鯉魚腦乙酰膽堿脂酶的活性測(cè)定

1、 北京科技大學(xué)必修課程實(shí)驗(yàn)研究論文題目:課程:班級(jí):作者:學(xué)號(hào):鯉魚腦乙酰膽堿脂酶的活性測(cè)定生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)黃凱輝41467024化生學(xué)院生技1401鯉魚腦乙酰膽堿酯酶(AChE的活性測(cè)定黃凱輝摘要 建立了以新鮮豬心為材料,經(jīng)過(guò)酸溶液提取,人造沸石吸附,硫酸銨溶液洗脫和三氯乙酸沉淀等步驟快速制備細(xì)胞色素C的方法,進(jìn)而考察了制備蛋白質(zhì)制品的一般原理和操作技術(shù)。測(cè)定細(xì)胞色素C 含量時(shí),其520nm處吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y = 0.7762x + 0.05,R² = 0.9974;將細(xì)胞色素C粗品溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù),加入少許聯(lián)二亞硫酸鈉后,在520nm下測(cè)其吸光度A=0.210。樣品原液濃度C=

2、1.072 mg/mL;每500g心肌碎肉含細(xì)胞色素C=64.0 mg。關(guān)鍵詞 細(xì)胞色素C 分離純化分光光度法1 引言經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝臟系統(tǒng)疾病、重癥肌無(wú)力、有機(jī)磷中毒等的重AChE可溶于水或稀鹽溶液,因而可將生物組織及緩沖溶液置于組織勻漿器或組織搗碎機(jī)中制備組織勻漿,經(jīng)離心后,其上清部分可用于測(cè)定組織中AChE的活性。AChE的活性定方法主要有光學(xué)方法和電化學(xué)方法。本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法測(cè)定AChE活性。其基本原是乙酰膽堿酯酶催化碘化硫代乙酰膽堿水解,其生成物碘化硫代膽堿與巰基顯色劑5,5-二硫代-雙(2-硝基苯甲酸(DTNB反應(yīng),生成黃色產(chǎn)物5-巰基-2-硝基苯甲酸(5-TNBA,反應(yīng)方程式如

3、下圖所示。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定酶促反應(yīng)初速度的方法計(jì)算酶活性。方法是酶促反應(yīng)開始后每30s測(cè)定次吸光度,連續(xù)測(cè)定3min。計(jì)算吸光度變化的平均值A(chǔ)/min。根據(jù)波爾定律:A=CL,每分鐘產(chǎn)物濃度的變化值C=A/L。已知5-TNBA的值為1.96×105 L/molcm,比色杯的光程長(zhǎng)1 cm,因此,C(mol/L =A/(1.96×105。根據(jù)酶活性單位的定義:25 ,最適pH值和最適底物濃度下,酶分鐘催化1mol底物所需的酶量為1 IU,酶活性=C×106 IU。酶的比活=酶活性/總蛋白濃度。2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 試劑和儀器活鯉魚。硫代-雙(2-硝基苯甲酸5 mmol/

4、L 碘化硫代乙酰膽堿100 mmol/L5,5-二Tris-HCl緩沖溶液(pH7.4,20mmol/L,含0.1% Triton X-100和0.05mol/L NaCl磷酸鹽緩沖液(pH7.4,20mmol/L考馬斯亮藍(lán)G-250試劑冷凍高速離心機(jī),分光光度計(jì),組織勻漿器。2. 2 乙酰膽堿脂酶的制備取1條活鯉魚,剪開頭骨,再用鑷子將整個(gè)腦組織取出,以濾紙吸去血絲,并除去非腦組織,放入表面皿中稱重。然后用含0.1% Triton X-100和0.05mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖溶液(pH7.4,20mmol/L 冰浴條件下勻漿,勻漿比(質(zhì)量體積比為1:4制成勻漿液。在4 離心

5、(10000r/min30min,得離心上清液,即為粗酶提取液,記錄體積并在4下保存。參照Bradford(1976考馬斯亮藍(lán)G-250法。用牛血清白蛋白(BSA作為標(biāo)準(zhǔn),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1ml待測(cè)酶液(調(diào)整蛋白質(zhì)含量20-100g,加5ml考馬斯亮藍(lán)G-250染色液,混合均勻后30min 內(nèi)測(cè)OD值。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶液中蛋白質(zhì)的含量。取3m1磷酸緩沖溶液和50l酶提取液加入10ml試管內(nèi),于35保溫10min。依次加入20l碘化硫代乙酰膽堿(100mmol/L,20l DTNB溶液(5mmol/L,混合均勻。在波長(zhǎng)412nm處用1cm比色皿比色。測(cè)定時(shí)每隔30s讀數(shù),連續(xù)測(cè)定3min。3 數(shù)

6、據(jù)記錄3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的配制:精確稱取牛血清白蛋白500mg,用蒸餾水定容至50mL,配成10.mg/mol的溶液1。取1ml溶液1,用去離子水定容至10ml,配成1.00mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液?？捡R斯亮藍(lán)G-250溶液的配制:精確稱取考馬斯亮藍(lán)G-250100mg,溶于50mL95%的乙醇,再加入120mL85%的磷酸,稀釋定容至1000mL備用。3.2 未知樣品中蛋白質(zhì)吸光度值的測(cè)定實(shí)驗(yàn)中加入50ul碘化硫代乙酰膽堿,以確保使乙酰膽堿脂酶一直能發(fā)揮最大酶活,在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)讀數(shù)如下:時(shí)間點(diǎn)0S30S60S90S120S150S180S3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定在試管中分別精確移取牛

7、血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0、70、80、90、100、110、120uL,加蒸餾水至1.0mL,然后在各支試管中分別加入4.0mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,搖勻。 在595nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度 4數(shù)據(jù)處理4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 回歸方程為Y=30.779X- 0.0094 (R2=0.9989。4.2酶活測(cè)定建立吸光度-時(shí)間曲線 回歸方程為y=0.001564x+0.0355 (R2=0.99944.3酶活計(jì)算由吸光度-時(shí)間曲線可知每秒吸光度變化0.001564,由蛋白質(zhì)濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線可知,每秒蛋白質(zhì)濃度增加3.562x104結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)測(cè)得魚腦中乙酰膽堿脂酶活為3.562x1045.注意事項(xiàng)1 實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)盡