人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定-2019年文檔

1、人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2011.08.004組織工程的一個(gè)研究重點(diǎn)， 是種子細(xì)胞的來(lái)源。 研究發(fā)現(xiàn)脂 肪組織含有一種被稱(chēng)為 ADSCS勺細(xì)胞，它具有一般干細(xì)胞的特 性，與骨髓干細(xì)胞相比，它具有明顯優(yōu)勢(shì)，在來(lái)源、取材、擴(kuò)增 能力方面， 都是骨髓干細(xì)胞所無(wú)法比擬的， 可作為種子細(xì)胞應(yīng)用 于組織工程。材料與方法試劑與儀器：低糖DMEI培養(yǎng)液，1型膠原酶，胎牛血清， PBS緩沖液，0.25%胰蛋白酶，恒濕培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，細(xì)胞 計(jì)數(shù)儀，流式細(xì)胞儀， 低速水平離心機(jī)， 超凈工作臺(tái)， CD29、CD44、 CD105。脂肪組織來(lái)源： 實(shí)驗(yàn)所

2、用成人脂肪組織來(lái)自蚌埠醫(yī)學(xué)院第一 附屬醫(yī)院抽脂術(shù)的健康女性，年齡 2545歲。脂肪干細(xì)胞的原代培養(yǎng)：無(wú)菌條件下提取脂肪組織約15g，PBS液洗去紅細(xì)胞。眼科剪剔除脂肪組織中可見(jiàn)血管，剪碎至細(xì) 小顆粒，0.1% I型膠原蛋白酶消化，1500r/分離心10分鐘，去 除脂肪細(xì)胞及上清液， D-hanks 液重懸沉淀， 200 目細(xì)胞篩過(guò)濾， 1500r/ 分離心 10 分鐘，所得細(xì)胞提取物用含 15%胎牛血清的高 糖DMEM培養(yǎng)液重懸，以適當(dāng)密度接種于無(wú)菌培養(yǎng)瓶中， 在37C、 CO2體積分?jǐn)?shù)為5%飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育，5天后首次換液， 之后 3 天換液 1 次，待原代細(xì)胞達(dá) 85%融合時(shí)消化傳代

3、。脂肪干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到85%融合時(shí)，以0.25%胰蛋白酶將貼壁細(xì)胞消化分離 35分鐘，1 ：2進(jìn)行傳代， 接種于 25ml 培養(yǎng)瓶中， 3 天換液 1 次，當(dāng)貼壁細(xì)胞接近融合時(shí) 再次傳代。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)相關(guān)抗原： 流式細(xì)胞儀對(duì)第 3 代脂肪干細(xì)胞 表面相對(duì)特異性抗原進(jìn)行檢測(cè)。 0.25%胰蛋白酶消化待檢細(xì)胞，1500r/分離心10分鐘，在細(xì)胞沉淀中（細(xì)胞數(shù)量約 1X 106）分別加入FITC-CD44熒光抗體，PE-CD29熒光抗體，APC-CD105熒 光抗體各20卩l(xiāng) , 4C孵育30分鐘，再用PBS緩沖液清洗2遍， 最后用 10%福爾馬林

4、固定細(xì)胞，上機(jī)測(cè)定抗原的陽(yáng)性率。結(jié)果脂肪干細(xì)胞的形態(tài)：將有脂肪干細(xì)胞貼壁的培養(yǎng)瓶口旋緊， 水平放置在倒置顯微鏡下觀察，在原代細(xì)胞培養(yǎng) 24小時(shí)后可見(jiàn) 少量較大的呈梭形的脂肪干細(xì)胞貼壁， 4天首次換液，細(xì)胞清晰 可見(jiàn)，呈多角形、紡錘形，集落樣生長(zhǎng)。 9 天后細(xì)胞生長(zhǎng)明顯增 加，呈渦旋狀生長(zhǎng)。從原代培養(yǎng)到第 1 4天時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞鋪滿瓶底 80%左右。而傳代細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯快于原代細(xì)胞。傳代后細(xì)胞增殖明顯加快，于第 3 天開(kāi)始數(shù)量明顯增多， 56 天后細(xì)胞即 已長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底，細(xì)胞排列更加整齊有序，雜質(zhì)細(xì)胞極少見(jiàn)。見(jiàn) 圖 1 、2。脂肪干細(xì)胞的表型特征： 流式細(xì)胞儀分析第 3 代的脂肪干細(xì) 胞的細(xì)胞表型

5、，CD29陽(yáng)性率為86%± 2% CD44陽(yáng)性率為93%± 1% CD105陽(yáng)性率為78%±2%見(jiàn)圖3。討論脂肪干細(xì)胞的鑒定， 尚無(wú)直接的方法。 一般通過(guò)培養(yǎng)過(guò)程中 出現(xiàn)的分化表型逆推得知。研究證實(shí)多種干細(xì)胞皆可表達(dá)CD44，用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞 CD4 4陽(yáng)性表達(dá)，表明細(xì)胞源自干 細(xì)胞1。免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示， CD29、CD44、CD105、 CD13是間充質(zhì)干細(xì)胞的特征性表面標(biāo)志。它們?cè)谥靖杉?xì)胞中 陽(yáng)性表達(dá)說(shuō)明脂肪干細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞表型2。圖 3 脂肪干細(xì)胞的表型特征陶凱等 3通過(guò)不同血清濃度作用下生長(zhǎng)曲線繪制發(fā)現(xiàn)， 在血清濃度為 15%和 20%時(shí)，在最短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞可進(jìn)入平臺(tái)期， 達(dá)到細(xì)胞增殖高峰期，綜合考慮性?xún)r(jià)因素，實(shí)際應(yīng)用中可將 15% 作為血清的最適宜濃度。 通過(guò)兩代生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)， 第 2代細(xì)胞較 原代細(xì)胞更快進(jìn)入增殖高峰，即細(xì)胞在最初傳代后，生長(zhǎng)加快， 與實(shí)際培養(yǎng)中所見(jiàn)的適度傳代促進(jìn)增殖相一致。 筆者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程 中也得到了相似的結(jié)論。 需要強(qiáng)調(diào)