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1、轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗的免疫機(jī)制研究進(jìn)展李林習(xí)佳飛摘要植物作為新型的生物反應(yīng)器正日益受到關(guān)注,轉(zhuǎn)基因植物以其獨(dú)有的可食(飼性成為疫苗研究的熱點(diǎn)之一。目前轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗的可行性已逐步得到證實(shí),但相關(guān)的免疫機(jī)制尚在進(jìn)一步的探索之中。實(shí)驗(yàn)證實(shí)植物細(xì)胞壁類似天然的“生物膠囊”,可在一定程度上保護(hù)表達(dá)在植物細(xì)胞內(nèi)的疫苗抗原蛋白抵御消化道酶的作用。使疫苗抗原特異地定位表達(dá)于植物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體等細(xì)胞器中,以及將抗原蛋白組裝成病毒樣顆粒,也均可增強(qiáng)其抗消化能力。適當(dāng)選用免疫佐劑等可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物疫苗免疫保護(hù)反應(yīng),選擇合適的啟動(dòng)子等可提高目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量,這些均是增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗免疫保

2、護(hù)反應(yīng)、避免免疫耐受的可行策略。關(guān)鍵詞轉(zhuǎn)基因植物;口服疫苗;免疫機(jī)制;生物膠囊;免疫佐劑文章編號1001-103X (200406-0354-04中圖分類號R392.13文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(39979924;廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(001052作者單位:510515廣州,南方醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)本科審校者:南方醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室周曉紅陳曉光轉(zhuǎn)基因植物疫苗是當(dāng)今疫苗研制的熱點(diǎn)之一。與常規(guī)的注射疫苗相比,其生物量大、靠光合作用方式生存、可在大范圍內(nèi)種植與栽培、成本低廉、運(yùn)輸與保存容易,而且用可直接食用的果蔬如番茄、香蕉等作為新型疫苗分子表達(dá)系統(tǒng),可口服接種,免除了打針帶

3、來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和疼痛,這些較其他生物有著不可比擬的優(yōu)勢。近年來,轉(zhuǎn)基因植物通過口服途徑誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力已經(jīng)逐步得到證實(shí),其不僅能表達(dá)外源疫苗蛋白,還可激發(fā)機(jī)體有效的粘膜免疫和系統(tǒng)免疫保護(hù)1,2。但轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗的研制目前尚處于起步階段,口服后植物疫苗是否能抵御消化道酶的消化?產(chǎn)生粘膜免疫保護(hù)機(jī)制?當(dāng)疫苗蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)量低,有可能產(chǎn)生口服免疫耐受時(shí),采取何種策略能增強(qiáng)其免疫保護(hù)反應(yīng)的產(chǎn)生而避免免疫耐受?這些問題的解決是轉(zhuǎn)基因口服疫苗研究走向應(yīng)用的前提,本文就近年來轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗相關(guān)免疫機(jī)制的研究進(jìn)展綜述如下。1轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗誘導(dǎo)粘膜免疫及其機(jī)制1.1轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗可行性的

4、實(shí)驗(yàn)依據(jù)1990年,Curtiss 2等證實(shí)了轉(zhuǎn)基因植物所表達(dá)的抗原具有免疫活性。1992年,Arntzen 3等利用轉(zhuǎn)基因煙草生產(chǎn)乙型肝炎疫苗的研究證明,在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的蛋白不僅可保持蛋白的天然構(gòu)像,還保留了激發(fā)B 細(xì)胞和T 細(xì)胞免疫反應(yīng)的抗原決定簇。K apusta 4等利用表達(dá)rH BsAg 的轉(zhuǎn)基因生菜對志愿者進(jìn)行了口服疫苗的初步測試。5人為志愿者,3人為實(shí)驗(yàn)組,第一次給予轉(zhuǎn)基因生菜(rH BsAg 0.10.5(g 100g 生菜200g ,在兩個(gè)月內(nèi)給予第二次免疫,給予生菜150g 。在給予第一次抗原后第2和4周,檢查志愿者的血清,沒有發(fā)現(xiàn)H BsAg 的特異性抗體。在給予第二

5、次抗原后兩周,1人血清的特異性抗體水平為3I U L ,另兩人血清的特異性抗體水平高于10I U L (目前規(guī)定肝炎疫苗的特異性保護(hù)抗體的水平須高于10mI U ml 。在給予第二次抗原4周后志愿者的抗體水平下降到了1.7I U L ,但到12周為止抗體水平?jīng)]有繼續(xù)下降。說明了轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗能有效地誘導(dǎo)人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗原特異性的免疫反應(yīng)。1.2植物細(xì)胞壁的“生物膠囊”(bioencapsulation 作用K ing 5對服用純化的rH BsAg (酵母中表達(dá)和未加工的H BsAg 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯所激發(fā)小鼠的免疫反應(yīng)性進(jìn)行了比較。用表達(dá)H BsAg 的馬鈴薯(含有8.35gH BsAg g

6、 馬鈴薯免疫小鼠,每只小鼠每次給予馬鈴薯5g +10g 霍亂毒素(Cholera T oxin ,CT ,每周1次,連續(xù)3周。對照組用明礬吸附的酵母表達(dá)的抗原免疫小鼠,每只小鼠每次給予150grH BsAg +10gCT ,每周給予1次,連續(xù)兩周。在服用兩次酵母表達(dá)的rH BsAg (總劑量為300g 后,直至第六周都未能檢測到針對rH BsAg 的特異性抗體(即沒有發(fā)現(xiàn)初始免疫反應(yīng)。而在服用了兩次表達(dá)H BsAg 的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯(總共含有rH BsAg 85g 后,就產(chǎn)生了初始免疫反應(yīng),在給予3次抗原之后,抗體水平達(dá)到了103mI Uml,并且到11周時(shí),抗體的水平仍然高于10mI Uml。

7、當(dāng)小鼠的初次免疫反應(yīng)的抗體量降到了基線水平后,都經(jīng)非腸道途徑給予0.5g明礬吸附的酵母表達(dá)的抗原。經(jīng)酵母表達(dá)的抗原+CT免疫的小鼠在第七周產(chǎn)生了175mI Uml水平的再次免疫應(yīng)答抗體。經(jīng)表達(dá)H BsAg的轉(zhuǎn)基因植物+CT免疫的小鼠迅速產(chǎn)生了更強(qiáng)烈的再次免疫應(yīng)答,特異性抗體水平高達(dá)3300mI Uml,并且到第五個(gè)月后抗體仍然保持較高的水平(700mI Uml。由此可見,口服轉(zhuǎn)基因馬鈴薯可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng),且口服轉(zhuǎn)基因植物疫苗較純化抗原具有更好的誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)的能力。原因可能是植物細(xì)胞壁具有類似天然的“生物膠囊”(bioencapsulation作用,即植物細(xì)胞的細(xì)胞壁在一定程度上可

8、有效地保護(hù)植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的rH BsAg,rH BsAg在未到達(dá)腸道的免疫反應(yīng)激活位點(diǎn)(如Peyers淋巴結(jié)等之前被蛋白酶降解,從而相應(yīng)地增加了腸道免疫系統(tǒng)攝取抗原的量和幾率。另外,也可能是由于植物細(xì)胞在腸道內(nèi)分解的次級代謝產(chǎn)物能減少H BsAg在腸道內(nèi)的分解。2增強(qiáng)免疫保護(hù)、避免免疫耐受的策略分析2.1組裝成類病毒顆?？商岣呖乖瓜饔每扇苄钥乖ぐl(fā)免疫反應(yīng)的能力較弱,且易在胃腸道中被消化。病毒在通過消化道途徑感染過程中,能抵抗胃酸和消化酶的消化作用,且病毒的顆粒性狀具有很強(qiáng)的免疫原性。若將抗原組裝成病毒樣顆粒,既能增強(qiáng)抗原蛋白抵抗胃腸道消化作用的能力,提高粘膜免疫系統(tǒng)攝取抗原蛋白的量,又

9、能增強(qiáng)抗原的免疫原性,從而增強(qiáng)免疫反應(yīng)。Mas on6等將諾瓦克病毒的衣殼蛋白(Norwalk virus capsid protein,NVCP基因轉(zhuǎn)入煙草和馬鈴薯中,并用表達(dá)NVCP的煙草葉和馬鈴薯塊莖喂飼小鼠產(chǎn)生了針對NVCP特異性抗體。T acket7用表達(dá)組裝成病毒樣顆粒的NVCP的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯對24名志愿者進(jìn)行了口服免疫測試,在服用3次劑量(每次給予150g生的馬鈴薯,共含有2152751gNVCP的20名志愿者中,19人(95%產(chǎn)生了特異性IgA抗體分泌。其中4人(20%產(chǎn)生了特異性IgG抗體,6人(30%的糞便中發(fā)現(xiàn)特異性IgA抗體。由此可以看出將抗原組裝成病毒樣顆粒是轉(zhuǎn)基因植

10、物口服疫苗抗原提高抗消化能力、增強(qiáng)免疫反應(yīng)性的一種可行手段。2.2抗原在植物細(xì)胞器內(nèi)的定位表達(dá)通過修飾外源基因,可以使蛋白特異性地表達(dá)于葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器內(nèi),可以增強(qiáng)蛋白的表達(dá),這些細(xì)胞器的質(zhì)膜又可以保護(hù)所表達(dá)的抗原,從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物作為疫苗的效能。S ojikul8等模擬人體感染乙肝病毒后乙肝表面抗原在細(xì)胞內(nèi)的合成過程,通過對外源基因(H BsAg基因進(jìn)行修飾,在其氨基末端加上不能被剪切的大豆的信號蛋白vspA (s oybean vegetative storage protein vspA VSPS基因。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明,此修飾能增強(qiáng)VSPS2H BsAg融合蛋白的表達(dá)。VSPS能增強(qiáng)分

11、子間二硫鍵的形成,從而增強(qiáng)H BsAg形成低聚體的能力,增強(qiáng)H BsAg的免疫原性。且VSPS2H BsAg融合蛋白更穩(wěn)定,具有比未修飾的H BsAg更高的“a”抗原決定基(所有H BV共同的一種抗原決定基產(chǎn)生率。用植物表達(dá)的VSPS2H BsAg 融合蛋白免疫動(dòng)物,能產(chǎn)生比植物表達(dá)的未修飾的H BsAg更高的抗體反應(yīng)水平。Liz9等通過在H BsAg的N端加入可被剪切的植物信號肽,使H BsAg能更好地表達(dá)在植物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,并增加H BsAg的表達(dá)量,促進(jìn)H BsAg組裝成病毒樣顆粒形態(tài)。其中pH B106含有大豆VSP“S”信號肽(the s oybean VSP“S”signal p

12、eptide,pH B107含有VSP“L”信號肽(the VSP“L”signal peptide大豆VSP“S”信號肽再加上一段內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列。在不同的植株中,H B107表達(dá)產(chǎn)生的H BsAg的抗原量最多,為2.4mg。給予小鼠連續(xù)3周每周1次每次5g生的表達(dá)H BsAg的馬鈴薯(含有H BsAg1.1gg,并加10gCT作為免疫佐劑。在最后1次免疫后3周小鼠血清中H BsAg特異性抗體水平達(dá)峰值,為73mI Um L。此后3周抗體水平逐漸下降。再次腹腔給予0.5gH BsAg抗原后,迅速產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抗體免疫反應(yīng)。由此可看出,將抗原特異性地表達(dá)于植物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器內(nèi),不僅能增加抗原

13、在植物中的表達(dá)量,還能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物誘導(dǎo)出的免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。2.3免疫佐劑的適當(dāng)應(yīng)用添加免疫佐劑是提高免疫反應(yīng)強(qiáng)度的有效方法,在非植物疫苗中已經(jīng)被多次證實(shí)。對于植物疫苗,在抗原基因轉(zhuǎn)入的同時(shí)加入免疫佐劑的基因,使轉(zhuǎn)基因植物在表達(dá)抗原蛋白的同時(shí)也表達(dá)免疫佐劑,應(yīng)是提高轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗免疫反應(yīng)性的可行策略之一。目前常用的免疫佐劑有霍亂弧菌的霍亂毒素(Cholera T oxin,CT和埃希氏菌屬大腸桿菌的不耐熱腸毒素(Escherichia coli labile enterotoxin,LT。據(jù)報(bào)道10-12,CT的主要靶細(xì)胞是腸道的上皮細(xì)胞。CT在腸道被表皮細(xì)胞攝取之后,通過刺激相關(guān)的細(xì)胞分

14、泌細(xì)胞因子而增強(qiáng)免疫反應(yīng)。CT能顯著刺激Th2相關(guān)的細(xì)胞因子I L24、I L25、I L26、I L210(尤其是I L24的分泌。LT作為免疫佐劑的機(jī)制與CT相類似。據(jù)目前的研究1,LT主要通過增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、樹枝狀細(xì)胞表達(dá)B721(C D80、B722(C D86,從而增強(qiáng)協(xié)同刺激信號,增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)。但是天然的CT(n2CT及天然的LT(n2LT都有很強(qiáng)的腸毒性,目前主要有兩種方式可降低其毒性。一種方式是用這兩種毒素的B亞基代替。n2CT和n2 LT都由兩種亞基組成,分別為A亞基和B亞基。其中A亞基為毒性決定亞基,B亞基為無毒性決定亞基。有實(shí)驗(yàn)證明CT2B和LT2B都

15、可作為免疫佐劑13,14。但是也有一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CT2B雖能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對CT2B本身的抗體,但在促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生針對旁觀抗原的特異性抗體方面則作用較弱5,15。另一種方式是利用定點(diǎn)突變技術(shù),置換CT2A或LT2A 腸毒性的決定基中的單個(gè)蛋白,使其產(chǎn)生無毒性或低毒性突變體,同時(shí)保留n2CT或n2LT的免疫佐劑活性。Douce16、Y amam oto15等在CT2A亞單位置換單個(gè)氨基酸,產(chǎn)生CT的低毒性或無毒性的突變體。他們成功地生產(chǎn)出的突變體有:CTS106,將CT2A的第106位點(diǎn)的脯氨酸突變?yōu)樯彼?CT2A106PW,CTS106的腸毒性是n2CT的1104;CTK63(CT2 A6

16、3WK,CTK63完全無腸毒性;S61F(CT2A61S F;E112K(CT2A112EK。通過實(shí)驗(yàn)證明,這些突變體與n2CT相似,能有效地刺激粘膜免疫相關(guān)因子的表達(dá),增強(qiáng)免疫反應(yīng)。目前通過定點(diǎn)突變技術(shù)已經(jīng)生產(chǎn)的LT的幾種無毒的或低毒性的突變體有:LTK63(LT2A63SK,LTK63完全無腸毒性; LTR72(LT2A72AR,LTR72有n2LT0.6%的腸毒性;LTK7(LT2A7RK,LTK7無腸毒性等。在非植物疫苗添加免疫佐劑的研究中還發(fā)現(xiàn),將n2CT或CT2B與抗原用化學(xué)方法偶聯(lián)在一起免疫動(dòng)物,可以較單純地將n2CT或CT2B與抗原混合在一起免疫動(dòng)物誘導(dǎo)出更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。這可能

17、與n2CT或CT2B 的靶向作用相關(guān)。即CT或CT2B將抗原與抗原遞呈細(xì)胞(如腸系膜的M細(xì)胞,表皮細(xì)胞等相連在一起,使抗原遞呈細(xì)胞能更好地?cái)z取抗原并激活免疫系統(tǒng)17,18。提示,若能將抗原基因與佐劑基因連接后轉(zhuǎn)入植物載體中,使植物表達(dá)抗原和佐劑的融合蛋白,則能大大地增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物所誘導(dǎo)出的免疫反應(yīng)。在Y u19的實(shí)驗(yàn)中,在CT2B亞基C端,連接了輪狀病毒腸毒素蛋白的免疫優(yōu)勢抗原決定基NSP4(輪狀病毒的非結(jié)構(gòu)糖蛋白,將融合蛋白的基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯中表達(dá),得到了表達(dá)融合抗原的馬鈴薯免疫小鼠。用與免疫小鼠的轉(zhuǎn)基因植物中含有相同抗原量的NSP4加入或不加CT2B(10m作為對照。抗體滴度測定顯示,表達(dá)融

18、合蛋白的轉(zhuǎn)基因植物所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)最強(qiáng)。由此可知將免疫佐劑與抗原基因連接共同表達(dá)于植物中,能有效增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物疫苗所誘導(dǎo)出的免疫反應(yīng)。在此次實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),用表達(dá)CT B2NSP4的馬鈴薯免疫小鼠能同時(shí)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對CT2B和NSP47的抗體反應(yīng)?？梢酝茰y,在保證各種抗原的表達(dá)量的前提下,可在一植株中同時(shí)轉(zhuǎn)入幾種不同的抗原基因,可在服用一種植物疫苗后同時(shí)產(chǎn)生針對幾種病原體的免疫防御作用。2.4提高疫苗分子在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量口服抗原既有誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力,又能誘導(dǎo)口服耐受?？诜褪苁侵缚诜撤N抗原后引起再次遇到相同的抗原時(shí)機(jī)體的無應(yīng)答現(xiàn)象。這方面的機(jī)制還不清楚,主要與克隆清除、失能和主動(dòng)性細(xì)

19、胞抑制相關(guān)。接種抗原的劑量是決定引起免疫反應(yīng)或免疫耐受的主要原因。低劑量抗原易引起主動(dòng)抑制;高劑量抗原易引起克隆清除和失能20。由于轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的抗原蛋白量通常較低,所以有可能引起低劑量耐受。度上提高外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量。綜上所述,轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗能有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生粘膜免疫和系統(tǒng)免疫反應(yīng),具有良好的可行性。全球每年約有二百萬兒童死于因無法接種疫苗,在貧困落后地區(qū)更為嚴(yán)重。WH O相應(yīng)提出研制價(jià)廉且可口服的疫苗新策略,轉(zhuǎn)基因植物以其獨(dú)具的可食性無疑最具開發(fā)潛能。隨著轉(zhuǎn)基因植物免疫保護(hù)機(jī)制的進(jìn)一步闡明,轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗必將對許多疾病的防治尤其是在大范圍、貧窮落后的國家和地區(qū),起

20、到舉足輕重的推動(dòng)作用。參考文獻(xiàn)1S treattield S J,H oward JA.Plant2based vaccinesJ.International Journal for Parasitology,2003,33:4792493.2W almsley AM,Alvarez M L,Jin Y,et al.Expression of the B subunit of Es2 cherichia coli heat2labile enterotoxin as a fusion protein in transgenic toma2 toJ.Plant Cell Reports.2003

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