液體芯片-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)在腫瘤早期診斷中的研究進(jìn)展

1、液體芯片-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)在腫瘤早期診斷中的研究進(jìn)展    液體芯片-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)利用磁珠俘獲腫瘤患者與健康對照體液中低豐度特異蛋白或多肽，經(jīng)飛行時間質(zhì)譜測定和軟件分析，建立由兩者差異表達(dá)蛋白或多肽組成的質(zhì)譜圖模型，用于預(yù)測未知樣品的歸屬。     萬里川1王雅杰2 審稿：馬慶偉1 康熙雄2 1、博揚(yáng)通北京科技有限公司? 2、北京天壇醫(yī)院檢驗(yàn)科 中文摘要： 液體芯片-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)利用磁珠俘獲腫瘤患者與健康對照體液中低豐度特異蛋白或多肽，經(jīng)飛行時間質(zhì)譜測定和軟件分析，建立由兩者差異表達(dá)蛋白或多肽組成的質(zhì)譜圖模

2、型，用于預(yù)測未知樣品的歸屬。 它的優(yōu)點(diǎn)在于：1、俘獲的低豐度蛋白或多肽種類多，保證了系統(tǒng)的特異性。在僅一滴血清（10-50L）中，在分子量范圍為0.8-15kDa內(nèi)，可檢測出400多個不同的峰； 2、磁珠種類多，有多達(dá)十幾種磁珠，適用于不同的疾病和蛋白； 3、操作簡單快捷； 4、納米磁珠巨大的表面積使蛋白的俘獲具有良好的重復(fù)性； 5、樣品處理通量高，每天可處理多達(dá)3萬個樣品； 6、消耗品價格低，只有同類產(chǎn)品價格的一半左右； 7、質(zhì)譜系統(tǒng)擁有多項(xiàng)專利技術(shù)，TOF可檢測出含量低至1fmol的蛋白，并可對高豐度的蛋白或多肽進(jìn)行直接鑒定。 在哈佛大學(xué)女子醫(yī)院、紐約斯隆-凱特琳癌癥研究所、麻省總醫(yī)院、貝

3、勒醫(yī)學(xué)院等世界一流醫(yī)院和醫(yī)學(xué)研究所中，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、頭頸鱗癌、膀胱癌等的早期診斷研究中。其中在德國，該技術(shù)已應(yīng)用于臨床急性淋巴白血病的輔助診斷。綜上所述，液體芯片飛行時間質(zhì)譜技術(shù)具有良好的特異性和靈敏度、高通量、操作簡單快捷和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，是極具潛力的臨床腫瘤早期診斷工具。 LiquidChipTime-Of-FlightSpectrometry-APromisingPlatformForTumorEarlyDiagnosis Wan Lichuan1 Wang Yajie2 Ma Qinwei1, Kang Xixiong2 1. *Beijing

4、Bioyong Technologies Inc., Beijing, 10080, China 2. Laboratory Medicine, Beijing Tiantan Hospital Abstract： The liquid chip time-of-flight spectrometry technology uses magnetic beadsto capture low abundance and specific proteins or polypeptides from body fluids ofboth tumor patients and health contr

5、ols. After MALDI-TOF measurements andbioinformatics software analysis, discriminatory proteins or polypeptides wereemployed to discover a biomarker pattern. Then unknown samples can be matchedagainst this pattern. T he platform has the following advantages. a) Proteins/peptides atlow level can be ca

6、ptured by the magnetic beads. Over 400 different kinds of proteinscan be detected in a single droplet of serum (10-50l) within a molecular massarrange of 0.8-15kD. b) More than ten kinds of magnetic beads are commerciallyavailable for studying different diseases and various proteins. c) The process

7、forsample fractionation and measurement is easy and fast. d) Good reproducibility wasguaranteed by the large surface of the magnetic beads. e) The platform is also suitablefor high throughput sample analysis. More than 30,000 samples can be analyzed injust one day. f) The cost of the magnetic beads

8、is low, only about half price of thesolid chips in the similar technologies. g) The high quality of the mass spectrometrysystem with various patent technologies is able to detect proteins at 1fmol level. Highabundant peptides can be identified directly by TOF/TOF. The platform has been usedby the wo

9、rlds first class hospitals and medical institutes, such as Womens Hospitalof Harvard University, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, General Hospital ofMassachusetts, Baylor College of Medicine, where it was applied for the earlydiagnosis research of ovary cancer, prostate cancer, breast cancer,

10、 glioblastoma, headand neck squamous cell cancer, bladder cancer. In German, the platform was appliedfor auxiliary diagnosis of acute lymphatic leukemia. In summary, the liquid chiptime-of-flight spectrometry technology is a very promising tool for tumor earlydiagnosis because of the high specificit

11、y and sensitivity, high throughput, easy andsimple manipulation and high reproducibility. Key Words：MALDI-TOF, Liquid Chip, Early Diagnosis, Cancer, Magnetic Bead 1前言 世界衛(wèi)生組織最新資料庫顯示：2005年，全球大約有760萬人死于各種癌癥，約1千1百萬人被診斷患有癌癥；中國死于惡性腫瘤的人數(shù)約為160萬人，約2百萬人被診斷患有癌癥。中國每年因癌癥造成的損失高達(dá)數(shù)百億，給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，早期腫瘤

12、治愈率可達(dá)83%。美國從1960到1990的30年間，腫瘤患者的五年存活率由50上升為63，主要?dú)w功于早期診斷技術(shù)的發(fā)展，而中晚期的患者的五年存活率，幾乎沒有提高。臨床上，早期診斷率每增加1，全球就有約76萬人免于死亡，中國約有16萬人可獲得新生，可挽回數(shù)以10億計的損失。因此，大力推進(jìn)早期診斷技術(shù)的發(fā)展，具有非常緊迫的經(jīng)濟(jì)和社會意義。生理醫(yī)學(xué)諾貝爾獎獲得者Lee Hartwell博士在2004年第21屆國際腫瘤標(biāo)志學(xué)術(shù)會議上，就如何治療癌癥指出：早期診斷可以治療癌癥，早期診斷癌癥的最新、最有效的方法是驗(yàn)血診斷，尋找腫瘤標(biāo)志，特別是其中的蛋白標(biāo)志！ 腫瘤標(biāo)志物是指腫瘤細(xì)胞在發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移或復(fù)

13、發(fā)過程中，所產(chǎn)生或分泌到血液、尿液、腦脊髓液等中，反映腫瘤存活和生長狀態(tài)的一類物質(zhì)。它能用化學(xué)、免疫、分子生物學(xué)或蛋白組學(xué)的方法進(jìn)行定性、定量地檢測。腫瘤標(biāo)志物一般與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、治療后的消退、復(fù)發(fā)等具有良好的相關(guān)性。因此通常通過測定血清中腫瘤標(biāo)志物的水平，可以進(jìn)行腫瘤的早期診斷、個體化治療、手術(shù)、放療或藥物療效的觀察、評判預(yù)后及預(yù)報復(fù)發(fā)等。 目前臨床常用的腫瘤標(biāo)志物有20多種，如PSA、CEA或CA125等，但大部分只能用于療效的觀察、評判預(yù)后及預(yù)報復(fù)發(fā)，能用于大規(guī)模人群的普查的腫瘤標(biāo)志物寥寥無幾。臨床上迫切需要新的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于腫瘤的早期診斷。 現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)和發(fā)展，如雙

14、向電泳技術(shù)、蛋白芯片，電噴霧質(zhì)譜和飛行時間質(zhì)譜、四級桿飛行時間質(zhì)譜、傅立葉變換質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，給臨床腫瘤早期標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)帶來了劃時代的革命，它將傳統(tǒng)的通常一次只能測定一個蛋白標(biāo)志物革命性地發(fā)展到一次可測定數(shù)十個，甚至數(shù)百個蛋白，同時極大的提高了診斷的靈敏度和特異性1。 固體芯片飛行時間質(zhì)譜技術(shù)是質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于臨床腫瘤早期診斷的先驅(qū)2、3、4、5。它是第一個在臨床上使用蛋白芯片技術(shù)，分離純化蛋白，并應(yīng)用飛行時間質(zhì)譜和軟件分析來尋找新腫瘤早期標(biāo)志物。與雙向電泳和液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)相比，其優(yōu)勢是簡便易行、樣本用量少并可同時進(jìn)行高通量分析, 可直接對粗樣本(血清、組織、細(xì)胞裂解液、尿液等)進(jìn)行檢測。隨著

15、該技術(shù)在臨床研究中的更多應(yīng)用，研究人員發(fā)現(xiàn)，它需要進(jìn)一步的完善6、7、8。 如，1、重復(fù)性亟待提高。不同的研究人員研究同一種癌癥得到的差異峰應(yīng)大部分相同；診斷模型的特異性在不同的時間要有較好的一致性。 2、靈敏度需要進(jìn)一步提高。腫瘤早期標(biāo)志物的一個最顯著的標(biāo)志是其在血清中濃度非常低。如在正常男性血清中，PSA的濃度在1g/L以下，而該技術(shù)檢測的下限是1000g/L。 3、能對尋找到的差異蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定和分析。 4、每次分離的蛋白數(shù)量和質(zhì)量范圍需要進(jìn)一步擴(kuò)大。該技術(shù)每次分離的蛋白數(shù)小于100個，差異蛋白的質(zhì)量范圍通常在5KD-20KD之間。 5、降低芯片的成本和取消軟件每年更新的費(fèi)用。 6

16、、提高真空系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性。 2. 液體芯片-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)CLINPROT系統(tǒng)的組成、原理、分析過程和特點(diǎn) 為了滿足臨床對腫瘤標(biāo)志物的迫切需求，德國Bruker Daltonics公司于2004年成功的開發(fā)了一套CLINPROT系統(tǒng)。該系統(tǒng)可分為四個部分，磁珠分離系統(tǒng)、質(zhì)譜系統(tǒng)、分析軟件和可選的體液樣品自動處理系統(tǒng)?；具^程是，患者或健康對照的臨床樣品，如血清、血漿、尿液、腦脊髓液等，首先通過磁珠分離，去除樣品中的高豐度蛋白和其他雜質(zhì)，如鹽等，同時富集了低豐度目的蛋白。分離后得到的樣品中加入基質(zhì)，混合后，直接點(diǎn)在AnchorChip靶上，進(jìn)行飛行時間質(zhì)譜分析，得到所有蛋白的質(zhì)譜圖，通

17、過軟件比較患者或健康對照的差異表達(dá)蛋白，得到兩者的特異質(zhì)譜譜圖，用于預(yù)測未知樣品的歸屬-患者或無疾病。 Bruker Daltonics公司的磁珠純化系統(tǒng)，具有以下幾個特點(diǎn)： 一、磁珠顆粒小，僅數(shù)個納米；磁珠的總表面積大；表面的特異基團(tuán)可與血清中特異低豐度蛋白充分接觸，捕獲蛋白種類多，從而保證了系統(tǒng)有很好的特異性。在僅一滴血清（10-50L）中，在分子量范圍為0.8-15kDa內(nèi)，可檢測出400多個不同的峰，更多體積的血清樣品中可檢測出血液中2000種不同的多肽或蛋白9。 二、磁珠種類多。根據(jù)分離原理可分為：離子交換，如MB-WCX，MB-WAX等；金屬鰲合，如MB-IMAC-Fe，MB-IM

18、AC-Cu等；疏水作用，如MB-HICC1，MB-HICC3，MB-HICC8，MB-HIC C18等；以及專門用于標(biāo)記糖蛋白的磁珠和標(biāo)記抗體的G蛋白磁珠等，可適用于不同的疾病和蛋白。 三、操作簡單快捷。只需要幾次簡單的混勻、沖洗和洗脫過程即可完成前處理，更適于臨床檢驗(yàn)。 四、磁珠系統(tǒng)由于磁珠表面積大，而具有很高重復(fù)性10、11。 五、液體自動處理系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)高通量，每天可處理多達(dá)3萬個樣品； 六、消耗品價格低，只有同類產(chǎn)品價格的一半左右； 七、在質(zhì)譜系統(tǒng)中，樣品靶擁有最新AnchorChip專利技術(shù)，因其表面具有疏水作用基團(tuán)，在中央具有親水基團(tuán)，在溶劑蒸發(fā)時，樣品液滴可收縮錨定至600 m，可

19、大大增加分析物的濃度，相對常規(guī)芯片，提高10-100倍的靈敏度。CLINPROT系統(tǒng)中的質(zhì)譜的的可測蛋白質(zhì)量范圍是0.01-600kDa，一級TOF可測出含量低至1fmol的蛋白，理論上可測出血清中0.3g/L 的PSA，是正常人血清中PSA含量的1/3。TOF/TOF靈敏度為1amol，并可對高豐度的蛋白或多肽進(jìn)行直接鑒定。軟件系統(tǒng)能同時比較8種不同疾病組之間的質(zhì)譜差異表達(dá)譜圖，差異可通過多種的形式表現(xiàn)，如膠圖、堆疊圖等12。 3. CLINPROT系統(tǒng)在臨床腫瘤早期診斷中的應(yīng)用 3.1 卵巢癌 美國Bruker Daltonics公司的Sergei Dikler和美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Sam

20、uel C. Mok等利用CLINPROT系統(tǒng)研究了早期卵巢癌中的標(biāo)志物M13。利用WCX磁珠純化，和TOF/TOF質(zhì)譜分析，建立了8例期卵巢癌病人和8例健康婦女血清的質(zhì)譜表達(dá)譜圖，對健康人的預(yù)測靈敏度為100%，對卵巢癌患者檢出的正確率為97%。同時鑒定出3個差異顯著的峰，質(zhì)量數(shù)分別為：2080.9，2659.2，2681.2。質(zhì)量數(shù)為2659.2的峰為-纖維蛋白原的片段，質(zhì)量數(shù)為2080.9的峰為激肽原的片段。 3.2 腦膠質(zhì)瘤和成神經(jīng)管細(xì)胞瘤 美國斯隆-凱特琳癌癥研究所的Josep Villanueva等對腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤診斷的前瞻性研究表明，利用CLINPROT系統(tǒng)中MB HIC 8磁珠分

21、離和液體自動處理機(jī)器人操作，經(jīng)質(zhì)譜分析，在34個患者和22個正常人的血清中產(chǎn)生了274個差異的峰，用隨機(jī)的55個樣品建立病人和正常人的質(zhì)譜模型，對正常和病人的診斷的特異性可高達(dá)96.4%9。 德國Bruker Daltonics的Sau-Mei Leung和美國休斯頓貝勒醫(yī)學(xué)院的M.Sheldon等研究了成神經(jīng)管細(xì)胞瘤相關(guān)的標(biāo)志物。利用MB WCX磁珠，建立了8例成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和8例正常人質(zhì)譜表達(dá)譜圖，TOF/TOF鑒定了其中一個差異最顯著質(zhì)量數(shù)為2080的峰，Mascot搜索表明，它與人激肽原前體同源14。 3.3 頭頸鱗癌 美國東弗吉尼亞醫(yī)學(xué)院的Lisa H. Cazares利用CLINP

22、ROT系統(tǒng)研究了頭頸鱗癌的早期標(biāo)志物。磁珠系統(tǒng)為IMAC Cu2+ 。通過比較24例頭頸鱗癌、24例健康吸煙者和27例不吸煙的健康人，在1-10KD的質(zhì)量范圍內(nèi)，頭頸鱗癌患者和不吸煙的健康人之間共發(fā)現(xiàn)195個顯著差異峰。其中表達(dá)升高差異最明顯的峰質(zhì)量數(shù)為1469.09，經(jīng)TOF/TOF鑒定為血纖維蛋白肽A的片段。表達(dá)下降最明顯的是質(zhì)量數(shù)為5066.40的峰。研究還表明，該系統(tǒng)比Ciphengen公司的IMAC Cu2+芯片具有更高的重復(fù)性和在2-5KD之間能發(fā)現(xiàn)更多的差異峰15。 3.4 白血病 德國漢諾威臨床醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)的Elke Schaffeler研究了用于兒童急性淋巴白血病的早期診斷特

23、異峰16。通過疏水作用基團(tuán)的磁珠（HIC-C8）分離后，經(jīng)飛行時間質(zhì)譜儀鑒定，用30個患者和30個健康人的血漿建立了各自的質(zhì)譜譜圖，用17個樣品盲法測試，預(yù)測的特異性為100%。并找到質(zhì)量數(shù)為2437.7，6457.9，7772.2，9420.5的四個差異蛋白峰，可成為四個潛在的急性淋巴白血病的生物標(biāo)志物。目前在德國，該技術(shù)平臺已用于兒童急性淋巴白血病的早期輔助診斷。 3.5 前列腺癌、乳腺癌17、膀胱癌18 美國斯隆-凱特琳癌癥研究所的Paul Tempst等利用CLINPROT系統(tǒng)研究了32例前列腺癌、21例乳腺癌和20例膀胱癌。以33例健康人為對照，發(fā)現(xiàn)了651個差異表達(dá)的峰，其中的有1

24、4個、10個和58個可分別作為前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌的腫瘤標(biāo)志物，同時對這些標(biāo)志物都進(jìn)行了質(zhì)譜的序列分析。對41例前列腺癌患者的血清的盲性測試表明，它的預(yù)測準(zhǔn)確率為100%。進(jìn)一步對其中高離子豐度的47個峰的TOF/TOF或Q-TOF研究表明，這些峰包括了血纖維蛋白肽A、補(bǔ)體C3f和血管舒緩激肽系統(tǒng)的全部的19個蛋白。其中，大部分的差異表達(dá)峰是由于血液在體外凝固過程中，由于腫瘤患者和正常人之間蛋白酶表達(dá)差異，從而產(chǎn)生不同的酶解片段而引起的。 美國科羅拉多大學(xué)的Rodriguez等利用CLINPROT系統(tǒng)研究了前列腺癌相關(guān)的PSA水平高低的標(biāo)志物。磁珠系統(tǒng)為IMAC Cu2+ 。分析了65例P

25、SA水平大于2.5ng/ml和65例PSA水平小于0.5ng/ml的美國黑人之間，血清蛋白質(zhì)譜表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)了10個峰有顯著的差異。 綜上所述，臨床上腫瘤的高發(fā)生率和死亡率迫切需要新的早期診斷用的生物標(biāo)記物。蛋白質(zhì)組技術(shù)的飛速發(fā)展給它的發(fā)現(xiàn)和鑒定帶來了新的機(jī)遇。液體芯片激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)-CLINPROT系統(tǒng)，具有重復(fù)性好，特異性和靈敏度高并可對潛在的生物標(biāo)記物進(jìn)行鑒定的強(qiáng)大的優(yōu)勢。目前，已經(jīng)在卵巢癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤、急性淋巴白血病、乳腺癌和膀胱癌等的早期診斷進(jìn)行了早期的前瞻性研究。相信，隨著CLINPROT系統(tǒng)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，會有更多的腫瘤早期生物標(biāo)志物得到發(fā)現(xiàn)和鑒定，為全世

26、界腫瘤患者帶來福音和希望。 1. Alaoui-jamali Moulay A., Xu Ying-jie. Protomic technology for biomarkerprofiling in cancer: an update. Journal of Zhejiang University Science B 2006 7(6):411-420 2. Petricoin, E. F. Ardekani, A. M. Liotta, L. A. Lancet 2002, 359, 572-577. 3. Li, J. Zhang, Z. Chan, D. W. Clin. Chem.

27、2002, 48, 1296-1304. 4. Adam, B., L. Qu, Y. Davis, Jr. Cancer Res. 2002, 62, 3609-3614. 5. Richter, R., Schulz-Knappe, P., and Forssmann, W. G. J. Chromatogr., B:Biomed. Sci. Appl. 1999, 726, 25-35. 6. Eleftherios P. Diamandis. Analysis of Serum Proteomic Patterns for Early CancerDiagnosis: Drawing

28、Attention to Potential Problems. Journal of the National CancerInstitute, 96(5), 353-356, 2004. 7. Eleftherios P. Diamandis. Mass Spectrometry as a Diagnostic and a CancerBiomarker Discovery Tool opportunities and potential limitations. Molecular &Cellular Proteomics 3.4, 367-378, 2004. 8. Thoma

29、s P Conrads, Ming Zhou, Timothy D Veenstra. Cancer diagnosis usingproteomic patterns. Expert Rev. Mol. Diagn. 3(4), 411420 (2003) 9. Josep Villanueva, John Philip, and Paul Tempst. Serum Peptide Profiling byMagnetic Particle-Assisted, Automated Sample Processing and MALDI-TOF MassSpectrometry. Anal.

30、 Chem. 2004, 76, 1560-1570. 10. Sau-Mei Leung, Samuel C. Mok. Quality management of ovarian cancer serumprofiles using functionalizied magnetic beads, AnchorchipTM technology,MALDI-TOF MS and MALDI-TOF/TOF MS/MS. AACR Annual Meeting, 2004. 11. Sergei Dikler, Sau-Mei Leung and Samuel C. Mok. Proteomi

31、c profiling andidentification of peptides related to ovarian cancer using magnetic bead based samplefractionation method and MALDI TOF-TOF MS ASMS 2004. 12. Ketterlinus R, Hsieh SY, Teng SH, Lee H, Pusch W. Fishing for biomarkers:analyzing mass spectrometry data with the new ClinProTools software.Bi

32、otechniques. 2005 Jun;Suppl:37-40. 13. Sau-Mei Leung, Sergei Dikler, and Samuel C. Mok. A new approach forprofiling ovarian cancer serum using functionalizied magnetic beads, anchor chiptechnology, MALDI-TOF MS, MALDI-TOF/TOF MS, and bioinformatics. SixthInternational Symposium on Mass Spectrometry in the Health and Life Science,August 2003 14. S.-M. Leung, S. Dikler, C. C. Lau. A novel and rapid approach to proteinexpression profiling of cerebrospinal fluid(CSF) from medullblastoma patients usingfunctionalizied magene