杜鵑花葉片總RNA的改良CTAB法提取

1、杜鵑花葉片總RNA的改良CTAB法提取 作者：郭秀蓮，張正銀，田萍，羅紹銀，白潔，莊平【摘要】 目的研究杜鵑花葉片總RNA的提取方法。方法一種適合富含次生代謝產物的杜鵑花葉片總RNA的提取方法改良CTAB法。采用CTAB作為去污劑，分別用氯仿和水飽和酚反復抽提以及高濃度NaCl沉淀，以去除蛋白質、多糖和次生代謝物等雜質，最后用無水乙醇沉淀獲得總RNA。結果該方法不僅使所獲得的總RNA完整性好，純度高，而且操作簡單、快速、成本低廉。結論該方法對杜鵑花等富含次生代謝產物的植物特別是富含多酚、多糖的材料的總RNA提取具有借鑒意義。 【關鍵詞】 RNA提取； 杜鵑花； 改良CTAB法 ChinaAbs

2、tract：ObjectiveTo study the method for isolation of total RNA from Rhododendron leaf. MethodsAn improved CTAB method was presented here to be suitable for isolation of total RNA from Rhododendron leaf , a plant which contained abundant secondary metabolites. Using chemical CTAB as detergent in the e

3、xtraction buffer, the absolute ethanol precipitation of RNA was performed finally after removing of protns, polysaccharides, and secondary metabolites by subsequent chloroform, H2O-saturated phenol extraction and high concentration NaCl precipitation, respectively.ResultsThe yielded total RNA had in

4、tegrality and high purity but. Conclusion The method may be applied to some difficult RNA extraction plants full of polyphenol and polysaccharides, particularly Rhododendron.Key words： RNA extraction; Rhododendron; Improved CTAB Method杜鵑花葉片中的蛋白質、多糖、多酚等次生物質含量多且復雜，嚴重影響了其RNA的提取質量，從而給此類植物的基因工程研究帶來了諸多阻礙。

5、由于多糖類膠狀物質會嚴重堵塞過濾柱，所以即使使用商業(yè)提取試劑盒也不能得到高質量的RNA；另外，這類次生代謝物含量多的材料，市售的RNA提取試劑的針對性也不強，不僅操作麻煩費時，而且很難同時解決RNA的質量和得率問題。雖然目前已建立了很多針對富含多糖多酚材料的RNA提取方法15，但還沒有以杜鵑花為材料提取RNA的報道。因此，本實驗以杜鵑花葉片為材料，借鑒CTAB法6并進行了改良，提出一套適合提取杜鵑花葉片總RNA方法。 1 材料與儀器 1.1 試劑與儀器提取液配方：2%CTAB(W/V)，4%PVP(W/V)，100mmolL-1Tris-HCl(pH8.0)，25 mmolL-1EDTA(pH

6、 8.0)，5 molL-1NaCl，混勻滅菌121，15 min，滅菌后加入體積分數2%的2-硫基乙醇。 DEPC購自Amresco公司；瓊脂糖購自Sigma 公司；rTaq酶，dNTPs購自TaKaRa（大連）有限公司；引物由Invitrogen公司合成。其他試劑均為國產分析純。冷凍離心機：Centrifuge 5804 R(Eppendorf 公司)；電泳儀：DYY- 1型穩(wěn)壓儀(北京六一儀器廠)；紫外凝膠成像系統(tǒng)：Bio IMAGING SYSTEM(SYNGENE)；紫外可見分光光度計：TU-1800(北京普析通用儀器有限責任公司)；PCR 儀：Personalcycler (Bio

7、metra 公司)。1.2 材料多年生杜鵑花葉片采自龍池華西亞高山杜鵑園，采下后立即用液氮澆淋，于-70 貯存?zhèn)溆谩? 方法 2.1 幾種試劑盒法提取杜鵑花葉片總RNARNA plant試劑提取法：試劑購自TIANGEN公司，實驗操作按照說明書進行；TRI Reagent 試劑提取法：試劑購自Ambion公司，實驗操作按照說明書進行；RNeasy Plant Mini Kit試劑提取法：試劑購自QIAGEN公司，試驗操作按照說明書進行。2.2 改良CTAB法提取程序：稱取100 mg的杜鵑花葉片，迅速放入液氮研磨至粉末狀，轉入1.5 ml離心管內，加入65預熱的0.75ml提取液，渦旋振蕩混勻

8、后65溫浴20 min。加入與提取液等體積的水飽和酚，振蕩搖勻，4 12 000 rmin-1離心10min。上清轉入新的無RNase離心管；加入與提取液等體積的氯仿異戊醇(241)混勻，4，12 000 rmin-1離心10 min。吸上清裝入新的離心管里，加入1/2上清體積5 molL-1 NaCl，搖晃混勻，再加入1/2體積氯仿，振蕩混勻，4 ，12 000 rmin-1離心10 min。上清液轉入新的無RNase離心管并加入等體積的異丙醇，溫和混勻后室溫放置10 min，4 12 000 rmin-1離心10 min，小心倒掉上清液；加入1 ml 70%乙醇，4 12 000 rmin

9、-1離心1 min，小心倒掉上清液；加入3050 l DEPC處理水溶解沉淀。加入DNase I(10 Ul-1)1 l混勻，37溫浴30 min。加入100 l DEPC處理水稀釋后，再加入等體積的氯仿異戊醇(241)抽提一次 ，4，12 000 rmin-1離心10 min。吸上清液，加入1 ml無水乙醇， -20靜置2 h。4，12 000 rmin-1離心5 min棄上清液，用70%的乙醇洗滌。4，12 000 rmin-1離心10 min棄上清，干燥后加入20l DEPC處理水保存?zhèn)溆谩?.3 RNA完整性與質量檢測使用各種方法提取時，樣品的起始量均為100 mg，得到的RNA樣品都

10、稀釋10倍后取1 l進行非變性瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察提取的RNA完整性。取1 l樣品，稀釋50倍，紫外分光光度計測量其在230 nm，260 nm，280 nm處的紫外吸光值(A)。 計算 A260 nm/A280 nm，A260 nm/A230 nm用于純度分析。2.4 RT-PCR按TaKaRa公司AMV反轉錄酶操作手冊進行。合成一對克隆18S rRNA序列的引物18S A(5-CAACCATAAACGATGCCGACC-3)和18S B (5-CAGCCTTGCGACCAT ACTCCC-3)，以反轉錄產物為進行PCR擴增。擴增條件為94 5 min；94 40 s63

11、 40 s72 90 s，30個循環(huán)；72 7 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。2.5 杜鵑花 hsp70基因cDNA 片段的克隆根據已知植物hsp70基因核甘酸序列（mRNA）的保守區(qū)域設計合成下述4個正向或反向簡并引物做巢式PCR。外測為C1: 5-GGNATHGAYYTNGGNACN- 3，C2: 5- NCCNGCRTC YTTNGTNGC -3；內測為D1: 5-GAYCARGGNAAYMGNACNACNCC-3，D2: 5-RTCRTT RAARTANGCNGGNAC-3。預期PCR產物片段大小為350 bp左右。以上述cDNA為模板，用Taq DNA聚合酶進行巢式P

12、CR擴增，以引物C1，C2進行巢式PCR的首輪擴增，反應體系為cDNA 1 l 、10PCR 緩沖液(無Mg2+)2 l 、dNTP (2.5 mmol L-1) 2.4 l 、rTaq 酶0.25 l (2 UL-1)，以及C1、C2(100 molL-1)各1 l，Mg2+（25 mmol L-1）2.4 l，加ddH2O 至20 l。擴增條件為：94 預變性5 min，94 50 s，49 50 s ，72 1 min ，共30個循環(huán)，最后72 延伸10 min。 取首次擴增產物1 l，稀釋20 倍作為第2輪擴增的模板，用引物D1、D2進行巢式PCR的第二輪擴增，反應體系與巢式PCR的首

13、輪擴增相同,擴增條件為：94 預變性5 min，94 50 s，50 50 s ，72 1 min，共30個循環(huán)，最后72 延伸10 min。 3 結果 3.1 RNA完整性分析通過瓊脂糖凝膠電泳可以直觀地看到（見1），改良CTAB法提取的杜鵑花葉片總RNA，條帶清晰，完整，不拖尾(泳道1，2)，說明在該方法中RNA很少降解。而RNAplant試劑提取的RNA (泳道3，4)，在初始加入材料量相同的情況下，條帶較暗也就是得率較低。而TRI Reagent 試劑盒和RNeasy Plant Mini Kit 試劑盒均未能提取得到杜鵑花葉片總RNA。3.2 RNA 完整性分析及質量檢測用紫外分光光

14、度計測量改良CTAB法得到的RNA樣品的A260 nm、A280 nm和A230 nm值。經過多次實驗的結果 計算 ， A260/ A280平均約為2.02，A260/A230平均約為1.97。A260/A280和A260/A230比值均在許可范圍內。在RNA得率方面，用100 mg鮮重的起始材料，可得到20 g左右的總RNA。3.3 PCR驗證以改良CTAB法提取的RNA進行反轉錄產物為，用18S A，18S B為引物進行PCR。實驗結果表明，能成功地擴增出長度為110 bp左右的目的片段。這進一步說明本實驗法提取的RNA樣品完整，可以用于后續(xù)試驗(見圖2)。3.4 杜鵑花 hsp70基因c

15、DNA 片段的擴增采用簡并引物C1和C2進行巢式PCR第1輪擴增僅得到模糊的條帶，進一步采用內側錨定簡并引物D1和D2進行巢式PCR的第2輪擴增到1條約350 bp的DNA片段，與預計的目的片段相似（見圖3）?；厥蘸罂寺≈羛MD18-T載體(TaKaRa)，轉化感受態(tài)DH5，利用D1、D2引物，將通過菌落PCR反應檢測得到陽性克隆進行測序，得到366bp的cDNA片段。測序后通過NCBI上的BLAST工具分析，證實為hsp70基因序列。 4 討論 能否有效抑制RNase，去除多糖、酚葉片中含有大量的多酚，多糖，對RNA的提取方法提出了更高的要求。本實驗采用CTAB(十六烷基溴化三甲胺)裂解植物

16、材料，與細胞中的核酸形成核酸-CTAB復合體，這類復合物沉淀的時候將蛋白、多糖、色素以及多酚類化合物與核酸分離開來。利用水飽和酚可以部分去除DNA，獲得DNA殘留極少的RNA，減少DNA污染；同時，由于水飽和酚的加入，提高了去除蛋白質的效率，使得氯仿抽提次數在提取過程中減少，本實驗中只需再進行一次氯仿：異戊醇抽提，就能使有機相與水相的界面清亮，徹底去除蛋白，避免了反復操作。近年來已有關于去除植物多糖和酚類物質的相關報道，但不同植物或同一植物的不同品種往往因種屬差異，材料組織內多糖或多酚的組分和含量有很大不同，所以需要采用不同的RNA提取方法。有研究表明，在高濃度Na+或K+的存在條件下，通過氯

17、仿抽提可以去除一些多糖，經過本實驗確定，與高濃度的KAc相比，高濃度的NaCl去除樣品中多糖的效果更好，從而建立了有效提取樣品RNA的方案。與傳統(tǒng)CTAB法相比，本實驗減少了用LiCl選擇性沉淀RNA過夜的步驟，改為分級去除雜質，節(jié)省了試驗時間，有利于減少RNA的降解和損耗，提高了樣品的質量。RNA plant試劑對于杜鵑花這種多酚，多糖含量都很高的材料，效果一般，可能多糖形成難溶的膠狀物，與RNA共沉淀下來7。本實驗所用的藥品、試劑都較為常用，采用該方法能在一天內完成RNA的提取，并得到質量很高的產品，相比購買市售的RNA提取試劑盒或傳統(tǒng)CTAB法，具有花費少、易操作、耗時短、成效高的優(yōu)點。

18、【 參考 文獻 】 1張玉進，孟祥春，潘瑞熾，等.非洲菊花瓣總RNA提取方法的改進J.植物學通報, 2001, 18 (6):722.2張今今，王躍進，王西平，等.葡萄總RNA提取方法的研究J.果樹學報，2003， 20 (3):178.3侯義龍，張開春，吳祿平，等.果樹組織中總RNA提取的新方法J.沈陽大學學報,2002,33(2):122.4A. da Silva Gestra, F. Micheli, C. Fortes Ferrra. Isolation and purifcation of functional total RNA from diverse organs of cacao tree during its interaction with the pathogen Crinipillis perniciosaJ. BioTechniques,2003, 35: 495.5Jackola L, Pirttila A.M, Halonen M,et