總糖和還原糖的測(cè)定

1、總糖和還原糖的測(cè)定（3,5二硝基水楊酸法）實(shí)驗(yàn)報(bào)告前言糖在我們?nèi)粘Ｉ钪须S處可見，我們吃的米飯、水果、零食中或多或少都含有一些糖類。同時(shí)，糖也是我們維持機(jī)體運(yùn)動(dòng)所必不可少的物質(zhì)，沒(méi)有了它，就沒(méi)有了能量的來(lái)源。我們這次便走進(jìn)實(shí)驗(yàn)室探索糖類的奧秘。本次實(shí)驗(yàn)我們將用3,5二硝基水楊酸法測(cè)定總糖和還原糖中的含糖量。本次實(shí)驗(yàn)中，我們除了要掌握還原糖和總糖的測(cè)定基本原理還要學(xué)習(xí)比色法測(cè)定還原糖的操作方法以及分光度法測(cè)定的原理和方法。首先，讓我們一起來(lái)了解一下它們的測(cè)定方法吧。還原糖的測(cè)定是糖定量測(cè)定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是

2、還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來(lái)，對(duì)沒(méi)有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行測(cè)定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計(jì)）。還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計(jì)，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值，查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時(shí)，每斷裂一個(gè)糖苷鍵需加入一分子水，所以在計(jì)算多糖含量時(shí)應(yīng)乘以0.9。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?

3、、掌握還原糖和總糖的測(cè)定的基本原理2、學(xué)習(xí)比色法測(cè)定還原糖的操作方法3、學(xué)習(xí)分光光度法測(cè)定的原理和方法二、實(shí)驗(yàn)原理還原糖的測(cè)定是糖定量測(cè)定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來(lái)，對(duì)沒(méi)有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行測(cè)定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計(jì)）。還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還

4、原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計(jì)，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值，查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時(shí)，每斷裂一個(gè)糖苷鍵需加入一分子水，所以在計(jì)算多糖含量時(shí)應(yīng)乘以0.9。三、材料與器具的準(zhǔn)備。實(shí)驗(yàn)材料：面粉。實(shí)驗(yàn)試劑（1）、1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)確稱取80烘至恒重的分析純葡萄糖100mg，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，混勻，4冰箱中保存?zhèn)溆?。?）、3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑將6.3g DNS和262mL 2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱

5、水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，貯于棕色瓶中備用。（3）、碘-碘化鉀溶液：稱取5g碘和10g碘化鉀，溶于100mL蒸餾水中。（4）、酚酞指示劑：稱取0.1g酚酞，溶于250mL 70%乙醇中。（5）、6M HCl和6M NaOH各100mL。實(shí)驗(yàn)器材（1）具塞玻璃刻度試管：20mL11 （2）大離心管：50mL2（3）燒杯：100mL1 （4）三角瓶：100mL1（5）容量瓶：100mL3 （6）刻度吸管：1mL1；2mL2；10mL1（7）恒溫水浴鍋 （8）沸水浴 （9）分光光度計(jì)分光光度計(jì)的基本原理是溶液中的物質(zhì)在光的照射下，產(chǎn)生了對(duì)光吸

6、收的效應(yīng)，物質(zhì)對(duì)光的吸收是具有選擇性的。各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜，因此當(dāng)某單色光通過(guò)溶液時(shí)，其能量就會(huì)被吸收而減弱，光能量減弱的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系，也即符合比色原理Lambert-Beers law: 數(shù)學(xué)表達(dá)式: A=lg(1/T)=KCL A為吸光度 T為透射率,是投射光強(qiáng)度比上入射光強(qiáng)度 C為吸光物質(zhì)的濃度 L為吸收層厚度 K為吸收系數(shù) 物理意義是當(dāng)一束平行單色光垂直通過(guò)某一均勻非散射的西光物質(zhì)時(shí),其吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度C及吸收層厚度L成正比. 四、實(shí)驗(yàn)步驟。器材與材料準(zhǔn)備完畢之后，便開始按照以下步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。取6支20mL 具塞刻

7、度試管編號(hào)，按下表分別加入濃度為1mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑，配成不同葡萄糖含量的反應(yīng)液。管號(hào)試劑012345標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液ml00.20.40.60.81.0蒸餾水ml2.01.81.61.41.21.0DNS試劑ml1.51.51.51.51.51.5接下來(lái)，提取還原糖。準(zhǔn)確稱取2.00g 食用面粉，放入100mL 燒杯中，先用少量蒸餾水調(diào)成糊狀，然后加入50mL 蒸餾水，攪勻，置于50恒溫水浴中保溫20min，使還原糖浸出。過(guò)濾，將濾液收集在100ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為還原糖待測(cè)液。緊接著，提取總糖。準(zhǔn)確稱取1.00g食用

8、面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸餾水及10mL 6M HCl，置沸水浴中加熱水解30min（水解是否完全可用碘-碘化鉀溶液檢查）。待三角瓶中的水解液冷卻后，加入1 滴酚酞指示劑，用6mol/LNaOH 中和至微紅色，用蒸餾水定容在100mL容量瓶中，混勻。將定容后的水解液過(guò)濾，取濾液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混勻，作為總糖待測(cè)液。然后，取4支20mL 具塞刻度試管，編號(hào)，6、7、8、9，按下表所示分別加入待測(cè)液和顯色劑。管號(hào)還原糖待測(cè)液（ml)總糖待測(cè)液（ml)蒸餾水（ml)DNS（ml）60.51.51570.51.5158111591115最后，用分光光度計(jì)進(jìn)行比

9、色。先將機(jī)器打開預(yù)熱20分鐘。選擇540nm的波長(zhǎng)。再按MODE鍵切換到T，將黑體放入光路中，合上蓋，0鍵校零。再按MODE鍵切換到A，將倒入比色皿中的0號(hào)液體放入到光路中，合上蓋，100鍵校零。再將倒入比色皿中的各號(hào)液體放入到光路中即可測(cè)得光密度值。五、注意事項(xiàng):1、每次測(cè)量前檢查,檢查波長(zhǎng)是否所需值;2、比色皿應(yīng)拿磨砂面,不可用手接觸透光面;3、比色皿在盛裝樣品前,應(yīng)用所盛樣品沖洗兩次,裝樣量為比色皿的2/3容積;4、向比色皿加樣時(shí),若樣品流到比色皿外壁時(shí),應(yīng)用濾紙點(diǎn)干,切忌用濾紙擦拭,以免比色皿出現(xiàn)劃痕;5、測(cè)量結(jié)束后應(yīng)用蒸餾水清洗比色皿,清洗干凈后放起.六、數(shù)據(jù)處理。試管1234567

10、89光密度值（nm）0.0250.1320.1860.2970.3240.0770.0820、710、73y = 0.3557x - 0.0172則還原糖百分含量=毫克數(shù)提取液總體積測(cè)定時(shí)取用體積樣品的質(zhì)量=13.5%總糖的百分含量=毫克數(shù)稀釋倍數(shù)樣品質(zhì)量0.9=18.63%總結(jié)：本實(shí)驗(yàn)測(cè)得還原糖的含量為13.5%，總糖含量為18.63%，R為0.9739，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還是略有偏差。七、誤差分析。1、在配置制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的溶液時(shí)，使用移液管移動(dòng)液體，由于不夠熟練，所以并沒(méi)有準(zhǔn)確移動(dòng)相應(yīng)的液體量，導(dǎo)致R偏低。2在提取還原糖時(shí)，由于我們采用的是最簡(jiǎn)單的棉花過(guò)濾方法，這個(gè)方法可能導(dǎo)致有許多還原糖被浪費(fèi)，導(dǎo)致所測(cè)還原糖含量偏低。此外，我們也需要注意，在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定與樣品含糖量必須同時(shí)進(jìn)行，一起顯色和比色。八、體會(huì)。這次試驗(yàn)我們學(xué)習(xí)了植物總糖、還原糖的提取鑒定及其含量測(cè)定，掌握了還原糖和總糖測(cè)定的基本原理，同時(shí)也對(duì)比色法測(cè)定還原糖有了一定了解并且還掌握了使用分光光度計(jì)測(cè)定還原糖和總糖的光密度值收獲許多，試驗(yàn)中要求每只試管同時(shí)進(jìn)行水浴加熱加熱時(shí)間視實(shí)驗(yàn)原料而定，嚴(yán)格