhǎng)時(shí)間維持在較高水平, 至16周時(shí)兩組的抗HAV IgG水平分別為1(160±1.55)和1(113.13±2.25), 而其他實(shí)驗(yàn)組抗HAV IgG水平均已明顯下降。提示低分子量透明質(zhì)酸的免疫增強(qiáng)效應(yīng)在一定范圍內(nèi)可能與免疫劑量成量效依賴(lài)性。    各低分子量透明質(zhì)酸免疫組的免疫效應(yīng)與HAV抗原單獨(dú)免疫組的免疫效應(yīng)相比較, 結(jié)果顯示, 4周、 8

12、周、 12周和16周時(shí)結(jié)果顯示不同劑量低分子量透明質(zhì)酸免疫組的抗HAV IgG水平均明顯高于HAV抗原單獨(dú)免疫組, 在4周時(shí)HAVH6免疫組的抗HAV IgG水平最高, 為1(201.59±3.10), 約為HAV抗原單獨(dú)免疫組的7倍, 二者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。8周時(shí)HAVHA1組、 HAVHA4組、 HAVHA5組、 HAVHA6組與HAV抗原單獨(dú)免疫組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05, 圖1）。至12周和16周時(shí), 所有劑量的低分子量透明

13、質(zhì)酸免疫組的抗HAV IgG水平與HAV抗原單獨(dú)免疫組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05, 圖1）。這些結(jié)果表明, 低分子量透明質(zhì)酸能夠增強(qiáng)HAV抗原的特異性體液免疫應(yīng)答, 具有免疫佐劑效應(yīng)。    各低分子量透明質(zhì)酸免疫組的免疫效應(yīng)與鋁佐劑組的免疫效應(yīng)相比較, 結(jié)果顯示, 除HAVH3免疫組的抗HAV IgG水平在4周時(shí)低于鋁佐劑免疫組以外, 其他各低分子量透明質(zhì)酸免疫組的抗HAV IgG水平在4、 8、 12和16周時(shí)均要明顯高于鋁佐劑組。

14、雖然在4周和8周時(shí)各低分子量透明質(zhì)酸免疫組的抗體水平明顯高于鋁佐劑免疫組, 但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在12周時(shí)結(jié)果顯示, HAVHA1組、 HAVHA4組、 HAVHA5組和HAVHA6組與鋁佐劑組的抗HAV IgG水平相比, 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05, 圖1）; 而HAVHA2免疫組、 HAVHA3免疫組的抗HAV IgG水平與鋁佐劑組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。至16周時(shí), HAVHA2組、 HAVHA3組和HAVHA5組與鋁佐劑組的抗HAV IgG水平相比,

15、0;具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）; 而其余低分子量透明質(zhì)酸免疫組的抗HAV IgG水平與鋁佐劑組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明低分子量透明質(zhì)酸不僅具有免疫佐劑作用, 增強(qiáng)特異性的抗HAV IgG水平, 而且其佐劑效應(yīng)在一定劑量范圍內(nèi)和一定時(shí)間內(nèi)優(yōu)于鋁佐劑。圖1  不同時(shí)間小鼠血清抗HAV IgG水平（略）aP<0.05與HAV組; cP<0.05與HAVAL組.  3  討論    目前鋁佐劑是惟一批準(zhǔn)應(yīng)用于人的疫苗佐劑,

16、 但是鋁佐劑存在誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答, 而細(xì)胞免疫很弱, 與IgE型過(guò)敏性疾病有關(guān)等弊端等3。理想疫苗佐劑應(yīng)該是既能增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答, 又能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答, 且無(wú)毒副作用1。因此, 研究開(kāi)發(fā)新型疫苗佐劑, 以替代鋁佐劑成為疫苗佐劑的研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn), 細(xì)胞損傷釋放的內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)分子具有刺激樹(shù)突狀細(xì)胞成熟, 增加共刺激分子如CD86和CD83等的表達(dá), 促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌; 介導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用4, 5。提示內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)分子可能作為有效的內(nèi)源性免疫佐劑, 增強(qiáng)

17、T淋巴細(xì)胞對(duì)外來(lái)抗原的免疫應(yīng)答。    為了探討內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)分子低分子量透明質(zhì)酸作為疫苗佐劑的可行性, 本研究中采用滅活HAV抗原和低分子量透明質(zhì)酸進(jìn)行不同劑量配比, 通過(guò)免疫小鼠觀察了抗HAV IgG水平的變化, 并對(duì)低分子量透明質(zhì)酸作為佐劑與鋁佐劑的效應(yīng)比較進(jìn)行了初步探討。研究證實(shí), 低分子量透明質(zhì)酸聯(lián)合滅活HAV抗原進(jìn)行免疫, 有效地誘導(dǎo)了抗HAV IgG的產(chǎn)生。與單獨(dú)滅活HAV抗原組相比, 不同劑量低分子量透明質(zhì)酸免疫組其產(chǎn)生的特異性抗體水平均明顯高于HAV抗原單獨(dú)

18、免疫組, 其差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）, 提示低分子量透明質(zhì)酸具有免疫佐劑效應(yīng); 與鋁佐劑組相比, 不同劑量的低分子量透明質(zhì)酸免疫組其誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫增強(qiáng)效應(yīng)在不同時(shí)期顯示優(yōu)于鋁佐劑或與鋁佐劑相當(dāng); 且本研究結(jié)果還提示在一定范圍內(nèi)隨著低分子量透明質(zhì)酸的劑量的增加, 抗HAV IgG的水平逐漸增高, 即其抗HAV IgG水平與低分子量透明質(zhì)酸在一定范圍內(nèi)可能呈量效依賴(lài)性。低分子量透明質(zhì)酸是細(xì)胞外基質(zhì)成分, 屬于內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)分子, 具有無(wú)毒安全性高、 結(jié)構(gòu)明確、&#

19、160;易于生產(chǎn)和價(jià)格便宜等特點(diǎn), 符合理想疫苗佐劑的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了低分子量透明質(zhì)酸安全無(wú)毒。    綜上所述, 本實(shí)驗(yàn)以低分子量透明質(zhì)酸作為新型疫苗佐劑,能夠有效地增強(qiáng)滅活HAV抗原的體液免疫應(yīng)答, 而且不同劑量低分子量透明質(zhì)酸免疫增強(qiáng)效應(yīng)顯示相當(dāng)于或優(yōu)于鋁佐劑, 且低分子量透明質(zhì)酸的免疫增強(qiáng)作用持續(xù)時(shí)間要長(zhǎng)于鋁佐劑。因此, 通過(guò)本研究提示, 低分子量透明質(zhì)酸可以作為一種潛在的新型人用疫苗佐劑。同時(shí), 隨著許多重大疾病如HBV、 HIV、 腫瘤等嚴(yán)重危害

20、著人類(lèi)的健康, 開(kāi)發(fā)新型治療性疫苗迫在眉睫, 而尋找一種佐劑能夠協(xié)同疫苗抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生CTL免疫效應(yīng), 達(dá)到治療疾病的作用是一種非常有潛力的策略。因此, 我們下一步的工作將進(jìn)一步研究低分子量透明質(zhì)酸是否能夠誘導(dǎo)強(qiáng)的CTL免疫反應(yīng)。  【參考文獻(xiàn)】  1 周 伊, 齊 旭, 肖菊香, 等. 新型佐劑SWZY對(duì)弱免疫原性小鼠黑色素瘤瘤苗的免疫增強(qiáng)作用J. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2006, 22(4): 526-529.2

21、 Scheibner KA, Lutz MA, Boodoo S, et al. Hyaluronan fragments act as an endogenous danger signal by engaging TLR2J. J Immunol, 2006, 177(2): 1272-1281. 3 王 健, 冷 靜,