乳腺癌及癌旁組織中PTEN基因5’CpG島甲基化狀態(tài)研究

1、乳腺癌及癌旁組織中PTEN基因5CpG島甲基化狀態(tài)研究 作者：趙英芳沈淑萍蔣劍英耿虹郭建國謝立平【摘要】 目的：檢測乳腺癌及癌旁組織中PTEN 基因5端CpG島啟動子區(qū)域的甲基化狀況。方法：采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(Methylation-specific PCR,MSP)方法對乳腺癌及癌旁組織中PTEN基因5端CpG島啟動子區(qū)域甲基化狀況進(jìn)行研究。結(jié)果：乳腺腫瘤組織中PTEN基因甲基化率為31.5 %(29/92)，顯著高于癌旁組織和正常組織(P<0.05)，而癌旁組織和正常乳腺組織中甲基化率均比較低，分別為8.3 %(2/24)、6.2 %(1/16)，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意

2、義(P>0.05);PTEN基因甲基化與腫瘤組織學(xué)類型、年齡及腫瘤大小均無相關(guān)性，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PTEN基因甲基化率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。結(jié)論：PTEN基因5端CpG島啟動子區(qū)域甲基化可能是散發(fā)性乳腺癌PTEN基因失活的主要機(jī)制，參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程;PTEN基因甲基化可能是乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的晚期事件，提示可以考慮將PTEN基因甲基化作為評價乳腺癌腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的分子標(biāo)記。 【關(guān)鍵詞】 乳腺癌/病理學(xué);PTEN 基因;甲基化AbstractObjective: To investigate the promoter m

3、ethylation of gene PTEN5' in breast carcinomas and in tissues adjacent to breast cancer. Methods: 92 specimens of breast carcinomas, 24 specimens of tissues adjacent to breast cancer and 16 normal specimens of breast tissues were examined for promoter methylation of PTEN5' with methylation-s

4、pecific PCR method. Results: Methylation of PTEN was found in 31.5 % (29/92) of the total breast carcinoma specimens, while in 8.3 %(2/24)of total specimens of tissues adjacent to breast cancer and in 6.2 %(1/16) of normal specimens of breast tissues respectively. In addition, promoter methylation o

5、f PTEN5' was significantly associated with lymph node metastasis (P<0.05), but was not associated with differentiation status, tumor size and age. Conclusion: Promoter methylation of PTEN5' is an important mechanism for its inactivation. Methylation of PTEN is a common event in breast

6、 carcinomas and may play an important role in the carcinogenesis and progression of breast carcinomas.Key wordsBreast cancer/pathol; Genes PTEN; DNA MethylationPTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)基因位于人染色體10q23.31，是第一個具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因2，其主要功能包括參與胚胎的正常發(fā)育3、通過G1期阻滯或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制細(xì)

7、胞生長4、抑制端粒酶活性5以及抑制細(xì)胞遷移、鋪展和局部粘附6。人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與該基因的突變失活密切相關(guān)。PTEN基因的突變包括胚系突變和體細(xì)胞突變。胚系PTEN基因的突變可以引發(fā)3種罕見的常染色體顯性遺傳腫瘤綜合征：Cowden病、Lhermitte-Duclos病和Bannayan-Zonana綜合征。這些綜合征在臨床上主要表現(xiàn)為形成多發(fā)性錯構(gòu)瘤，且易伴發(fā)惡性腫瘤，女性病人則有30 %50 %發(fā)生乳腺癌。體細(xì)胞突變見于約40 %的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及30 %的前列腺癌，而只有在極少數(shù)原發(fā)散發(fā)性乳腺癌中可檢測到PTEN 基因突變或(和)染色體缺失。基因失活除了突變和缺失外，5端CpG島

8、甲基化也是一個非常重要的途徑7-9。目前關(guān)于PTEN基因甲基化與乳腺癌關(guān)系的研究在國外已有報道10，國內(nèi)還未見報道。本研究檢測了原發(fā)散發(fā)性乳腺癌及其癌旁組織中PTEN基因甲基化狀態(tài)，分析PTEN 基因甲基化在癌組織與癌旁組織中的差異以及與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系，旨在探討PTEN基因甲基化在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用，希望能為乳腺癌的臨床治療和跟蹤腫瘤預(yù)后方面提供一些參考。1材料與方法1.1材料乳腺癌、癌旁組織標(biāo)本來自包頭醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室在2003-2007年間乳腺癌根治術(shù)或乳腺癌改良根治術(shù)標(biāo)本，共92例，年齡3374歲，平均為48.6歲;乳腺癌組織學(xué)分型：導(dǎo)管內(nèi)癌4例;導(dǎo)管浸潤癌88例。

9、24例癌旁組織選擇遠(yuǎn)離癌組織的乳腺組織，鏡下無腫瘤組織，但可見導(dǎo)管上皮單純增生或不典型增生，部分病例可見大汗腺樣化生，年齡范圍在3871歲，平均為50.9歲。16例正常乳腺組織(對照)無大汗腺樣化生、異型增生等病變，年齡范圍在3867歲，平均年齡為50.1歲。1.2甲基化特異性PCR方法(1)DNA提取方法：每個蠟塊切4 m厚蠟片30張，按常規(guī)蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提法提取癌組織、癌旁組織和正常組織基因組DNA，三蒸水溶解后，用紫外分光光度儀測量DNA濃度。DNA于-20 保存。所用蛋白酶K為美國Sigma公司產(chǎn)品。酚/氯仿/異戊醇試劑(體積比為25241)為Invitrogen公司產(chǎn)品。(

10、2)甲基化特異性PCR(MSP)方法：每個樣本取5 g DNA用0.2 M NaOH變性處理，于10 mM氫醌(Sigma公司)和3 M亞硫酸氫鈉(Sigma公司)中50 反應(yīng)24 h,然后，用Wizard DNA純化試劑盒(promega公司)純化經(jīng)亞硫酸氫鈉處理的DNA。DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后，DNA中的C轉(zhuǎn)變?yōu)閁，而如果被檢測基因已經(jīng)發(fā)生CpG島甲基化，則不能發(fā)生這種改變，設(shè)計甲基化特異性PCR引物和非甲基化特異性PCR引物，就可檢測出該基因是否發(fā)生甲基化。我們根據(jù)文獻(xiàn)報道10，選擇PTEN基因啟動子區(qū)域甲基化熱點合成兩對引物，一對為檢測甲基化PTEN基因特異性PCR引物，另一對為檢測

11、非甲基化PTEN基因特異性PCR引物。引物序列見表1。PCR擴(kuò)增體系為12.5 L，包括1×PCR反應(yīng)緩沖液，0.2 mmol/L dNTP，0.2 mol/L上下游引物，2.5 mmol/L MgCl2,0.05 U HotStar Taq酶，100250 ng經(jīng)亞硫酸鹽處理的DNA模板。PCR擴(kuò)增試劑均為Qiagen公司產(chǎn)品。PCR的陰性對照用三蒸水取代DNA模板進(jìn)行PCR。表1甲基化特異性PCR(MSP)引物引物*正義序列( 5'-3')反義序列( 5'-3')參考文獻(xiàn)PTEN-UTTTTGAGGTGTTTGGGTTTTTGGTACACAATCA

12、CATCCCAACACCAKhan et alPTEN -MTTTTTTTTCGGTTTTTCGAGGCCAATCGCGTCCCAACGCCGKhan et al*注：U為未甲基化特定引物;M為甲基化特定引物1.3 統(tǒng)計分析方法應(yīng)用SPSS 13.0軟件行2檢驗、Fisher確切概率法。2結(jié)果2.1乳腺癌及癌旁組織中PTEN基因甲基化狀況92例乳腺癌組織中，29例腫瘤檢測到PTEN基因甲基化，甲基化率為31.5 %(29/92)，癌組織PTEN甲基化率顯著高于癌旁組織和正常組織(為排除樣本量差異帶來的誤差，采取先加權(quán)，后檢驗。Fisher確切概率法P=0.021、P=0.038)。而24例癌旁

13、組織只有2例(2/24)、16例正常乳腺組織只有1例檢測到PTEN 基因甲基化，且兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。圖1顯示檢測正常組織、癌旁組織和腫瘤組織PTEN 基因甲基化的結(jié)果。*為100 bp DNA分子量標(biāo)記物，TABC為癌旁組織，U表示用非甲基化特異引物進(jìn)行PCR，M表示用甲基化特異引物進(jìn)行PCR。A為用PTEN-U和PTEN-M PCR引物分別檢測正常組織、癌旁組織和腫瘤組織中PTEN非甲基化的基因拷貝與甲基化的基因拷貝2.2PTEN基因甲基化和臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性PTEN基因甲基化率顯著高于癌旁組織，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.01)，淋巴結(jié)

14、轉(zhuǎn)移組PTEN基因甲基化率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,但PTEN基因甲基化與腫瘤組織學(xué)分型、年齡、腫瘤大小均不相關(guān)。見表2。表2PTEN基因甲基化狀態(tài)與患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系3討論PTEN基因是第一個具有磷酸酶功能的腫瘤抑制基因，其在腫瘤中的突變頻率與著名的p53基因相當(dāng)11，但國外研究發(fā)現(xiàn)散發(fā)性乳腺癌中PTEN基因點突變僅為5%左右12，且主要發(fā)生在晚期和轉(zhuǎn)移癌中。此外，研究還發(fā)現(xiàn)乳腺特異性PTEN缺失會導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞增生、分化，乳腺小葉腺泡早熟，導(dǎo)管上皮細(xì)胞局灶性增生、發(fā)育不良，這種組織學(xué)改變有如Cowden Disease的乳腺表型13。而Rose等14人研究表明散發(fā)性乳腺癌中PTEN基

15、因突變或(和)缺失所占的比例不大(6 %)?；蚴Щ畛送蛔儭⑷笔У脑蛲?，異常甲基化是其又一重要機(jī)制。我們檢測了92例乳腺癌組織中的PTEN甲基化狀況，發(fā)現(xiàn)29例發(fā)生甲基化，甲基化率為31.5 %(29/92)，顯著高于正常組織，提示PTEN基因5CpG島甲基化是乳腺癌患者常見的分子事件，可能是散發(fā)性乳腺癌PTEN基因失活的主要機(jī)制，參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。國外研究報道散發(fā)性乳腺癌中PTEN基因甲基化率為30 %48 %，顯著高于正常組織10,15，與我們的結(jié)論一致。而24例癌旁組織只有2例(2/24)檢測到PTEN 基因甲基化，顯著低于癌組織PTEN基因甲基化率，國內(nèi)外尚未見有類似報道

16、。研究結(jié)果表明PTEN基因甲基化是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的一種信號，但卻是晚期事件，提示PTEN基因甲基化可能不能夠作為早期預(yù)測乳腺癌發(fā)生風(fēng)險的分子標(biāo)記。我們進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PTEN基因甲基化與患者年齡、腫瘤大小以及組織學(xué)類型無相關(guān)性，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，發(fā)生轉(zhuǎn)移的病例大多是PTEN基因發(fā)生甲基化的病例，進(jìn)一步證實了PTEN基因甲基化和腫瘤的進(jìn)展相關(guān)，提示可以考慮將PTEN基因5CpG島甲基化作為評價腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的分子標(biāo)記，也可以為腫瘤預(yù)后提供參考。有趣的是，正如我們所預(yù)期的，在能檢測到PTEN基因甲基化的部分腫瘤組織中也能檢測到PTEN基因的未甲基化，可能是由于腫瘤組織中混有癌旁組織、或基因發(fā)生

17、不完全甲基化所致。以前我們曾在胃癌組織基因甲基化研究中也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果16。值得注意的是，從理論上講正常組織中不應(yīng)該檢測到PTEN基因甲基化，但我們在極少數(shù)癌旁組織和正常乳腺組織也檢測到了PTEN基因甲基化，可能是因為PTEN基因發(fā)生了部分甲基化，但還不足以引起基因失活和腫瘤發(fā)生。Khan等10也認(rèn)為基因5CpG島甲基化密度逐漸增加是一個動態(tài)過程，當(dāng)其增加到一定程度就會導(dǎo)致基因失活，而對于抑癌基因來講，可能發(fā)生腫瘤。由于PTEN是近十幾年新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，又具有磷酸酶功能，是否與其它抑癌基因能夠相互作用，或者是否在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同時段分別起不同的作用，還有待于進(jìn)一步研究探討。【參考文獻(xiàn)】 1

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