靜脈移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)脊髓損傷后GDNF基因的表達(dá)

1、靜脈移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)脊髓損傷后GDNF基因的表達(dá)         【摘要】  目的探討經(jīng)靜脈移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對(duì)大鼠脊髓損傷(SCI)后膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)表達(dá)的影響。方法MSCs提取自成年Wistar大鼠的股骨干骨髓，經(jīng)原代培養(yǎng)、鑒定及5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)核標(biāo)記。以改良Allens打擊裝置制作大鼠T10節(jié)段脊髓損傷(SCl)模型，于傷后立即縫合切口并經(jīng)尾靜脈注射移植MSCs。實(shí)驗(yàn)共分為3組：MSCs尾靜脈移植組(A組)、生理鹽水注射組(B組)、正常對(duì)照組

2、(C組)。術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用免疫組化法和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RTPCR)觀察MSCs移植后的存活狀態(tài)以及不同時(shí)間點(diǎn)GDNF基因的表達(dá)變化。結(jié)果免疫組化結(jié)果：MSCs經(jīng)尾靜脈移植后在損傷脊髓平面可以檢測到遷移及存活，標(biāo)記細(xì)胞呈棕黃色的核標(biāo)記，以損傷區(qū)域?yàn)槎嗖⑾蛑車w移，移植術(shù)后第14 d，A組Brdu陽性細(xì)胞較多，最遠(yuǎn)于距離損傷區(qū)2.5 cm處可檢測到。B及C組則均未檢測到陽性細(xì)胞。RTPCR結(jié)果：移植術(shù)后第1、3、5 d，A組表達(dá)量呈逐漸升高趨勢，B組呈一過性表達(dá)升高，C組無變化。各時(shí)間點(diǎn)A組GDNF mRNA的表達(dá)量明顯高于B組，P0.05。免疫組化結(jié)果：移植術(shù)后第7、14、28 d GD

3、NF的表達(dá)量明顯高于B組，P0.05。結(jié)論骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)尾靜脈移植后可遷移至脊髓損傷區(qū)域，并上調(diào)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因的表達(dá)，是該移植方式修復(fù)大鼠脊髓損傷的機(jī)制之一。 【關(guān)鍵詞】  脊髓損傷 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子Effects of mesenchymal stem cells intravenous transplantation on the glial cell line derived neurotrophic factor after the spinal cord injury of rats   Abstract：Ob

4、jectiveTo observe the effects of mesenchymal stem cells (MSCs)injection from tailvein on the expression of glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF) after the spinal cord injury (SCI) of rats.MethodMSCs were cultured from the thighbone of adult wistar rats.The T10 level spinal cord injury w

5、as execute by the modifyAllens device. The MSCs labeled by bromodeoxyuridine were transplanted into the vein of tail by injection immediately after spinal cord injury. Adult Wistar rats were randomly divided into three groups: SCI cured with MSCs transplantation (group A), SCI received normal saline

6、(group B),and control group (group C). Then MSCs were detected and the expressions of GDNF of the lesion and neighbor areas were examined by Reversetranscription  polymerase  chain  reaction  (RTPCR)  and  immunohistochemistry.ResultImmunohistochemistry: MSCs labeled by

7、 bromodeoxyuridine could be detected in the injuried spinal cordafter transplantation. It was located at the nucleolus of MSCs. The cells survived and migrated rostrallyand caudally from the injection sites. With the time passed, the number of MSCs labeled withbromodeoxyuridine was decreased. RT-PCR

8、: The expression of Group A was increased on the followedday, and the expression of Group B was increased on the 1st day but decrease from the 5th day then pared with group B, transplantation of MSCs significantly enhanced the expression of GDNF mRNA than groupA on the 1st, 3rd, 5th day after cell t

9、ransplantation(P0.05), and also significantly enhanced the expression of GDNF on the 7th,14th, 28th day similarly(P0.05). Conclusion Mesenchymal stem cells can migrate to the spinal cord injuried site and upregulate the expressions of glial cell line derived neurotrophic factor by the methods ofinje

10、ction transplantation. It is one of the mechanism of repairing the spinal cord injury by Mesenchymalstem cells transplantation  Key words：spinal cord injury;  mesenchymal stem cells;  glial cell line derived neurotrophic factor     目前，脊髓損傷(spinal cord injury，S

11、CI)的臨床治療主要是控制繼發(fā)性損傷，解除脊髓的壓迫癥狀并重建脊柱的穩(wěn)定性。如何橋接脊髓斷端并重建神經(jīng)傳導(dǎo)通路目前仍處于研究階段。近來的研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞移植有望成為解決該問題的途徑之一1。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)來源于自體，具有增殖能力強(qiáng)、多向分化、排斥反應(yīng)低等優(yōu)點(diǎn)而受到關(guān)注2。本研究通過靜脈移植MSCs，探討治療SCI的新途徑及可行性。1  材料和方法1.1  動(dòng)物與試劑  Wistar雄性大鼠63只，DMEM培養(yǎng)基、bFGF(堿性成纖維生長因子)，EGF(表皮生長因子)，叔丁基對(duì)羥基茴香醚(BHA)、

12、二甲亞砜(DMSO)、胎牛血清，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)檢測試劑盒、GDNF一抗，組化檢測試劑盒，mRNA提取試劑盒(Trizol試劑盒)、PCR反應(yīng)試劑盒(大連寶生生物公司)。1.2  MSCs的培養(yǎng)及大鼠SCI模型的建立  MSCs的培養(yǎng)方法及鑒定參照既往研究3，待MSCs大約長至50匯合時(shí)，加入Brdu標(biāo)記培養(yǎng)基，于37、5CO2培養(yǎng)箱中培育30 min后，調(diào)整細(xì)胞密度為(1×104l)。參照文獻(xiàn)4制作大鼠T10節(jié)段SCI模型，以鼠尾痙攣性擺動(dòng)、雙下肢軟癱為統(tǒng)一的損傷標(biāo)準(zhǔn)，蛋白膠封閉椎管缺損，逐層縫合。傷后立即經(jīng)尾靜脈移植MSCs，A組以

13、ml注射器緩慢注入MSCs約0.5 ml，B組注入等量生理鹽水，C組未損傷脊髓。1.3  GDNF mRNA的檢測  移植術(shù)后1、3、5 d快速取材，A組與B組(4只時(shí)點(diǎn))，C組(2只時(shí)點(diǎn))。首先抽提總mRNA，以逆轉(zhuǎn)錄(RT法)先合成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。GDNF引物序列：F5TTTTATTCAAGCCACATCA3，R5AGCCCAAACCCAAGTCAG3；預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物長為203 bp。以actin作內(nèi)對(duì)照，引物序列為：F5GATTGCCTCAGGACATTTCTG-3，R5-GATTGCTCAGGACATTTCTG-3；擴(kuò)增產(chǎn)物長為690 bp；產(chǎn)物經(jīng)

14、電泳后用圖像分析儀掃描，經(jīng)凝膠圖像系統(tǒng)行光密度分析，目的基因與內(nèi)對(duì)照積分光密度值(IDV)的比值為相對(duì)表達(dá)量。1.4  Brdu標(biāo)記細(xì)胞及GDNF的組化檢測  移植術(shù)后第7、14、28 d灌流固定取材，A組與B組(4只時(shí)點(diǎn))，C組(2只時(shí)點(diǎn))，包埋、脫臘、酒精水化、PBS漂洗、胰酶滴片、BSA封閉，加入一抗Brdu小鼠抗大鼠單克隆抗體，二抗孵育30 min，PBS阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、DAB顯色，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用常規(guī)SABC法檢測GDNF的表達(dá)，以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，片厚40 m，DAB顯色。所有圖像經(jīng)

15、平均灰度值的分析，予半定量檢測。1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析  所有指標(biāo)以(±s)表示，SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件作方差分析。2  結(jié)果2.1  Brdu陽性細(xì)胞的檢測  A組，Brdu陽性細(xì)胞在移植后第7 d可檢測到，為棕黃色的核標(biāo)記，近損傷區(qū)陽性細(xì)胞較多(圖1)，移植術(shù)后第14 d，A組Brdu陽性細(xì)胞繼續(xù)增多，最遠(yuǎn)于距離損傷區(qū)2.5 cm處仍可檢測到。B及C組均未見陽性細(xì)胞。A組與B組之間差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A組的Brdu陽性細(xì)胞為108±5.6mm2，B組與C組無陽性細(xì)胞，P0.01)，移植術(shù)后第28

16、 d，標(biāo)記MSCs逐漸減少。         圖1  移植后Brdu標(biāo)記的細(xì)胞(10×40)（略）2.2  GDNF mRNA的表達(dá)變化(圖2)  GDNF mRNA在正常大鼠脊髓(C組)內(nèi)存在表達(dá)。MSCs移植術(shù)后第1 d，A組與B組均有GDNF mRNA的表達(dá)，A組平均IDV比值為0.85，B組為0.43，A組表達(dá)量較B組平均增加了32(P0.05)。移植術(shù)后第3 d，A組與B組GDNF mRNA表達(dá)量均有升高，A組表達(dá)量較B組平均增加25.3(P0.05)。移

17、植術(shù)后第7 d，B組表達(dá)量略有下降，而A組仍在上升。圖2  GDNF mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化（略）2.3  GDNF免疫組化反應(yīng)(圖3)  GDNF在正常成年大鼠脊髓(C組)表達(dá)弱，陽性顆粒定位于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿。MSCs移植術(shù)后第7 d，A組與B組GDNF表達(dá)均有所增強(qiáng)，A組平均表達(dá)量要高于B組(P0.05)。第14 d，A組表達(dá)至高峰，B組表達(dá)也有所增強(qiáng)，A組與B組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第28 d，DMEM組表達(dá)略增強(qiáng)，MSCs仍然持續(xù)高表達(dá)，組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。   圖3  GDNF的形態(tài)學(xué)表達(dá)（

18、10×40）（略）3  討論  中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理活動(dòng)的正常進(jìn)行是與周圍微環(huán)境的穩(wěn)定密不可分的。在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為血液和腦脊液中的物質(zhì)在進(jìn)入腦組織時(shí)要受到一定的限制，即為腦屏障。腦屏障由血腦屏障(bloodbrain barrier，BBB)、血腦脊液屏障(bloodCSFbarrier)以及腦脊液腦屏障(CSFbrain barrier)組成，其中BBB發(fā)揮主要的生理功能。Akiyama等5將同樣數(shù)量的MSCs、雪旺氏細(xì)胞、嗅球鞘細(xì)胞分別經(jīng)尾靜脈注入髓鞘損傷的大鼠，發(fā)現(xiàn)只有MSCs可通過血腦屏障。Lu等6分別通過靜脈和動(dòng)脈將MSCs注入腦創(chuàng)傷的大鼠動(dòng)物模型，

19、發(fā)現(xiàn)MSCs可遷移至腦內(nèi)，尤其是創(chuàng)傷部位，從而提示MSCs對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷有一定的趨化性。靜脈注射MSCs通過BBB的機(jī)制可能包括：(1)脊髓損傷各種炎性因子和血管活性物質(zhì)釋放7，使BBB的通透性增加；(2)BBB固有薄弱環(huán)節(jié)(如腦室周圍、脈絡(luò)叢等)參與MSCs的遷移；(3)脊髓損傷部位具有一定的趨化作用。在本研究中于移植術(shù)后2周內(nèi)Brdu陽性細(xì)胞在損傷區(qū)域不斷增多也提示損傷部位具有一定的趨化作用。  Harvey等8研究認(rèn)為MSCs移植可支持SCI后血管神經(jīng)再生和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建。在骨折或者心肌梗塞的損傷修復(fù)過程中，骨髓中的MSCs會(huì)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，最后到達(dá)損傷部位修補(bǔ)損傷

20、。具體機(jī)制是在發(fā)生上述損傷時(shí)受到炎癥因子和趨化因子刺激，MSCs表面的黏附分子表達(dá)降低，MSCs進(jìn)入血液循環(huán)，到達(dá)損傷部位后，同時(shí)損傷區(qū)域黏附分子表達(dá)升高，MSCs在遷移后到損傷區(qū)后局部增殖分化，修補(bǔ)缺損9。雖然本研究中MSCs的分化轉(zhuǎn)歸未能跟蹤檢測，但可以推測對(duì)脊髓損傷的重建是有著積極作用的。GDNF基因是TGF家族中的一個(gè)亞族，作為靶源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，GDNF通過逆行轉(zhuǎn)運(yùn)或旁分泌作用對(duì)特異神經(jīng)元起到營養(yǎng)作用。在神經(jīng)細(xì)胞分化過程中，GDNF通過RasMARK通路刺激神經(jīng)元的存活和突起的生長，通過P13K信息系統(tǒng)誘發(fā)神經(jīng)元片狀偽足的形成，后者直接參與神經(jīng)軸突的發(fā)生和多巴胺能神經(jīng)元的分化。SCI

21、后殘留神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞均可分泌GDNF，后者通過靶源性、自分泌和旁分泌方式與相應(yīng)的受體GDNFR及Ret結(jié)合，激發(fā)多種信號(hào)通路促進(jìn)中樞神經(jīng)的分化生長與存活。  目前MSCs移植治療多通過局部直接注射移植，移植的MSCs數(shù)目不確定且存活率低。本研究證實(shí)MSCs可通過BBB，并可明顯增加GDNF基因的表達(dá)，因此經(jīng)靜脈移植MSCs是探索SCI治療的途徑之一?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Schwab MERepairing the injured spinal cordScience，2002，8：1029-10312 Carcia R，Aguiar J，Alberti E，et alBone marrow stromal cells produce nerve growth factors and glial cell line derived neurotrophic factorJBiochemical Biophysical Research Communications,2004，316(3)：753-7543 李